HSP70蛋白抑制剂

hsp70蛋白抑制剂
技术领域
1.本发明涉及hsp70蛋白抑制剂及其用于癌症治疗的用途。


背景技术：

2.细胞凋亡是在用抗癌剂治疗后，常在癌细胞中观察到的细胞死亡过程。在哺乳动物中，细胞凋亡涉及线粒体蛋白，诸如细胞色素c(liux等，cell.1996；86:147-157)和细胞凋亡诱导因子(aif)(ferri kf等，nat cell biol.2001；3:e255-263)。这些分子可以从线粒体膜间隙释放到受压或受伤细胞的细胞质中。一旦进入细胞质，细胞色素c与适应分子凋亡蛋白酶激活因子-1(apaf-1)相互作用来触发它的atp依赖性寡聚化(hu y等，embo j.1999；18:3586-3595；li p等，cell.1997；91:479-489)，其允许凋亡体复合物形成(zou h等，j biol chem.1999；274:11549-11556；saleh a等，j biol chem.1999；274:17941-17945)。然后，caspase-9被凋亡小体激活，启动导致凋亡的半胱天冬酶级联反应(li p等，cell.1997；91:479-489)。与细胞色素c不同，aif直接迁移到细胞核以诱导dna断裂和半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡(daugas e等，faseb j.2000；14:729-739；susin sa等，nature.1999；397:441-446)。
3.诱导型热休克蛋白70(hsp70)是一种进化上保守的蛋白质，其表达增强了细胞在各种致命条件下存活的能力。它是一种atp依赖性分子伴侣蛋白，其有助于新合成多肽的折叠、多蛋白复合物的组装和蛋白质跨细胞膜的转运(beckmann rp等，science.1990；248:850-854；murakami h等，j cell biol.1988；107:2051-2057；shi y等，mol cell biol.1992；12:2186-2192)。
4.在正常细胞生长下，hsp70不表达或很少表达。相反，在压力条件下，hsp70表达被瞬时诱导。升高的hsp70水平使细胞能够在压力情况下生存。hsp70的部分保护功能与其抗凋亡特性有关。hsp70是一种强大的抗凋亡蛋白，其能够通过其与apaf-1的相互作用阻断半胱天冬酶依赖性细胞凋亡，并通过其与aif的结合阻断半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡。hsp70还能够阻止组织蛋白酶从溶酶体中释放，从而也阻止细胞死亡。通过确认hsp70的重要保护功能，缺乏hsp70.1和hsp70.3(编码诱导型hsp70的两个基因)的细胞对广泛的致死刺激诱导的细胞凋亡高度敏感(schmitt e等，cancer res.2003；63:8233-8240)。
5.hsp70通常在来自不同来源的人类肿瘤样品中组成型表达，并且其表达可能在化疗后进一步增加(parcellier a等，biochem biophys res commun.2003；304:505-512)。hsp70的这种过表达是癌细胞存活所必需的。人类癌细胞中过表达的hsp70与转移、预后不良和对化学疗法或放射疗法的抗性有关(conroy se等，br j cancer.1996；74:717-721；fuller kj等，eur j cancer.1994；30a:1884-1891；brondani da rocha a等，int joncol.2004；25:777-785；vargas-roig lm等，int j cancer.1998；79:468-475；nanbu k等,cancer detect prev.1998；22:549-555)。本发明人和其他组织先前已经表明，通过反义构建或sirna下调hsp70，降低了啮齿动物模型中的癌细胞致瘤性(gurbuxani s等,oncogene.2001；20:7478-7485；nylandsted j等，proc natl acad sci usa.2000；97:
7871-7876)。
6.抑制并中和细胞质中的hsp70的源自aif、add70(hsp70的aif衍生诱饵)的构建体，显示出可使癌细胞对抗癌药物(诸如顺铂或依托泊苷)敏感(schmitt e等，cancer res.2003；63:8233-8240)。在体内，小鼠癌症模型中的add70治疗减少肿瘤生长，并且甚至诱导肿瘤退化。在动物中单次注射顺铂会增加这些效果(schmitt e等，cancer res.2006；66:4191-4197)。
7.但是，add70太大而不能用作生物治疗分子。因此，仍然需要开发能够抑制hsp70的小分子来治疗肿瘤。


技术实现要素：

8.发明人表征了特异性阻断hsp70伴侣蛋白活性并诱导肿瘤退化的不同适配体。肿瘤退化与肿瘤细胞凋亡的增加有关，并且令人惊讶的是，浸润肿瘤的细胞毒性(ros产生者)巨噬细胞的数量显著增加。因此，本发明人开发的特异性靶向hsp70的分子可以构成新型的抗癌免疫治疗分子。
9.本发明的第一方面涉及式(i)或(ii)的化合物，其用于通过抑制hsp70蛋白活性从而诱导肿瘤细胞凋亡并重新训练巨噬细胞来治疗患者的肿瘤，优选实体瘤，
[0010][0011]
其中r1代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，
[0012]
r2代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，
[0013]
r3代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，
[0014]
r4代表c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，并且
[0015]
r5代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基；
[0016][0017]
其中r6代表杂环，优选哌啶基，
[0018]
r7代表氢原子或卤原子，
[0019]
r8代表氢原子或卤原子，
[0020]
r9代表氢原子或卤原子，
[0021]r10
代表氢原子或卤原子，
[0022]r11
代表氢原子或卤原子，并且
[0023]r12
代表氢原子或卤原子。
[0024]
