一种基于SERS使用复合探针检测饮料中葡萄糖的方法

一种基于sers使用复合探针检测饮料中葡萄糖的方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于sers使用复合探针检测饮料中葡萄糖的方法，属于分析检测领域。


背景技术：

2.葡萄糖是生命体必须的能量供应物质，对人类的日常生活，身体健康都有着重要的影响。葡萄糖主要以甜味剂的用途广泛存在于各类食品中，用于增加食品的甜度，提升食品的口感。大量的医学研究表明，过量的糖分摄入会削弱免疫力，造成肥胖、动脉硬化、高血压、糖尿病等不良后果。因此，食品工业中需要一种灵敏可靠的葡萄糖检测方法。
3.当前，检测饮料中葡萄糖的主要方法有：高效液相色谱法、荧光光谱法、电化学法。这些方法具有较高的精度和可靠性，但其检测步骤大多比较复杂和耗时，需要样品预处理以及专业的仪器和人工。因此，急需寻找一种更加简单、快速、灵敏的葡萄糖检测方法。
4.表面增强拉曼光谱(sers)技术由于结合了拉曼光谱的指纹识别能力和等离子体增强的高灵敏度特点，使其具有超灵敏检测的有效性。目前sers技术应用于饮料中葡萄糖检测的报道少并且灵敏度和检出限相对于传统方法不具优势。


技术实现要素：

5.技术问题：传统检测饮料中葡萄糖的方法复杂、耗时、需要样品预处理、专业的仪器和人工，以及需要使用昂贵的酶来确保检测的准确性；目前采用sers可以检测水环境中的葡萄糖，并未有文献具体公开如何采用sers来检测饮料中的葡萄糖。
6.技术方案：为了解决上述至少一个问题，本发明将tmb-agnps@cof复合结构的sers探针应用于检测饮料中葡萄糖，实现了检测时间短、检测精度高、检测限低、基底材料成本低的效果。
7.本发明的第一个目的是提供一种基于sers使用复合探针检测饮料中葡萄糖的方法，包括如下步骤：
8.(1)将硝酸银溶液与cof材料混合，加热进行孵育，孵育结束后加入柠檬酸钠溶液进行还原，得到agnps@cof基底溶液；
9.(2)在步骤(1)得到的agnps@cof基底溶液中加入tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)水溶液，混匀，得到tmb-agnps@cof sers探针溶液；
10.(3)将一系列已知浓度的葡萄糖水溶液与待测饮料样品液、tmb-agnps@cof sers探针溶液混合，得到测试样液；将测试样液进行拉曼检测，得到拉曼光谱；利用特征峰1604cm-1
±
5cm-1
处的峰强度衰减率a与相应测试样液的葡萄糖浓度进行线性关联，得到检测模型；其中，峰强度衰减率a＝(i
0-i)/i0，i0为tmb-agnps@cof sers探针的初始sers强度，i代表测试样液的sers强度；
11.(4)将待测饮料和步骤(2)得到的tmb-agnps@cof sers探针溶液混合均匀，得到待测样品溶液；将待测样品溶液进行拉曼检测，得到拉曼光谱；将拉曼光谱中特征峰1604cm-1
±
5cm-1
处的峰强度衰减率带入步骤(3)的检测模型中，得到待测饮料中葡萄糖的浓度。
12.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中硝酸银溶液是硝酸银水溶液，其浓度为200-600mg/l。
13.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中硝酸银溶液和cof材料用量比以mg/l计为1：2.5-3.5，进一步优选为1：3。
14.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的cof材料的制备方法为：
15.在乙酸乙酯溶液中将均苯三甲酰氯(tmc)和对苯二胺(ppd)混合、搅拌，经离心、洗涤、干燥和过滤后得到黄色粉末状的cof材料。
16.在本发明的一种实施方式中，均苯三甲酰氯(tmc)、对苯二胺(ppd)、乙酸乙酯溶液的用量比为4mmol：3mmol：45ml。
17.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的cof材料的制备方法具体为：
