1139-p；ding (2008) j. bone miner. res. 23:536-543；tai等人(2018) brain res. 1678:64-74；m
ü
ller等人(2017) physiol. rev. 97:721-766；finan等人(2013) sci. transl. med. 5:209；h
ö
lscher (2014) biochem. soc. trans. 42:593-600。
7.但是，仍然需要能够提供有效血糖控制、具有减重益处和/或有利的副作用状况（side effect profile）的对这些病况、疾病和障碍，尤其是t2dm的疗法。还需要可以足够长的作用持续时间使用以允许像每日一次、每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药的治疗剂。
8.本文中的肠促胰岛素类似物试图满足上述需要。相应地，本公开描述了在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物。有利地，本文中的肠促胰岛素类似物在这些受体处具有平衡活性，因此允许所给剂量在各受体处提供足够的活性以提供该受体的激动效益，同时避免与太高活性相关的不合意副作用。此外，本文中的肠促胰岛素类似物在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有延长的作用持续时间以允许像每日一次、每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药。以这种方式，该肠促胰岛素类似物带来增强的血糖控制、代谢益处如体重降低和/或改善身体组成、脂质益处如降低前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）/kexin type 9（pcsk9），和/或其它益处如增加骨量或骨形成或减少骨吸收。本公开还描述了对包括t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和/或肥胖在内的病况、疾病和障碍的有效治疗。
9.相应地，本公开首先描述了肠促胰岛素类似物或其可药用盐，所述肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：其中x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是y或4pal，x
13
是l或αmel，x
16
是o，x
17
是任何具有可供缀合的官能团的氨基酸，并且所述官能团缀合到c
16-c
22
脂肪酸部分上，x
20
是4pal、iva或αmel，x
21
是a或aib，x
24
是e或e，x
25
是y或αmey，且x
39
是e或s（seq id no:5），并且其中羧基末端（c末端）氨基酸任选酰胺化。
10.在一些情况下，在位置x
17
的具有可供缀合的官能团的氨基酸是c、d、e、k或q。在某些情况下，在位置x
17
的具有可供缀合的官能团的氨基酸是k。
11.在某些情况下，x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是y，x
13
是l，x
16
是o，x
17
是k，x
20
是4pal，x
21
是a，x
24
是e，x
25
是y且x
39
是e，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：是e，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：。
12.在某些情况下，x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是y，x
13
是αmel，x
16
是o，x
17
是k，x
20
是iva，x
21
是a，x
24
是e，x
25
是αmey且x
39
是s，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：列：。
13.在某些情况下，x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是4pal，x
13
是αmel，x
16
是o，x
17
是k，x
20
是αmel，x
21
是aib，x
24
是e，x
25
是αmey且x
39
是s，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：
。
14.在一些情况下，c
16-c
22
脂肪酸部分经由接头缀合到具有可供缀合的官能团的氨基酸上。在某些情况下，c
16-c
22
脂肪酸部分具有结构-co-(ch2)
a-co2h，其中a是16至22的整数。在某些情况下，该脂肪酸部分是c
18
二酸或c
20
。同样地和在一些情况下，该接头是[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]]-乙酰基（aeea）、氨基己酸（ahx）、e、γ-谷氨酸（γe）或其组合的一个或多个单元。
[0015]
在特定情况下，本文中的肠促胰岛素类似物，包括接头和脂肪酸部分，可以是以下之一：
(seq id no:9),(seq id no:10)，或
(seq id no:11)。
[0016]