本发明的第二方面涉及式(i)或(ii)的化合物与脂蛋白，优选高密度脂蛋白(hdl)之间形成的复合物，
[0025][0026]
其中r1代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，
[0027]
r2代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，
[0028]
r3代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，
[0029]
r4代表c1-c8烷基，优选c1-c3烷基，并且
[0030]
r5代表氢原子、卤素原子、c1-c8烷基，优选c1-c3烷基；
[0031][0032]
其中r6代表杂环，优选哌啶基，
[0033]
r7代表氢原子或卤原子，
[0034]
r8代表氢原子或卤原子，
[0035]
r9代表氢原子或卤原子，
[0036]r10
代表氢原子或卤原子，
[0037]r11
代表氢原子或卤原子，并且
[0038]r12
代表氢原子或卤原子。
[0039]
发明详述
[0040]
发明人表征了特异性阻断hsp70伴侣蛋白活性并诱导肿瘤退化的不同适配体。
[0041]
本发明的第一方面涉及式(i)或(ii)的化合物，其用于通过抑制hsp70蛋白活性从而诱导肿瘤细胞凋亡并重新训练巨噬细胞来治疗患者的肿瘤，优选实体瘤。
[0042]
本发明中使用的术语“卤原子”是指氟、氯、溴或碘原子。
[0043]
本发明中使用的术语“杂环”是指吡啶基、哌啶基，优选哌啶基。
[0044]
化合物
[0045]
式(i)的化合物
[0046]
本发明的式(i)的化合物由式(i)表示
[0047][0048]
其中r1代表氢原子、卤素原子、c
1-c8烷基，优选c
1-c3烷基，
[0049]
r2代表氢原子、卤素原子、c
1-c8烷基，优选c
1-c3烷基，
[0050]
r3代表氢原子、卤素原子、c
1-c8烷基，优选c
1-c3烷基，
[0051]
r4代表c
1-c8烷基，优选c
1-c3烷基，并且
[0052]
r5代表氢原子、卤素原子、c
1-c8烷基，优选c
1-c3烷基。
[0053]
在具体实施方案中，式(i)的化合物选自下组：
[0054]
式(b)的化合物和
[0055]
式(c)的化合物
[0056]
式(ii)的化合物
[0057]
本发明的式(ii)的化合物由式(ii)表示
[0058][0059]
其中r6代表杂环，优选哌啶基，
[0060]
r7代表氢原子或卤原子，
[0061]
r8代表氢原子或卤原子，
[0062]
r9代表氢原子或卤原子，
[0063]r10
代表氢原子或卤原子，
[0064]r11
代表氢原子或卤原子，并且
[0065]r12
代表氢原子或卤原子。
[0066]
在具体实施方案中，式(ii)的化合物是式(a)的化合物
[0067]
[0068]
合成
[0069]
式(i)和式(ii)的化合物是可商购获得的。
[0070]
式(i)的化合物可根据以下方案(方案1)合成：
[0071][0072]
方案1
[0073]
向溶有苯并三唑(0.01mol)和吡啶(0.016mol)的无水甲苯(12ml)的冰冷溶液中滴加溶有2-乙氧基-5-甲基苯-1-磺酰氯(cas:187471-28-9)(0.012mol)的甲苯(3ml)。然后，将混合物在室温下搅拌过夜。添加acoet(15ml)和h2o(10ml)。分离有机层，依次用水和盐水洗涤，用无水mgso4干燥。真空除去溶剂得到粗品，将其通过快速色谱法纯化。
[0074]
本领域技术人员将能够用众所周知的步骤调整该方法以合成式(i)所涵盖的所有化合物。
[0075]
复合物
[0076]
为了增加溶解度并有利于细胞摄取，可以将如前所述的式(i)或(ii)的化合物与脂蛋白复合。
[0077]
因此，本发明的第二方面涉及如前所述的式(i)或(ii)的化合物与脂蛋白之间形成的复合物。
[0078]“脂蛋白”是指具有非极性脂质(主要是胆固醇酯和甘油三酯)的中心疏水内核的复杂颗粒。该疏水内核被由磷脂、游离胆固醇和载脂蛋白组成的亲水层包围。血浆脂蛋白根据大小、脂质组成和载脂蛋白组成被分为几类(乳糜微粒、乳糜微粒残留物、极低密度脂蛋白(vldl)、中密度脂蛋白(idl)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)和lp(a))。
[0079]
特别地，脂蛋白可以是本领域技术人员熟知的高密度脂蛋白(hdl)或低密度脂蛋白(ldl)(introduction to lipids and lipoproteins,kenneth r feingold md,car grunfeld,phd,ncbi bookshelf)。
[0080]“高密度脂蛋白”(hdl)是脂蛋白中最小的(6-12.5nm)(mw175-500kd)，且密度最大(约1.12g/ml)。hdl含有几种类型的载脂蛋白，主要包括apo-ai、ii&iv，apo-ci、ii和iii，apo-d和apo-e。hdl含有大约35-55％的蛋白质，3-15％的甘油三酯，24-46％的磷脂，15-30％的胆固醇酯和2-10％的胆固醇。
[0081]“低密度脂蛋白”(ldl)是富含胆固醇的脂蛋白，其密度介于1.019和1.063g/ml之间，直径介于18和25nm之间。ldl包含载脂蛋白b-100。
[0082]
ldl可以是天然的ldl、非乙酰化和非羟基化的或修饰的ldl、羟基化和乙酰化的ldl。
[0083]
因此，本发明涉及如前所述的式(i)或(ii)的化合物与高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)或修饰的低密度脂蛋白(ldl)之间形成的复合物，诸如氧化的ldl或乙酰化的ldl。
[0084]
根据本发明，“修饰的ldl”是指氧化或乙酰化的低密度脂蛋白(ldl)。本领域技术
人员已知修饰的低密度脂蛋白(ldl)会被巨噬细胞的清道夫受体识别。典型地，它们可以通过在硫酸铜或自由基产生剂(氧化ldl)存在下孵育获得或通过乙酰化(乙酰化ldl)获得(参见a modification method for isolation and acetylation of low density lipoprotein of human plasma by density discontinuons gradient ultracentrifugation,j.z.reza et al,journal of biological sciences 10(8):785-789,2010issn 1727-3048)。
