脱羧肌肽结晶形态及其制备方法与流程

25.53
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。
15.进一步地，所述脱羧肌肽的晶型，使用cu-kα辐射，以2θ角度表示的x射线衍射图谱与图1、图2或图3基本一致。
16.进一步地，所述脱羧肌肽的晶型，使用cu-kα辐射，以2θ角度表示的x射线衍射图谱与图1基本一致。
17.进一步地，所述脱羧肌肽的晶型的红外光谱有如下吸收峰：3249，3099，1611，1556， 1518，1470，1397，1364，1260，1188，1094，963，953，929，880，743，711，625，612 cm-1
。
18.进一步地，所述脱羧肌肽的晶型的差示扫描量热法热谱图在190～192℃处具有吸热峰。
19.进一步地，所述脱羧肌肽的晶型的差示扫描量热法热谱图在192℃处具有吸热峰。
20.进一步地，以失重5％计算，所述脱羧肌肽的晶型的热分解温度为265～274℃。
21.进一步地，以失重5％计算，所述脱羧肌肽的晶型的热分解温度为273.85℃。
22.进一步地，所述脱羧肌肽的晶型的熔点为190.4～190.6℃。
23.脱羧肌肽的晶型的制备方法，包括如下步骤：
24.s1、脱羧肌肽粗品用乙醇打浆，过滤出固体；
25.s2、向固体加入乙醇，升温后搅拌回流；
26.s3、冷却至室温，析出固体，再过滤、干燥即得。
27.进一步地，所述脱羧肌肽、s1所用乙醇、s2所用乙醇的重量体积比为10g：(10～30) ml：(70～100)ml。
28.进一步地，所述s2升温至70～75℃；所述s2搅拌的时间为1～3h。
29.脱羧肌肽的晶型的制备方法，包括如下步骤：
30.s1、脱羧肌肽粗品用乙醇打浆，过滤出固体；
31.s2、向固体加入乙醇，升温，加入水溶清，保温继续搅拌；
32.s3、滤液降温后析出固体，再过滤、干燥即得。
33.进一步地，所述脱羧肌肽、s1所用乙醇、s2所用乙醇、水的重量体积比为10g：(10～30) ml：(20～40)ml：(1～3)ml。
34.进一步地，所述s2搅拌的时间为0.5～2h；所述s2升温至60～65℃；所述s3降温至5～10℃。
35.脱羧肌肽的晶型的制备方法，包括如下步骤：
36.s1、脱羧肌肽粗品用乙醇打浆，过滤出固体；
37.s2、向固体加入甲醇和乙醇，升温，保温继续搅拌；
38.s3、自然冷却后析出固体，再过滤、干燥即得。
39.进一步地，所述脱羧肌肽、s1所用乙醇、s2所用甲醇、s2所用乙醇的重量体积比为10g： (10～30)ml：(3～10)ml：(20～40)ml。
40.进一步地，所述s2搅拌的时间为0.5～2h；所述s2升温至65～70℃。
41.脱酸肌肽制备的核心关键步骤为酰胺健的构建，而常用的方法通过多肽偶联试剂实现酰胺健的构建，其中酰基化试剂一般选用活性酯或者酰氯，而氨基化试剂一般选用保护的组胺。
42.这是由于组胺盐酸盐不溶于一般的有机溶剂，如果将组胺盐酸盐用无机碱脱酸，虽然可以增加溶解性，在有机相中实现均相对接，但游离的组胺依然不溶于一般有机溶剂，在组胺没有保护的条件下不能成功实现酰胺健的构建，所以，对于脱羧肌肽的制备，在均相体系，需要将组胺保护。
43.进一步地，还包括在s1之前合成得到脱羧肌肽粗品的步骤：
44.p1、使组胺二盐酸盐与化合物a在dbu条件下反应得到化合物b；
45.p2、使化合物b脱保护；
[0046][0047]
r为boc或者cbz。
[0048]
进一步地，所述组胺二盐酸盐、化合物a、dbu的摩尔比为(0.8～1.5)：1：(2～4)。
[0049]
进一步地，所述p1的溶剂为dmf，反应温度为60～90℃。
[0050]
进一步地，所述p1具体为：将组胺二盐酸盐溶于dmf，加入dbu，再加入化合物a，加热反应，反应结束后减压蒸馏dmf，反应液加入冰水中，冷却析出固体，重结晶得到产物。
[0051]
dbu作为缚酸剂和助溶剂，实现酰胺健构建的均相反应。
[0052]
进一步地，所述p2具体为：将化合物b溶于乙酸乙酯，搅拌下充入氯化氢气体，待固体析出后停止充气，室温搅拌过夜，过滤、干燥得到产物；反应要求无水条件，氯化氢气体应是干燥的。
[0053]
进一步地，所述p2具体为：将化合物b溶于甲醇，加入pd/c搅拌，通氢气反应，反应完毕后过滤pd/c，向滤液充入氯化氢气体，析出固体，过滤、干燥得到产物。
[0054]
pd/c的用量为化合物b质量的1～10％。