18.在容器中分别制备得到均苯三甲酰氯(tmc，4mmol)的乙酸乙酯溶液(30ml)和对苯二胺(ppd，3mmol)的乙酸乙酯溶液(15ml)，超声10min，确保均苯三甲酰氯(tmc)和对苯二胺(ppd)完全溶解；在低温0℃-10℃下，在不断搅拌的过程中向均苯三甲酰氯(tmc)的乙酸乙酯溶液中匀速滴加对苯二胺(ppd)的乙酸乙酯溶液；全部滴加完成后，在低温下继续搅拌1h，随后转入室温环境下静置24h；离心收集得到的黄色沉淀，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤3-4次；最后在真空65℃下干燥8h，得到cof材料。
19.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述孵育的条件为：在90-110℃下孵育20-30min，进一步优选为100℃孵育20min。
20.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的柠檬酸钠溶液的浓度为0.5wt％-1.5wt％(质量分数)，添加量为硝酸银溶液的0.2％-0.4％(体积分数)；进一步优选为柠檬酸钠溶液的浓度为1wt％(质量分数)，添加量为硝酸银溶液的0.3％(体积分数)。
21.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的还原反应的条件为：在95-105℃下反应35-45min；进一步优选为在100℃下反应40min。
22.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中tmb水溶液的浓度为0.5-1.5mmol/l，进一步优选为1mmol/l。
23.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中agnps@cof基底溶液和tmb水溶液的体积比为1：1-3，进一步优选为1：2。
24.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中待测饮料和tmb-agnps@cof sers探针溶液的体积比为1：2-4，进一步优选为1：3。
25.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述的混合均匀是震荡混合1-3min。
26.在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中进行拉曼检测的条件为：利用拉曼光谱仪进行拉曼检测，拉曼光谱仪的激发光源波长为532nm，积分时间为20s，激光功率10％。
27.在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，葡萄糖水溶液与待测饮料样品液、tmb-agnps@cof sers探针溶液的体积比为1:1:3。
28.在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中检测模型的构建方法具体包括如下过程：
29.配置不同浓度梯度的葡萄糖标准水溶液，将标准水溶液与agnps@cof基底、tmb溶液和饮料样品按照体积比1：1：2：1混合均匀得到样品液；直接对样品液进行拉曼检测，得到拉曼光谱；最后利用拉曼光谱中特征峰1604cm-1
±
5cm-1
处的峰强度衰减率与葡萄糖浓度构
建线性模型，即检测模型。
30.在本发明的一种实施方式中，在标准曲线的构建过程中标准溶液为以50mg/l的葡萄糖溶液为母液，并取母液分别稀释至1-40mg/l的水溶液作为葡萄糖标准水溶液。
31.在本发明的一种实施方式中，在标准曲线的构建过程中标准溶液与agnps@cof基底、tmb溶液和饮料样品震荡混合1-3min。
32.在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中标准曲线模型为：a ＝0.146c-0.06161，相关系数r2为0.96796，c为葡萄糖浓度，单位mg/l；a为拉曼1604cm-1
特征峰强度的衰减率，计算方法为a＝(i
0-i)/i0，其中i0为tmb-agnps@cof sers探针的初始sers强度，i代表添加了不同浓度葡萄糖后测得的sers强度。
33.在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，待测饮料和步骤(2)得到的tmb-agnps@cof sers探针溶液的体积比为1:3。
34.本发明的第二个目的是本发明所述的方法在食品检测领域中的应用。
35.有益效果：