[0085]
如前所述的式(i)或(ii)的化合物与脂蛋白(特别是hdl的复合物允许其被肿瘤相关巨噬细胞摄取，从而诱导强烈的氧化迸发和先天性抗癌免疫响应。因此，在优选实施方案中，本发明涉及如前所述的式(i)或(ii)的化合物与hdl之间形成的复合物。
[0086]
典型地，脂蛋白从生物样品中获得，优选从供体的血浆中获得。特别地，所述样品是正常或健康血浆，优选正常血脂血浆。适合用来获得，特别是分离和/或纯化不同部分的脂蛋白的方法是本领域技术人员熟知的(参见schumaker&puppioe，1986)。示例性分离方法包括但不限于超速离心、peg沉淀、肝素mncl2沉淀、磷钨酸钠沉淀、硫酸葡聚糖沉淀、凝胶过滤、快速蛋白质液相色谱(fplc)和免疫亲和捕获。很容易获得这些和其他hdl分离方法的方案。因此，例如，wieve和smith，1985描述了示例性但非限制性方案，其用于通过peg沉淀、肝素mncl2沉淀、磷钨酸钠沉淀和硫酸葡聚糖沉淀分离hdl。
[0087]
典型地，用于制备与引入到脂蛋白中的如前所述的式(i)或(ii)的化合物形成的复合物的方法包括以下步骤：使如前所述的式(i)或(ii)的化合物与脂蛋白接触，并通过透析纯化所述复合物。然后，可以通过质谱法确定所述复合物的浓度。
[0088]
如前所述的复合物还可以包含铂化合物，优选选自下组：顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、四铂(tetraplatin)、异丙铂(iproplatin)、沙铂(satraplatin)、奈达铂(nedaplastin)、洛铂(laboplatin)、吡铂(picoplatin)或prolindac(polymere-platinate-dach ap5346)，优选顺铂和奥沙利铂。
[0089]
根据本发明，“prolindac”是指与羟丙基甲基丙烯酰胺(hpma)共聚物偶联的二氨基环己烷(dach)-铂(pt)络合物(nci药物词典，美国国家癌症研究所)。
[0090]
本发明还涉及如先前定义的复合物，其用作药物。
[0091]
方法
[0092]
发明人表明，式(i)的化合物和式(ii)的化合物能够抑制hsp70活性。因此，另一方面，本发明还涉及上述式(i)的化合物、式(ii)的化合物或复合物在体外抑制hsp70活性并诱导细胞凋亡中的非治疗用途。
[0093]
本发明还涉及在hsp70蛋白存在的情况下，通过使用以下用于抑制hsp70蛋白的方法：
[0094]-如先前定义的式(i)的化合物，
[0095]-如先前定义的式(ii)的化合物，或
[0096]-如先前定义的复合体。
[0097]
药物组合物
[0098]
本发明还提供药物组合物，其包含作为活性成分的如先前定义的式(i)或(ii)化合物或复合物和药学上可接受的赋形剂。
[0099]
本发明中的术语“药物组合物”是指包含如先前定义的式(i)的化合物或式(ii)的
化合物或复合物和至少一种药学上可接受的赋形剂的任何组合物。
[0100]
术语“药学上可接受的赋形剂”在本文中应理解为载体介质，其不干扰活性成分的生物活性的有效性，并且其在施用浓度下对宿主没有过度毒性。根据药物形式和所需的施用方法，所述赋形剂选自本领域技术人员已知的常用赋形剂。
[0101]
可以使用标准药物制剂化学和方法进行合适组合物的配制，所有这些对于相当熟练的技术人员来说都是容易获得的。例如，式(i)或(ii)的化合物或如先前定义的复合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体组合。辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质、还原剂等，可以存在于赋形剂或载体中。合适的还原剂包括半胱氨酸、硫代甘油、硫还原素、谷胱甘肽等。赋形剂、载体和辅助物质通常是不会在接受组合物的个体中诱导免疫响应的药剂，并且其可以在没有过度毒性的情况下施用。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，诸如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油、硫代甘油和乙醇。其中还可以包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。雷明顿制药学(mack pub.co.,n.j.1991)中对药学上可接受的赋形剂、载体和辅助物质进行了全面讨论。
[0102]
现有技术已知hsp70蛋白与癌症有关。发明人已经发现并证明了如先前定义的化合物对hsp70蛋白的抑制活性。
[0103]
因此，应承认作为hsp70蛋白抑制剂的如先前定义的式(i)或式(ii)的化合物、如先前定义的复合物或药物组合物可用作药物，优选用作用于抑制hsp70蛋白活性的治疗剂，特别是用于治疗患者的癌症。
[0104]
此外，应承认作为hsp70蛋白抑制剂的如先前定义的式(i)或式(ii)的化合物、如先前定义的复合物或药物组合物可用作药物，优选用作用于抑制hsp70蛋白活性的治疗剂，特别是用于治疗患者的肿瘤。
[0105]
因此，本发明还涉及如先前定义的式(i)或(ii)的化合物、复合物或药物组合物，其用于通过抑制hsp70蛋白活性从而诱导肿瘤细胞凋亡并重新训练巨噬细胞来治疗患者的肿瘤，优选实体瘤。
[0106]
本发明还涉及治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的如先前定义的式(i)或(ii)的化合物或复合物，或包含所述化合物或所述复合物的药物组合物。
[0107]
本发明还涉及治疗患者的肿瘤，优选实体瘤的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的如前定义的式(i)或(ii)的化合物或复合物，或包含所述化合物或所述复合物的药物组合物。
[0108]
如本文所用，本文可互换使用的术语“受试者”和“患者”是指动物界的任何成员，优选哺乳动物，包括人、猪、黑猩猩、狗、猫、牛、小鼠、兔或大鼠。更优选地，受试者是人，包括例如患有肿瘤的受试者。
[0109]