[0055]
本发明具有以下有益效果：
[0056]
1、本发明新发现脱羧肌肽盐酸盐的三种晶型，相比市售的脱羧肌肽盐酸盐，这三种晶型溶解性更好，其中结晶形式1的溶解性最好，良好的溶解性可以提高成药后的溶出速度，提高生物利用度；因此，本发明的脱羧肌肽的晶型具有更好的成药性能，为其药物制剂的开发奠定了基础。
[0057]
2、本发明以未经保护的组胺为氨基化试剂，廉价的丙氨酸甲酯(boc或者cbz保护) 为酰基化试剂，以dmf提供碱性环境和溶剂，以dbu作为强的缚酸剂和助溶剂实现均相反应，先构建酰胺键，后脱保护基，两步制备脱羧肌肽，可以大大降低制备成本。该方法避免了组胺的保护和脱保护，避免因保护不彻底或者在对接过程中保护基被脱落形成对接副产物的情况；避免制备活性酯需要的dcc、hosu或edc等偶联试剂，具有原子经济型和成本优势；避免制备酰氯需要二氯亚砜或者草酰氯等环境非友好型试剂；避免引入氨基而涉及的脱保护等问题；丙氨酸甲酯通过boc或者cbz保护，而不是fmoc保护，有利于在有机碱性环境中的稳定性；反应中间体和最后的产物都可以直接通过简单的结晶就可以得到纯品，终产物hplc纯度可达到100％。
附图说明
[0058][0059]
图1为脱羧肌肽的结晶形式1在25℃的x射线粉末衍射图；
[0060]
图2为脱羧肌肽的结晶形式1在80℃的x射线粉末衍射图；
[0061]
图3为脱羧肌肽的结晶形式1在100℃的x射线粉末衍射图；
[0062]
图4为脱羧肌肽的结晶形式1在120℃的x射线粉末衍射图；
[0063]
图5为脱羧肌肽的结晶形式1在140℃的x射线粉末衍射图；
[0064]
图6为脱羧肌肽的结晶形式2在25℃的x射线粉末衍射图；
[0065]
图7为脱羧肌肽的结晶形式2在80℃的x射线粉末衍射图；
[0066]
图8为脱羧肌肽的结晶形式2在100℃的x射线粉末衍射图；
[0067]
图9为脱羧肌肽的结晶形式2在120℃的x射线粉末衍射图；
[0068]
图10为脱羧肌肽的结晶形式2在140℃的x射线粉末衍射图；
[0069]
图11为脱羧肌肽的结晶形式3在25℃的x射线粉末衍射图；
[0070]
图12为脱羧肌肽的结晶形式3在80℃的x射线粉末衍射图；
[0071]
图13为脱羧肌肽的结晶形式3在100℃的x射线粉末衍射图；
[0072]
图14为脱羧肌肽的结晶形式3在120℃的x射线粉末衍射图；
[0073]
图15为脱羧肌肽的结晶形式3在140℃的x射线粉末衍射图；
[0074]
图16为脱羧肌肽的结晶形式1的红外光谱图；
[0075]
图17为脱羧肌肽的结晶形式2的红外光谱图；
[0076]
图18为脱羧肌肽的结晶形式3的红外光谱图；
[0077]
图19为脱羧肌肽的结晶形式1的tga谱图；
[0078]
图20为脱羧肌肽的结晶形式2的tga谱图；
[0079]
图21为脱羧肌肽的结晶形式3的tga谱图；
[0080]
图22为脱羧肌肽的结晶形式1的dsc谱图；
[0081]
图23为脱羧肌肽的结晶形式2的dsc谱图；
[0082]
图24为脱羧肌肽的结晶形式3的dsc谱图。
具体实施方式
[0083]
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下份数，均指重量份。
[0084]
实施例1
[0085][0086]
步骤1：
[0087]
将42mmol组胺二盐酸盐加入到250ml的三口瓶中，加入dmf50ml，滴加150mmoldbu，溶液变澄清，再加入boc保护的丙氨酸甲酯50mmol，加热到75～80℃，反应12h。原料反应完毕，减压蒸馏dmf，将反应液加入冰水中，冷却析出固体，重结晶得到白色固体40.61mmol，收率81.22％。
[0088]
步骤2：
[0089]
在2～10℃，将boc保护的脱羧肌肽40mmol溶于乙酸乙酯中，搅拌，缓慢充入干燥的氯化氢气体，缓慢有白色固体析出，直到大量析出，停止充气，室温搅拌过夜，过滤，用10ml 乙酸乙酯打浆，过滤，干燥得到38.08mmol，收率为95.21％，hplc纯度：99.627％。
[0090]
实施例2
[0091][0092]
步骤1：
[0093]
将50mmol组胺二盐酸盐加入到250ml的三口瓶中，加入dmf50ml，滴加100mmoldbu，溶液变澄清，再加入boc保护的丙氨酸甲酯50mmol，加热到65～70℃，反应12h。原料反应完毕，减压蒸馏dmf，将反应液加入冰水中，冷却析出固体，重结晶得到白色固体39.22mmol，收率78.43％。