36.(1)本发明使用agnps@cof结构的拉曼增强基底应用于检测，其纳米级的多孔结构以及cof材料本身的表面选择性，加强了基底对待测目标分子的抓取，提高了检测能力。
37.(2)本发明中的柠檬酸钠还原的纳米银具有表面等离子体共振性能，起到增强拉曼信号的作用。
38.(3)本发明中的tmb-agnps@cof可以作为sers探针检测饮料中的葡萄糖，检测时间在5分钟内，检测限低至0.094mg/l，这对于监督食品中的葡萄糖含量具有重要意义。
39.(4)本发明提供了一种对饮料中葡萄糖的新检测方法，提升了饮料中葡萄糖的检测精度。
附图说明
40.图1为基于表面增强拉曼光谱技术检测葡萄糖的流程图。
41.图2为实施例2中反应体系中葡萄糖浓度与1604cm-1
处拉曼强度衰减率的关系曲线。
42.图3为实施例3中基底agnps@cof和tmb不同比例对拉曼特征峰强度的影响。
43.图4为实施例4中待测溶液和tmb-agnps@cof sers探针不同比例对拉曼特征峰强度变化量的影响。
44.图5为对照例1中以纳米银为基底进行拉曼检测的结果。
45.图6为对照例2中基底agnps@cof与tmb等多种有机物的响应结果。
46.图7为对照例3的测试结果。
47.图8为对照例4的测试结果，其中(a)为测得的拉曼谱图，(b)为1604cm-1
处拉曼特征峰强度的点线图。
具体实施方式
48.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
49.实施例1agnps@cof基底的制备
50.agnps@cof基底的制备方法，包括如下步骤：
51.在两个50ml离心管中，各自加入均苯三甲酰氯(tmc，4mmol)的乙酸乙酯溶液(30ml)和对苯二胺(ppd，3mmol)的乙酸乙酯溶液(15ml)，均超声10min，使固体完全溶解；在10℃低温环境下，在搅拌状态下向均苯三甲酰氯(tmc)的乙酸乙酯溶液中匀速滴加对苯二胺(ppd)的乙酸乙酯溶液；全部滴加完成后，在低温下继续搅拌1h，随后转入室温环境下静置24h；离心收集得到的黄色沉淀，再分别用去离子水和无水乙醇洗涤3-4次；最后在真空65℃下干燥8h，得到cof材料。
52.将浓度为300mg/l的硝酸银溶液100ml和10mg cof材料混合均匀，在80℃下孵育20min；之后加入质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液2ml，在100℃下进行还原反应40min，得到agnps@cof基底溶液。
53.实施例2标准曲线的构建
54.(1)配制样品液：
55.以50mg/l的葡萄糖溶液为母液，并取母液分别稀释至1、2、3、4、5、6、8、10、20、40mg/l的溶液得到梯度浓度的葡萄糖水溶液；
56.以实施例1的agnps@cof基底溶液和tmb溶液，与待测饮料样品、葡萄糖水溶液按照体积比1：2：1：1混合，涡旋震荡1min，得到浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.6、2、4、8mg/l的标准溶液，作为测试样品液；
57.(2)进行拉曼检测：
58.得到的测试样品液无需进行任何预处理程序，利用拉曼光谱仪在激发光源波长为532nm、积分时间为20s、激光功率10％的条件下直接进行拉曼检测，得到拉曼光谱；
59.(3)构建标准曲线：
60.通过特征峰强度衰减率和葡萄糖的浓度构建标准曲线，具体如下：
61.特征峰1604cm-1
处：测试样品液的拉曼强度衰减率a与测试样品液的葡萄糖浓度c成线性关系，线性回归方程为a＝0.146c-0.06161，相关系数r2为0.96796。c为葡萄糖浓度，单位mg/l；a为拉曼1604cm-1
特征峰强度的衰减率，计算方法为a＝(i
0-i)/i0，其中i0为tmb-agnps@cof sers探针的初始sers强度，i代表添加了不同浓度葡萄糖后测得的sers强度。计算得检测限为0.094mg/l，如图2。
62.测量得到的拉曼光谱出现了四个强的特征峰，分别在1191cm-1
、1337cm-1
、1405cm-1
和1604cm-1
，由于1604cm-1
特征峰强度更高、变化更明显以及线性度更好，所以最终选取1604cm-1
处的特征峰作为拟合依据。
63.实施例3基底和tmb不同比例对拉曼特征峰强度的影响
64.按照实施例2步骤(1)中涡旋震荡的时间为1min，调整实施例2步骤(1)中基底agnps@cof与tmb溶液体积的比例关系为1：1，1：2和1：3；按照实施例2步骤(2)进行拉曼检测，检测结果如下：