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(therapy)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指旨在改善患者健康状况的任何行为，诸如疾病的治疗、预防、预防措施和延缓。在某些实施方案中，该术语是指疾病或与疾病相关的症状的改善或根除。在其他实施方案中，该术语是指最小化疾病的传播或恶化，所述传播或恶化由向患有此类疾病的受试者施用一种或多种治疗剂引起。特别地，关于癌症的治疗，术语“治疗”可以指抑制肿瘤的生长或减小肿瘤的大小。
[0110]
在具体实施方案中，患者患有癌症，特别是选自下组的实体癌：肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌(例如肺周围癌、远端胆管癌、肝内胆管癌)、膀胱癌、骨癌(例如成骨细胞瘤、骨软骨瘤、血管瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、肉瘤，诸如脂肪肉瘤和软组织肉瘤、脑和中枢神经系统癌症(例如脑膜瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经节胶质瘤、生殖细胞瘤、颅咽管瘤)、乳腺癌(例如导管原位癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位小叶癌)、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌(例如子宫内膜腺癌、腺棘皮瘤、乳头状浆液性腺癌、透明细胞癌)、食道癌、胆囊癌(例如粘液性腺癌、小细胞癌)、胃肠道类癌(例如绒癌、绒毛膜腺瘤)、肾癌(例如肾细胞癌)、喉和下咽癌、肝癌、肝腺瘤、局灶性结节性增生、肝细胞癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、鼻腔和鼻旁窦癌(例如感觉神经母细胞瘤、中线肉芽肿)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(例如胚胎性横纹肌肉瘤、肺泡横纹肌肉瘤、多形性横纹肌肉瘤)、唾液腺癌、皮肤癌(例如黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌)、胃癌、睾丸癌(例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤生殖细胞癌)、胸腺癌、甲状腺癌(例如滤泡癌、间变性癌、低分化癌、甲状腺髓样癌、甲状腺淋巴瘤)、阴道癌、外阴癌和子宫癌(例如子宫平滑肌肉瘤)。
[0111]“治疗有效量”意指向受试者施用的如前所述的式(i)或(ii)的化合物或复合物或药物组合物的量，该量足以抑制hsp70蛋白活性并诱导肿瘤退化。
[0112]
如前所述的式(i)的化合物、式(ii)的化合物、复合物或药物组合物可以通过任何合适的途径施用，包括局部施用或全身施用，诸如肠内施用或肠胃外施用。如前所述的式(i)的化合物、式(ii)的化合物、复合物或药物组合物可以通过皮内、皮下、经皮、肌内、动脉内、腹膜内、关节内、骨内或其他适当的施用途径。在优选实施方案中，如前所述的式(i)的化合物、式(ii)的化合物、复合物或药物组合物通过静脉内输注或肌内施用途径施用。
[0113]
如前所述的式(i)或式(ii)的化合物、复合物或药物组合物可以以一个或多个剂量施用。在另一个实施方案中，所述有效量的如前所述的式(i)或式(ii)的化合物、复合物或药物组合物作为单剂量施用。在另一个实施方案中，所述有效量的如前所述的式(i)或式(ii)的化合物、复合物或药物组合物在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用时机在主治医师的判断范围内并且取决于受试者的临床状况。必须考虑患者的生理数据(例如年龄、体型和体重)、施用途径和待治疗的疾病，以确定合适的剂量。
[0114]
根据本发明使用的式(i)或式(ii)的化合物、复合物或药物组合物可单独使用或与一种或多种其他抗癌剂、手术、免疫疗法和/或放射疗法组合使用。如前所述的化合物、复合物和抗癌剂可以同时或依次施用。
[0115]
根据本发明，免疫疗法是在患者体内刺激宿主免疫系统对抗恶性过程并破坏癌细胞的治疗。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为治疗的效应子，或者它也可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。该抗体还可以与药物或毒素(化疗药物、放射性核素、蓖麻毒素a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。例如，免疫效应子可以是与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(mabs)。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。免疫效应子也可以是免疫刺激分
子，诸如il-2、il-4、il-12、gm-csf、γ-ifn、趋化因子，例如mip-1、mcp-1、il-8、和生长因子，诸如flt3配体、或免疫检查点抑制剂，诸如抗pd-1、抗pdl-1或抗ctla-4抗体。免疫疗法还可以包括放射免疫疗法、疫苗等。
[0116]
抗癌剂优选是化学治疗剂，例如：(i)dna复制抑制剂，例如dna结合剂，特别是烷化剂或嵌入药物，(ii)抗代谢剂，诸如dna聚合酶抑制剂或拓扑异构酶i或ii抑制剂，或(iii)抗有丝分裂剂，诸如生物碱。化疗剂的此类实例包括但不限于：5-fu、奥沙利铂、顺铂、卡铂、伊立替康、西妥昔单抗、厄洛替尼、多西他赛和紫杉醇。
[0117]
如前所述的式(i)或式(ii)的化合物或复合物可用作单独的活性成分或与一种或多种其他活性物质联用。肽和所述一种或多种活性物质可以同时或依次施用。所述活性物质优选为抗癌剂。
[0118]
本发明还涉及联合产品(“试剂盒的部分”)，其首先包含如前所述的式(i)或(ii)的化合物、复合物或药物组合物以及本领域熟知的另一种抗癌剂，用于在治疗癌症中同时联合使用或时移(time-shifted)使用，如上文所述。
[0119]
本发明涉及如前所述的化合物、复合物或药物组合物，其包含所述化合物和抗癌剂作为联合制剂，用于同时、单独或依次用于治疗受试者的癌症。
[0120]
试剂盒
[0121]
本发明还涉及包含如上所述的式(i)或式(ii)的化合物、复合物或药物组合物的试剂盒。
[0122]
优选地，本发明还涉及包含如上所述的式(i)或(ii)的化合物、复合物或药物组合物以及如上定义的抗癌剂或铂化合物的试剂盒。