[0094]
步骤2：
[0095]
在2～10℃，将boc保护的脱羧肌肽38mmol溶于乙酸乙酯中，搅拌，缓慢充入干燥的氯化氢气体，缓慢有白色固体析出，直到大量析出，停止充气，室温搅拌过夜，过滤，用10ml 乙酸乙酯打浆，过滤，干燥得到36.65mmol，收率为96.44％，hplc纯度：99.717％。
[0096]
实施例3
[0097][0098]
步骤1：
[0099]
将70mmol组胺二盐酸盐加入到250ml的三口瓶中，加入dmf50ml，滴加175mmoldbu，溶液变澄清，再加入cbz保护的丙氨酸甲酯50mmol，加热到85～90℃，反应12h。原料反应完毕，减压蒸馏dmf，将反应液加入冰水中，冷却析出固体，重结晶得到白色固体42.23mmol，收率84.46％。
[0100]
步骤2：
[0101]
在室温下，将cbz保护的脱羧肌肽20mmol溶于甲醇中，在n2的环境下加入cbz脱羧肌肽2t％的pd/c搅拌，通过带有气球的三通抽真空，用氢气置换两次，在室温下反应15h，反应完毕，过滤回收pd/c，滤液充入干燥的氯化氢气体，析出白色固体，过滤，用10ml乙酸乙酯打浆，过滤，干燥得到18.73mmol，收率为93.63％，hplc纯度：99.584％。
[0102]
实施例4
[0103]
结晶形式1的制备
[0104]
将乙酸乙酯打浆过后的脱羧肌肽10g，用20ml的乙醇打浆，过滤出固体，加入80ml 无水乙醇，加热到70～75℃，搅拌回流2h，边搅拌边自然冷却到室温，析出固体，过滤，干燥，得到白色均匀的白色固体9.55g，hplc：99.58％，即结晶形式1。
[0105]
结晶形式1在不同温度下的xrd为：
[0106]
25℃：13.73，16.68，18.87，19.95，21.16，25.53，27.27，27.70，28.58，30.11，32.08， 37.31，如图1所示；
[0107]
80℃：13.61，18.87，19.95，21.06，25.08，25.53，27.17，27.60，28.48，30.11，31.97， 37.31，如图2所示；
[0108]
100℃：13.61，18.87，19.95，21.06，24.98，25.53，27.17，27.60，28.48，30.11，31.97，37.21，如图3所示；
[0109]
120℃：19.95，20.93，21.,26，24.98，25.53，27.16，27.60，28.48，30.11，31.97，37.21，如图4所示；
[0110]
140℃：18.87，21.26，25.53，27.17，27.60，28.48，31.85，33.81，如图5所示。
[0111]
结晶形式1的红外光谱图如图16所示：
[0112]
ir(kbr)ν
max 3249，3099，1611，1556，1518，1470，1397，1364，1260，1188，1094， 963，953，929，880，743，711，625，612cm-1
。
[0113]
结晶形式1的tga谱图如图19所示，以失重5％计算，其热分解温度为273.85℃。
[0114]
结晶形式1的dsc谱图如图22所示，差示扫描量热法热谱图在192℃处具有吸热峰，样品在112.4℃可能发生熔融，在192.0℃可能发生晶型转变。
[0115]
结晶形式1的熔点为190.4～190.6℃。
[0116]
实施例5
[0117]
结晶形式2的制备
[0118]
将乙酸乙酯打浆过后的脱羧肌肽10g，用20ml的乙醇打浆，过滤出固体，加入30ml 无水乙醇，加热到60～65℃，滴加2ml去离子水，溶清，搅拌1h，滤液降温到5～10℃，析出固体，过滤，干燥，得到白色均匀的白色固体8.9g，收率89％，hplc：100％，即结晶形式2。
[0119]
结晶形式2在不同温度下的xrd为：
[0120]
25℃：15.05，18.64，20.28，22.14，24.76，26.94，28.48，30.87，33.71，37.86，如图6 所示；
[0121]
80℃：15.05，18.,75，20.38，22.04，24.65，26.72,，28.35，30.87，33.71，37.96，如图 7所示；
[0122]
100℃：15.05，18.,75，20.38，22.04，24.65，26.72，28.25，30.87，33.71，37.96，如图 8所示；