65.图3为实施例3中不同比例的基底和tmb混合溶液的拉曼谱图，可以看到：对agnps@cof基底溶液直接测量观察得到其不具备明显的拉曼特征峰，在图3中表现为近似于一条直线；在基底：tmb＝1：2时，拉曼特征峰(1604cm-1
)强度最大，因此后续实验中选择基底与tmb的添加比例关系为1：2。
66.实施例4待测溶液和基底与tmb的sers探针不同比例对拉曼特征峰强度变化量的
影响
67.调整实施例2步骤(1)中待测饮料样品、葡萄糖水溶液和tmb-agnps@cof sers探针溶液(agnps@cof基底溶液和tmb溶液体积比1:2)的体积比为1：1：0.5，1：1：1，1：1：2，1：1：3，1：1：4，1：1：5，1：1：6，1：1：7，得到样品液；按照实施例2步骤(2)进行拉曼检测，检测结果如下：
68.图4为实施例4中根据拉曼特征峰(1604cm-1
)强度绘制的直方图对比，在待测饮料样品和tmb-agnps@cof sers探针的体积比为1：3时，拉曼特征峰(1604cm-1
)强度变化量达到最大，因此后续实验中选择待测饮料样品、葡萄糖水溶液、基底溶液和tmb溶液的体积比为1：1：1：2。
69.实施例5饮料样品中葡萄糖检测结果
70.一种基于sers使用复合探针检测饮料中葡萄糖的方法，包括如下步骤：
71.将葡萄糖浓度为1.2、1.4mg/l的饮料样品和实施例1的agnps@cof基底及tmb溶液按照体积比1：1：2，涡旋震荡1分钟，得到样品液；
72.无需预处理直接利用拉曼光谱仪在激发光源波长为532nm、积分时间为20s、激光功率10％的条件下进行拉曼检测，得到拉曼光谱；将拉曼光谱中特征峰1604cm-1
±
5cm-1
处的峰强度衰减率带入标准曲线模型，得到待测饮料中葡萄糖的浓度。
73.检测结果如表1：
74.从表1可以看出：检测结果准确、可行。
75.表1实施例6的测试结果
76.加标浓度(mg/l)检测浓度(mg/l)回收率(％)1.21.1797.751.41.3898.79
77.对照例1
78.省略实施例1中的cof材料，得到纳米银基底；之后纳米银基底和tmb溶液按照体积比1：2，涡旋震荡1分钟，得到样品液；然后将得到的样品液进行拉曼检测，检测结果如图5：
79.从图5可以看出：在agnps@cof基底增强下的1604cm-1
特征峰强度高且清晰，用传统纳米银基底增强的光谱未显现出任何的拉曼特征峰，所以cof材料的引入增加了基底和tmb分子的结合能力，为tmb-agnps@cof sers探针的制备创造了前提，最终从拉曼光谱上表现为增强倍数的显著提高，从而实现了加入待测物葡萄糖后拉曼信号强度的明显变化。
80.对照例2
81.替换实施例2步骤(1)中的tmb溶液为其他有机物：如苯甲酸、对苯二甲酸、葡萄糖、隐色孔雀石绿(lmg)、3-氨基苯硼酸和1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(tpb)，基底和各个有机物分别以1：2的体积关系混合，测得的拉曼光谱如图6：
82.从图6可以看出：在具有代表性的各个有机物中，只有tmb可以受到基底的sers增强效果，且增强倍数十分高，为下一步葡萄糖的加入产生信号变化奠定了基础。
83.对照例3
84.替换实施例2步骤(3)中的拉曼光谱特征峰为1337cm-1
的强度变化量与葡萄糖浓度进行拟合，得到浓度-强度变化量点线图，如图7。
85.从图7可以看出：在较高浓度的区间内，葡萄糖浓度和光谱强度变化量成线性关
系，但是在低浓度区间内波动较大，且因1337cm-1
特征峰强度相对较低，将其作为定量检测葡萄糖浓度的标准会降低检测的精度。
86.对照例4
87.替换实施例1中的cof材料，使用一种表面携带氨基官能团的cof材料与硝酸银通过水热反应为合成agnps@cof基底；其中，合成表面携带氨基官能团的cof材料的前驱体物质为1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和2,5-二乙烯基对苯二醛，在乙腈和醋酸两种物质存在的情况下室温合成黄色cof材料。
88.使用该基底结合tmb后得到的sers探针对葡萄糖进行了检测，得到的检测结果如图8：
89.从图8中可以看出，相比于原方法中合成的基底，通过这种基底得到的检测曲线，在低浓度范围的线性度较差，且检测精度远不如原方法。