[0123]
在一个实施方案中，该试剂盒还包含用于将如前所定义的式(i)或式(ii)的化合物、复合物、药物组合物施用于受试者的装置。
[0124]
在一个实施方案中，该试剂盒还包括用于将如前所定义的式(i)或式(ii)的化合物、复合物、药物组合物施用于受试者的说明书。
[0125]
在一个实施方案中，该试剂盒包含另外的治疗剂，特别是抗癌剂。在一个实施方案中，另外的治疗剂是根据本发明的用于治疗肿瘤的另一种药剂。
[0126]
在一个实施方案中，另外的治疗剂具有适用于与本发明的式(i)或式(ii)的化合物、复合物、药物组合物相同的施用途径的形式。
[0127]
在另一个实施方案中，另外的治疗剂具有适用于与本发明的式(i)或式(ii)的化合物、复合物、药物组合物的施用途径不同的施用途径的形式。
[0128]
尽管为了示例的目的已经公开了本发明的示例性实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不背离所附权利要求中公开的本发明的范围和精神的情况下，可以进行各种修改、添加和替换。
[0129]
现在将使用以下实施例和附图来说明本发明，这些实施例和附图是为了示例而给出，并非限制性的。
[0130]
附图简要说明
[0131]
表1.高通量筛选a18肽适配体的化学激动剂。筛选是基于分子抑制a18/hsp70结合的能力。
[0132]
表2.选择对a18与hsp70结合具有高抑制活性的“苗头化合物(hits)”。显示了它们
的化学结构以及它们阻断hsp70/a18相互作用的能力(biacore)。
[0133]
图1.热休克因子1(hsf1-/-)敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)不表达hsp70。显示了诱导型hsp70和组成型hsc70的蛋白质印迹。
[0134]
图2.小分子苗头化合物a、b和c抑制hsp70伴侣蛋白活性。a)在存在或不存在重组hsp70(10ng)的情况下测定蛋白质聚集。当指示时，添加a18或分子a、b和c(1μm)。b)在存在或不存在重组hsp70、hsc70或hsp90(10ng)的情况下测定蛋白质聚集。当指示时，添加a18或分子a、b和c(1μm)。a0，不相关的肽适配体在这里用作阴性对照。对每个hsp的值进行标准化。100％的伴侣蛋白效应是抑制通过添加重组伴侣蛋白诱导的蛋白质聚集。
[0135]
图3.化学分子苗头化合物使癌细胞对顺铂敏感。a)在存在或不存在分子a、b和c(2μm)的情况下，将人子宫颈hela或b)小鼠结肠直肠癌ct-26细胞与顺铂(25μm)一起孵育48小时。通过比色测定染色测量细胞存活。
[0136]
图4.化学分子在不表达hsp70的细胞中失去其化学增敏特性。在存在或不存在分子a、b和c(1μm)的情况下，mefhsf1-/-细胞与顺铂(25μm)一起孵育48小时。通过比色测定染色测量细胞死亡。
[0137]
图5：化学hsp70抑制剂增加凋亡细胞的数量。在存在或不存在化学分子a、b和c(2μm)的情况下，用顺铂(cddp,25μm,24h)处理hela细胞。通过流式细胞术(annexinv /ip-)测量细胞凋亡质量。
[0138]
图6：hdl载体化的分子b(molecule b-vectorized with hdl)诱导巨噬细胞产生ros。a：通过密度梯度超速离心纯化ldl和hdl。将脂蛋白中的总胆固醇调整为1mm。然后，将脂蛋白与hsp70抑制剂分子b(100μm)在37℃下孵育3小时，接着进行透析(针对1lpbs进行两次，截止值8000da)。然后，通过质谱法测量脂蛋白中总分子b的浓度。b：为了激活巨噬细胞，将人m2巨噬细胞用分子b(10μm在dmso中)处理2小时或在ldl或hdl中载体化(10μm最终分子b浓度)。ros阳性巨噬细胞的百分比表示为平均值 /-sem，n＝4，**：p《0.01，ns＝不显著；
[0139]
图7：在hdl中载体化的hsp70抑制剂通过靶向巨噬细胞来防止肿瘤生长。a：balb-c小鼠被注射ct-26结肠直肠癌细胞(106个细胞/小鼠，皮下注射)。在指定时间，用pbs或hdl-分子b(100μm胆固醇，10μm分子b，100μl/小鼠)处理小鼠，n＝4。b：每3天测量一次肿瘤体积，并表示为平均值 /-sem，***：p《0.001。c：在用切割的caspase-3抗体(绿色)和f4/80抗体(红色)和dapi标记的组织学载玻片中测定细胞凋亡和巨噬细胞浸润。照片是在随机场中选择的，代表每种情况下拍摄的五张照片，n＝4，比例尺＝50μm。d：通过dapi/dhe染色在组织切片中测量肿瘤中ros的产生。在随机选择场中拍摄的照片代表了每种情况下拍摄的五张照片，n＝4，比例尺＝50μm。e、f和g：切割的caspase-3(e)、f4/80(f)和dhe(g)的免疫荧光强度的量化。数据表示为平均增加vs.ctl /-sem，n＝4，*：p《0.05，***：p《0.001，****：p《0.0001；
[0140]
图8：在ldl中载体化的顺铂和在hdl中载体化的分子b的体内效应。a：balb-c小鼠被注射了ct-26结肠直肠癌细胞(106个细胞/小鼠，s.c.)。在指定时间，用pbs、hdl-分子b(100μm胆固醇、10μm分子b，100μl/小鼠)或ldl-顺铂(100μm胆固醇，1.5mg/kg顺铂) hdl-分子b(100μm胆固醇，10μm分子b，100μl/小鼠)处理小鼠。每组n＝4只小鼠。b：每3天测量一次肿瘤体积并表示为平均值 /-sem，*：p《0.05。c：在用切割的caspase-3抗体(绿色)和f4/80抗体(红色)和dapi标记的组织学载玻片中测定细胞凋亡和巨噬细胞浸润。照片是在随机场
中选择的，代表每种情况下拍摄的五张照片，n＝4，比例尺＝50μm。d：通过dapi/dhe染色在组织切片中测量肿瘤中ros的产生。在随机选择场中拍摄的照片代表了每种情况下拍摄的五张照片，n＝4，比例尺＝50μm。e、f和g：切割的caspase-3(e)、f4/80(f)和dhe(g)的免疫荧光强度的量化。数据表示为平均增加vs.ctl /-sem，n＝4，*：p《0.05，****：p《0.0001；
具体实施方式
[0141]
材料与方法
[0142]
a18肽适配体化学激动剂的高通量筛选
[0143]
由imaxio公司(法国里昂)对包含近60,000个小分子的文库进行的高通量筛选试验，aptascreen
tm