[0123]
120℃：15.05，18.,75，20.38，22.14，24.53，26.72，28.25，30.87，33.61，38.08，如图 9所示；
[0124]
140℃：15.05，18.75，20.38，22.04，24.53，26.62，28.25，30.77，33.61，38.19，如图 10所示；
[0125]
结晶形式2的红外光谱图如图17所示：
[0126]
ir(kbr)ν
max
3204，3094，2991，1663，1574，1530，1477，1439，1389，1254，1153， 1036，849，829，816，622cm-1
。
[0127]
结晶形式2的tga谱图如图20所示，以失重5％计算，其热分解温度为265.53℃。
[0128]
结晶形式2的dsc谱图如图23所示，差示扫描量热法热谱图在191.2℃处具有吸热峰，样品在191.2℃可能发生晶型转变。
[0129]
实施例6
[0130]
结晶形式3的制备
[0131]
将乙酸乙酯打浆过后的脱羧肌肽10g，用20ml的乙醇打浆，过滤出固体，加入5ml甲醇，以及30ml无水乙醇，加热到65～70℃，搅拌1h，自然冷却，析出固体，过滤，干燥，得到白色均匀的白色固体9.28g，收率92.80％，hplc：99.92％，即结晶形式3。
[0132]
结晶形式3在不同温度下的xrd为：
[0133]
25℃：13.74，18.87，21.38，22.14，25.19，27.70，28.47，30.11，31.97，33.81，如图 11所示；
[0134]
80℃：13.74，18.87，21.38，22.04，25.08，27.60，28.35，30.11，31.85，33.81，如图 12所示；
[0135]
100℃：13.62，18.87，21.38，22.04，25.08，27.60，28.35，30.11，31.97，33.81，如图 13所示；
[0136]
120℃：13.74，18.87，21.38，22.04，24.98，27.60，28.25，30.11，31.97，33.81，如图 14所示；
[0137]
140℃：13.61，18.75，21.26，22.04，24.98，27.60，28.25，30.11，31.97，33.81，如图 15所示；
[0138]
结晶形式3的红外光谱图如图18所示：
[0139]
ir(kbr)ν
max 3309，3097，1663，1618，1574，1530，1484，1439，1387，1249，1191， 1153，963，832，622cm-1
。
[0140]
结晶形式3的tga谱图如图21所示，以失重5％计算，其热分解温度为266.69℃。
[0141]
结晶形式3的dsc谱图如图24所示，差示扫描量热法热谱图在190.1℃处具有吸热峰，样品在190.1℃可能发生晶型转变。
[0142]
实施例7
[0143]
溶解性测试
[0144]
在脱羧肌肽的溶解实验中，选择常用的溶剂水和1,3-丙二醇，将实施例1的脱羧肌肽盐酸盐和实施例4～6三种结晶形式的脱羧肌肽分别溶解。
[0145]
1、脱羧肌肽：水＝1：9(质量比)，将1g脱羧肌肽完全溶解在9g水中，常温搅拌溶解，溶解后，再用超声波超声2min。
[0146]
现象：实施例4～6三种结晶形式的脱羧肌肽的溶液透明，并不完全透亮，灯光底部照射，溶液微显浑浊，实施例1的脱羧肌肽的溶液出现微量白色沉淀；静置2小时，无明显变化；静置48小时，晶型1溶液无明显变化，仍然透明，显示出更好的溶解性，而晶型2和3的溶液有少量白色沉淀产生，无晶型溶液有更多白色沉淀产生，比晶型2、3的溶液更显浑浊。
[0147]
2、脱羧肌肽：1,3-丙二醇：水＝1：2：7，将1g脱羧肌肽完全溶解在2g 1,3-丙二醇和7g 水中，常温搅拌溶解，溶解后，再用超声波超声2min。
[0148]
现象：灯光底部照射，实施例4～6三种结晶形式的脱羧肌肽的溶液澄清透亮，实施例1 的脱羧肌肽的溶液微显浑浊；静置2小时，晶型1溶液无明显变化，仍然澄清透亮，晶型2 和3溶液会显浑浊，无晶型溶液出现少量白色沉淀物；静置48小时后，晶型2和3溶液会出现少量白色沉淀物，而晶型1没有这现象，显示出更好的溶解性。
[0149]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。