其次，描述了药物组合物，其包含至少一种本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐（例如三氟乙酸盐、乙酸盐或盐酸盐）和可药用载体。在一些情况下，该药物组合物可进
一步包含载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0017]
第三，描述治疗疾病如t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和肥胖的方法。这样的方法可包括至少给予需要其的个体有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物的步骤。在一些情况下，该疾病是t2dm、nafld、nash或肥胖。在另一些情况下，该疾病是不被视为代谢疾病的心血管疾病和神经退行性疾病。
[0018]
在一些情况下，本文中的所述至少一种肠促胰岛素类似物可皮下（sq）给药于个体。同样地和在一些情况下，所述至少一种肠促胰岛素类似物可每日、每隔一日、每周三次、每周两次、每周一次（即每周）、每两周一次（即每隔一周）或每月一次给药。在某些情况下，所述至少一种肠促胰岛素类似物可每隔一日皮下给药、每周三次皮下给药、每周两次皮下给药、每周一次皮下给药、每隔一周皮下给药或每月一次皮下给药。在特定情况下，所述至少一种肠促胰岛素类似物每周一次（qw）皮下给药。
[0019]
该方法还可包括如下步骤：测量或获得个体的体重或身体组成和/或血糖和/或血胰岛素和/或血红蛋白a1c（hba1c）和/或血脂，然后将由此获得的值与一个或多个基线值或先前获得的值比较以评估治疗的有效性。
[0020]
在一些情况下，个体是肥胖或超重的。在另一些情况下，个体是糖尿病（pwd），尤其是t2dm的患者。在某些情况下，个体是肥胖并伴有t2dm的，或超重并伴有t2dm的。
[0021]
该方法也可与饮食和锻炼结合和/或可与另外的治疗剂组合。
[0022]
第四，肠促胰岛素类似物被描述用于疗法，如用于治疗疾病如t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和肥胖。在一些情况下，该疾病是t2dm、nafld、nash或肥胖。在另一些情况下，该疾病是不被视为代谢疾病的心血管疾病和神经退行性疾病。
[0023]
第五，描述了本文中的肠促胰岛素类似物在制备用于治疗t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和肥胖的药物中的用途。在一些情况下，该疾病是t2dm、nafld、nash或肥胖。在另一些情况下，该疾病是不被视为代谢疾病的心血管疾病和神经退行性疾病。
[0024]
除非另行规定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管在肠促胰岛素类似物、药物组合物和方法的实践或测试中可使用与本文中描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但在本文中描述了优选的方法和材料。
[0025]
此外，由不定冠词“一”提到一要素不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文清楚地要求有一个且只有一个要素。不定冠词“一”因此通常是指“至少一个”。
[0026]
定义本文所用的“大约”是指在数值例如指定浓度、长度、分子量、ph、序列一致性、时间范围、温度或体积的统计学有意义的范围内。这样的数值或范围可在给定数值或范围的通常20%内，更通常10%内，再更通常5%内的量级内。“大约”所涵盖的容许偏差取决于受研究的特定体系，并且是本领域技术人员容易认识到的。
[0027]
如本文所用并且关于gip、glp-1或gcg受体的一种或多种，“活性”、“活化”、“激活”等是指如使用本领域中已知的测定法，如下述体外测定法测得的化合物如本文中的肠促胰岛素类似物结合到受体上并在受体处诱发响应的能力。
[0028]
本文所用的“氨基酸”是指从化学角度看以含有一个或多个胺基团和一个或多个羧酸基团为特征并可能含有其它官能团的分子。如本领域中已知，有一组20种氨基酸被指
定为标准氨基酸并用作任何生物生成的大多数肽/多肽/蛋白质的结构单元。
[0029]
本文所用的“具有可供缀合的官能团的氨基酸”是指具有可借助例如接头缀合到脂肪酸部分上的官能团的任何标准或非标准氨基酸。这样的官能团的实例包括但不限于炔基、烯基、氨基、叠氮基、溴、羧基、氯、碘和巯基基团。另外，包括这样的官能团的标准氨基酸的实例包括c（巯基）、d（羧基）、e（羧基）、k（氨基）和q（酰胺）。
[0030]
本文所用的“类似物”是指活化靶受体并引发至少一种由天然受体激动剂引发的体内或体外效应的化合物，如合成肽或多肽。
[0031]
本文所用的“不被视为代谢疾病的心血管疾病”等是指例如动脉粥样硬化或心力衰竭之类的疾病。
[0032]
本文所用的“c
16-c
22
脂肪酸”是指具有16至22个碳原子的羧酸。适用于本文的c
16-c
22
脂肪酸可以是饱和单酸或饱和二酸（“二酸”在每端具有羧基）。
[0033]