(由aptanomics sa开发；(baines ic等，drug discov today.2006；11:334-341；rerole al等，cancer res20119；71:484-495))。aptascreen
tm
检测基于自动双发光(luc和ruc报告基因)酵母双杂交检测，hsp70表达为“诱饵”，并且a18适配体表达为“猎物”。hsp70/a18相互作用指导luc报告基因的转录，而在同一检测中，对照蛋白/适配体对(aptamer couple)指导ruc报告基因的转录。当小分子抑制hsp70和a18之间的相互作用(即降低荧光素酶信号)而不是对照相互作用(即ruc信号没有或几乎没有变化)时，它可以被认为是“苗头化合物候选者”。按照标准方案(rerole al等，cancer res20119；71:484-495)，以10μm的浓度筛选分子，然后通过剂量响应分析确认苗头化合物候选者。
[0144]
细胞、质粒和转染
[0145]
使用rpmi 1640培养基或补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs)的dmem葡萄糖4.5g﹒l-1培养基，在受控气氛(37℃，5％co2)中作为单层生长hela细胞、hsf1-/-mef和ct-26细胞(所有培养基和fbs均来自lonza,switzerland)。hsf1-/-mefs用hsp70瞬时转染，克隆到ha标记的pcdna3.1载体中，或与hsp70和a18肽适配体共转染，或a14作为对照适配体，克隆到myc/6his标记的pcdna3.1中，或以空白载体作为对照。
[0146]
体外hsp70伴侣蛋白活性研究
[0147]
hsp70伴侣蛋白活性通过蛋白质耐热性测定进行评估。hsf1-/-mefs提取物在冰上在补充有蛋白酶抑制剂(罗氏，法国)的裂解缓冲液(50mm hepes、150mm nacl、5mm edta、0.1％np40)中孵育20分钟。在4℃下g
×
14,000离心15分钟后回收上清液，并针对牛血清白蛋白(bsa)标准范围进行蛋白质浓度测定(dc assay试剂盒，bio-rad，法国)。
[0148]
将其中加入重组hsp70、hsp90或hsc70的细胞提取物(含或不含待测小分子)在ph 7的tris-hcl缓冲液中稀释至终浓度为2mg﹒ml-1，并在55℃下加热1小时。在4℃下g
×
16,000离心10分钟后，通过lowry方法(dc assay试剂盒，bio-rad)测定上清液天然蛋白质的量。然后，将该最终蛋白质浓度与上清液中的初始蛋白质浓度进行比较，以量化变性蛋白质。
[0149]
细胞死亡分析
[0150]
将3.5
×
104个贴壁细胞接种到完全培养基中的24孔培养板上。用不同浓度(1μm至30μm)的小分子处理细胞4小时以确定细胞ic50。然后，将每个24孔培养板的一半细胞用顺铂(cddp，25μm)处理48小时。通过结晶紫比色测定染色测量细胞死亡。
[0151]
脂蛋白纯化
[0152]
如redgrave et al.1975.anal biochem.；65(1-2):42-9)先前所述，通过密度梯
度超速离心从非治疗性健康血浆(efs法国)中纯化hdl。简而言之，通过添加kbr盐(sigma aldrich，#746444)将血浆密度调节至1.21，然后将5ml血浆转移到13.2ml ultra-clear离心管(beckman coulter，344059)中。3ml的1.063密度kbr溶液(ddw，0.1g/ledta，0.02g/l叠氮化钠)，然后2ml的1.019密度kbr溶液(ddw，0.1g/ledta，0.02g/l叠氮化钠)，最后将2ml的1.000密度nacl溶液(ddw，0.1g/ledta，0.02g/l叠氮化钠)轻轻地铺在血浆顶部。然后，将样品在配备有摆动转子sw 41ti、低加速度和无制动的beckmann超速离心机(xxl-80)上以40.000rpm的速度离心24小时。离心后，在1.063和1.21溶液的界面收集hdl级分。按照制造商的说明，使用胆固醇定量试剂盒(clinisciences，jm-k603-100)对总胆固醇进行定量，并通过添加pbs将每个样品中的最终胆固醇浓度调整为1mm。
[0153]
在结合脂蛋白中引入分子b分子b首先在纯dmso中稀释至终浓度为100μm，然后在1mm hdl级分中稀释10倍，并在37℃下孵育4小时。然后，通过使用spectrum
tm
spectra/por
tm
1rc透析膜管(截止值6000到8000da，fisher scientific，08-670c)对1000倍体积的pbs进行两次连续透析，去除未引入的分子b和dmso。然后，通过质谱法评估分子b结合hdl。
[0154]
细胞培养
[0155]
人巨噬细胞于从健康供体的buffy coats(efs法国)获得的外周血单核细胞中分化出来。简而言之，为了提取单核细胞，将15ml血液(在pbs中稀释2倍)轻轻铺在46-65％percoll梯度溶液(sigma aldrich p1644-1l)上，并在550g，rt下离心30分钟。离心后，回收含有单核细胞的上环并接种在rpmi 10％fbs、100ui/ml psa、37℃ 5％co2中的12孔板(每孔5.105个单核细胞)中，并通过用m-csf(100ng/ml，miltenyi biotechnology#130-095-372)刺激细胞7天分化为巨噬细胞。
[0156]
流式细胞仪分析
[0157]
对于通过流式细胞术的巨噬细胞ros产生进行分析，将细胞在37℃和5％co2下，在dhe(10μm pbs中)中培养30分钟，刮出并离心(10分钟，1500rpm，4℃)。将细胞在pbs 4％pfa溶液中固定5分钟，并使用lsrii流式细胞仪(becton dickinson)进行分析。初级尺寸-粒度点图使我们能够区分细胞和碎片，通过比较红色荧光与未染色样品获得dhe阳性细胞。
[0158]
小鼠程序
[0159]
6-8周大的雌性balb/c小鼠购自charles river。balb/c衍生的小鼠结肠癌细胞系ct26(crl-2638
tm
)购自美国典型培养物保藏中心(atcc)，并按照制造商的说明进行培养。ct26细胞(106个细胞/小鼠)在左侧皮下注射。当肿瘤大小达到6mm3时设定为时间0。对于肿瘤生长实验，用pbs、hdl-分子b(100μm胆固醇、10μm分子b，100μl/小鼠)在第7、14和21天对小鼠进行腹腔注射，并在第25天安乐死(每组n＝5只小鼠)。用数字卡尺每三天测量一次肿瘤(肿瘤体积使用1/2x长度x宽度2公式确定)。实验得到了universit
é
de bourgogne伦理委员会的批准(协议n3613)。
[0160]
结果
[0161]
针对a18适配体-hsp70相互作用筛选化学文库
[0162]
由imaxio公司(法国里昂)对包括大部分已上市药物在内的近60,000个小分子库进行高通量筛选试验aptascreen
tm
(由aptanomics sa开发；
22,23
)。aptascreen
tm
测定基于自动双发光(luc和ruc报告基因)酵母双杂交测定，其中hsp70表达为“诱饵”并且发明人先前
分离出的与hsp70的atp结构域结合的肽适配体(a18)表示为“猎物”(rerole al等，cancer res 20119；71:484-495)。当小分子抑制hsp70和a18之间的相互作用(即降低荧光素酶信号)时，它可以被认为是“苗头化合物候选者”。以10μm的浓度筛选分子。最初鉴定了八个分子(苗头化合物分子)。从剂量响应研究中，基于它们的特异性和针对a18与hsp70结合的高抑制活性(表1和2)，它们中的三个被保留。有趣的是，分子2和3是类似物。
[0163][0164]
表1
[0165][0166][0167]
表2
[0168]
小分子苗头化合物候选物在体外抑制hsp70伴侣蛋白活性
[0169]
建立了研究hsps分子伴侣蛋白活性的方法。从小鼠胚胎hsf1-/-细胞中提取蛋白质并对其进行热休克。hsf1是应激后负责hsp表达的主要转录因子。因此，这种遗传背景使
我们能够减少内源性可诱导hsp(如hsp70)的污染(图1)。对等量的蛋白质进行热休克(55℃，1小时)，并在存在或不存在重组hsp70的情况下测定蛋白质聚集的百分比(与变性蛋白质的量直接相关)，无论有或没有待测试的化学分子。如图2a所示，hsp70能够以非常显著的方式减少聚集蛋白的数量，证明了它的伴侣蛋白功能。添加hsc70或hsp90时观察到类似的效果。正如所预期的，当发明人添加a18适配体时，观察到hsp70伴侣蛋白活性的强烈抑制，而对照适配体(a0)未观察到。这种抑制作用是特异性的，因为a18不能阻断重组hsc70或hsp90伴侣活性。所有四个小分子苗头化合物都抑制了hsp70伴侣蛋白活性，尽管程度有所不同。分子a仅部分阻断hsp70伴侣蛋白功能，但这种作用似乎是特定的。分子b和c引起了更重要的抑制(图2b)。
[0170]
靶向hsp70的化学分子的化学增敏特性
[0171]
为了研究这些分子在癌细胞中的作用，发明人使用了两种不同的癌细胞系：人宫颈癌hela细胞和小鼠结肠直肠癌ct-26。单独或与顺铂一起用小分子苗头化合物(2μm)处理细胞48小时并测定细胞存活率。如图3a和3b所示，这些分子协同增加了由顺铂诱导的细胞死亡，对分子b发现了最重要的作用。这种细胞死亡与hsp70的抑制有关，因为这些分子对mef hsf 1-/-细胞几乎没有任何影响(图4)，如图1所示，它们不表达诱导型hsp70。细胞似乎主要因细胞凋亡而死亡，这可以通过用该分子处理后获得的膜联蛋白v阳性/碘化丙啶阴性细胞的数量来检测(图5)。发明人得出结论，苗头化合物候选物阻断hsp70伴侣蛋白活性并使癌细胞对顺铂诱导的细胞凋亡敏感。
[0172]
由于在这些结果中，分子b在特异性(ic50)和效果方面似乎是最有希望的，因此发明人选择了该分子用于体内研究。
[0173]
分子b在患有结肠直肠癌的小鼠中显示出抗肿瘤作用，其涉及细胞毒性巨噬细胞
[0174]
为了在体内研究分子b，发明人决定用高密度脂蛋白(hdl)对分子进行载体化，因为据报道这些天然纳米载体可以解决疏水性和难溶性分子的溶解性问题(如这里选择的所有四种分子，包括分子b)并有利于细胞吸收。
[0175]
使用了将小鼠结肠癌ct-26细胞注射到balb/c小鼠中的同源模型。当肿瘤大小达到约0.9mm3时，用5mg/kg的与hdl复合的分子b治疗小鼠(图6a)(文献中描述的类似小化合物的平均浓度)，每三天一次腹腔注射，直到实验结束(出于伦理原因，由对照组中的肿瘤大小决定)(图7a)。化合物b的治疗诱导了60％的肿瘤生长减少(图7b)。与之前的结果一致，这种肿瘤退化效应与肿瘤细胞凋亡的增加有关(caspase-3激活。图7c，e)。但是，用载体化的分子b治疗诱导的最显著效果是具有细胞毒性(抗肿瘤)表型的巨噬细胞在退化肿瘤内的强烈积累(图7c-f)，如它们产生活性氧族(ros)的能力所示(ros)(图7c-g)。
[0176]
在体外，在从血沉棕黄层分离的巨噬细胞中证实了分子b有利于细胞毒性巨噬细胞的这种作用。hdl-分子b能够诱导ros产生(图6b)，而与ldl复合的相同数量的分子没有任何影响，这表明脂蛋白用作纳米载体的重要性。
[0177]
这种分子(其是第一个描述的在体外和体内靶向巨噬细胞的实验性治疗性hsp70抑制剂)可能为开发新型免疫治疗分子对抗化疗耐药性癌症铺展道路。
[0178]
分子b-hdl和顺铂-ldl复合物的联合作用
[0179]
最后，发明人测试了顺铂-ldl复合物与分子b-hdl复合物结合的影响。通过密度梯度超速离心从血沉棕黄层中纯化ldl，并在37℃下与顺铂(最终浓度为1mg/ml)一起孵育4小
时。携带ct-26肿瘤的小鼠仅用ldl-顺铂、hdl-分子b或两者的联合进行治疗。当使用联合疗法时，发明人观察到肿瘤生长的更强地减少(图8a和b)。免疫荧光染色显示i)强烈诱导癌细胞凋亡(图8c和e)，与仅用ldl-顺铂治疗的动物中观察到的相当，ii)巨噬细胞浸润的强烈迸发与单独使用hdl分子b观察到的相当(图8c和f)。值得注意的是，在这种情况下观察到较温和的ros产生诱导(图8d和g)，可能是由于对联合治疗的响应更高程度的肿瘤退化。这表明这种旨在同时用一种药物(顺铂-ldl)靶向癌细胞并用另一种药物(分子b-hdl)靶向肿瘤浸润性巨噬细胞的联合策略允许互补的累加效应，而药物副作用没有明显增加毒性-由动物体重不变和肠隐窝中动物上皮细胞不存在凋亡确定(数据未显示)。
[0180]
讨论
[0181]
在这项工作中，发明人已经鉴定了小的化学分子，即肽适配体a18的激动剂。a18是基于硫氧还蛋白的适配体，具有13个氨基酸可变区，可与hsp70的atp结构域结合(rerole al等，cancer res20119；71:484-495)。这些命中分子在体外干扰了hsp70的伴侣蛋白活性，因此强烈表明，作为a18，它们与hsp70的atp结构域结合。
[0182]
这里描述的四种“候选药物”使癌细胞对顺铂诱导的死亡敏感。
[0183]
巨噬细胞是抗癌免疫响应的重要组成部分，并且本发明人和其他人已经报道了hsp70在巨噬细胞分化/成熟中的角色(vegavl等，j immnuol2008；180:4299-307)。确认这些结果，在本技术中，发明人已经证明在携带肿瘤的同系小鼠中腹腔注射分子b可诱导肿瘤退化，这与炎症性细胞毒性巨噬细胞(m1-样)在肿瘤内的显著积累有关。有趣的是，为了避免溶解性问题，在这些体内实验中，发明人通过将分子与天然hdl复合来对其进行载体化。用hdl而不是用ldl进行载体化有利于分子b在培养的巨噬细胞中的作用，这一事实表明所使用的纳米载体的重要性以及巨噬细胞摄取hdl-分子b复合物的方式可能涉及特定受体。
[0184]
癌细胞必须广泛地重新连接它们的代谢和信号转导途径，从而变得依赖于对正常细胞的生存来说是可有可无的蛋白质。这种hsps-添加是在癌症治疗中使用hsps抑制剂的基础。今天，除了hsp27(一种寡核苷酸反义物)的抑制剂外，所有在高级临床试验中的抑制剂都以hsp90为靶点，其结果或多或少具有欺骗性，并且通常具有不可接受的毒性，这可能是它们诱导hsp70表达的原因，因为其强大的细胞存活特性可能会抵消hsp90抑制剂的功效。hsp70可以被认为是这样一种蛋白质，虽然它不是癌基因，但它的存在对于癌细胞的生存是必不可少的。hsp70在细胞凋亡抑制和自噬性细胞死亡中具有很好的作用。不幸的是，迄今为止，仅鉴定出有限数量的特异性靶向hsp70的化合物。leu等人描述了2-苯乙炔磺酰胺(pes)，也称为pifithrin-α，并最初被鉴定为一种干扰p53诱导的细胞凋亡的分子，与hsp70的肽结合结构域特异性相关，可诱导癌症中的自噬性细胞死亡细胞(但不是细胞凋亡)，并且在腹腔内施用中，能够抑制小鼠淋巴瘤的发展(leu ji等，mol cell.2009；36:15-27)。
[0185]
引用的参考文献
[0186]
1.liu x,kim cn,yang j,jemmerson r,wang x.induction of apoptotic program in cell-free extracts:requirement for datp and cytochrome c.cell.1996；86:147-157.
[0187]
2.ferri kf,kroemer g.organelle-specific initiation of cell death pathways.nat cell biol.2001；3:e255-263.
protein expression and drug resistance in breast cancer patients treated with induction chemotherapy.int j cancer.1998；79:468-475.
[0203]
18.nanbu k,konishi i,mandai m,et al.prognostic significance of heat shock proteins hsp70 and hsp90 in endometrial carcinomas.cancer detect prev.1998；22:549-555.
[0204]
19.gurbuxani s,bruey jm,fromentin a,et al.selective depletion of inducible hsp70 enhances immunogenicity of rat colon cancer cells.oncogene.2001；20:7478-7485.
[0205]
20.nylandsted j,rohde m,brand k,bastholm l,elling f,jaattela m.selective depletion of heat shock protein 70(hsp70)activates a tumor-specific death program that is independent of caspases and bypasses bcl-2.proc natl acad sci u s a.2000；97:7871-7876.
[0206]
21.schmitt e,maingret l,puig pe,et al.heat shock protein70neutralization exerts potent antitumor effects in animal models of colon cancer and melanoma.cancer res.2006；66:4191-4197.
[0207]
22.baines ic,colas p.peptide aptamers as guides for small-molecule drug discovery.drug discov today.2006；11:334-341.
[0208]
23.rerole al,gobbo j,schmitt e,pais de barros jp,lanneau d,de thonel a,hammann a,fourmaux e,delidov o,micjeau o,lagrost l,colas p,kroemer g,garrido c.peptides and aptamers targeting hsp70:a novel approach for anti-cancer therapy.cancer res 20119；71:484-495.
[0209]
24.vega vl,rodriguez-silva m,frey t,gehrmann m,diaz jc,steinem c,multhoff g,arispe n,de maio a.hsp70 trasnlocate into the plasma membrane after stress and is released into the extracellular environment in a membrane-associated form that activates macrophages.j immnuol 2008；180:4299-307.
[0210]
25.leu ji,pimkina j,frank a,murphy me,george dl.a small molecule inhibitor of inducible heat shock protein 70.mol cell.2009；36:15-27.