本文所用的“有效量”是指在单剂或多剂给药于需要其的个体时在被诊断或治疗的这种个体中提供所需作用（即可产生临床可测量的个体状况的差异，例如血糖降低、hba1c降低、体重或体脂降低和/或身体组成变化）的一种或多种本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的量、浓度或剂量。本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果容易确定有效量。在确定对个体而言有效的量时，考虑许多因素，包括但不限于哺乳动物的物种、其体型、年龄和一般健康状况、涉及的特定疾病或障碍、疾病或障碍的涉入程度或严重程度、个体的响应、给予的特定肠促胰岛素类似物、给药模式、给予的制剂的生物利用度特征、所选给药方案、伴随药物治疗的使用和其它相关情况。
[0034]
本文所用的“延长的作用持续时间”是指肠促胰岛素类似物的结合亲和力和活性的持续时间大于天然人gip、glp-1和gcg，以允许至少像每日一次或甚至每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药。可使用已知的药代动力学试验方法，如下文的实施例中所用的那些测量肠促胰岛素类似物的作用时间分布（time action profile）。
[0035]
本文所用的“葡萄糖依赖性促胰岛素多肽”或“gip”是指一种42-氨基酸肽（seq id no:1），其是一种肠促胰岛素，通过刺激在葡萄糖存在下从胰腺β细胞分泌胰岛素而在葡萄糖稳态中发挥生理作用。
[0036]
本文所用的“胰高血糖素样肽-1”或“glp-1”是指一种36-氨基酸肽（seq id no:2），其也是一种肠促胰岛素，刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌并且已表明防止糖尿病患者的高血糖。
[0037]
本文所用的“胰高血糖素”或“gcg”是指一种29-氨基酸肽（seq id no:3），其通过结合到肝细胞上的gcg受体上并将其活化以使肝通过所谓的糖原分解过程释放以糖原形式储存的葡萄糖而有助于维持血糖。
[0038]
本文所用的“胃泌酸调节素”或“oxm”是指一种37-氨基酸肽（seq id no:4），其不仅包括gcg的29-氨基酸序列，还包括八肽羧基末端延伸，其激活gcg和glp-1受体，对gcg受体的效力略高于glp-1受体。
[0039]
本文所用的“半最大效应浓度”或“ec
50”是指带来检测终点如剂量响应曲线（例如camp）的50%活化/刺激的化合物浓度。
[0040]
本文所用的“肠促胰岛素类似物”是指与gip、glp-1和gcg，尤其是人gip（seq id no:1）、人glp-1（seq id no:2）和人gcg（seq id no:3）的每一种具有结构相似性但还有许
多差异的化合物。本文中的肠促胰岛素类似物包括导致该化合物对gip、glp-1和gcg受体的每一种具有亲和力和活性（即三重受体激动剂活性）的氨基酸序列。
[0041]
本文所用的“需要其的个体”是指具有需要处理或治疗的病况、疾病、障碍或症状，包括例如本文中列举的那些的哺乳动物，如人类。特别地，要治疗的优选个体是人类。
[0042]
本文所用的“长效”是指本文中的肠促胰岛素类似物的结合亲和力和活性的持续时间大于参考肽，如天然人gip（seq id no:1）、人glp-1（seq id no:2）和/或人gcg（seq id no:3），以允许至少像每日一次、每周三次、每周两次、每周一次或甚至每月一次这样低频率给药。可使用已知的药代动力学方法，如下文的实施例中描述的那些测量本文中的肠促胰岛素类似物的作用时间分布。
[0043]
本文所用的“非标准氨基酸”是指可能天然存在于细胞中但不参与肽合成的氨基酸。非标准氨基酸可以是肽的成分并可通过修饰肽中的标准氨基酸（即通过翻译后修饰）生成。非标准氨基酸可包括d-氨基酸，其具有上述标准l-氨基酸的相反的绝对手性。
[0044]
本文所用的“饱和”是指不含碳-碳双键或三键的脂肪酸部分。
[0045]
本文所用的“治疗”等是指抑制、减慢、停止或逆转已有病况、疾病、障碍或症状的进展或严重程度。
[0046]
如本文所用并且关于肠促胰岛素类似物，“三重受体激动剂活性”是指在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物，尤其是在各受体处具有平衡和充足活性以提供该受体的激动效益，同时避免与该受体的太高活性相关的不合意副作用的肠促胰岛素类似物。此外，具有三重受体激动剂活性的肠促胰岛素类似物在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有延长的作用持续时间，这有利地允许像每日一次、每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药。
[0047]
某些缩写如下定义：“4pal”是指3-(4-吡啶基)-l-丙氨酸；“acr”是指尿白蛋白/尿肌酐比值；“aib”是指α-氨基异丁酸；“αmel”是指α-甲基亮氨酸；“αmek”是指α-甲基赖氨酸；“αmef”是指α-甲基苯丙氨酸；“αmef(2f)”是指α-甲基2-氟苯丙氨酸；“αmey”是指α-甲基酪氨酸；“amu”是指原子质量单位；“auc”是指曲线下面积；“boc”是指叔丁氧基羰基；“camp”是指环磷酸腺苷；“dmso”是指二甲亚砜；“eia/ria”是指酶免疫测定/放射免疫测定；“fmoc”是指芴甲氧羰基；“hr”是指小时；“htrf”是指均相时间分辨荧光；“iv”是指静脉内；“iva”是指异缬氨酸；“kda”是指千道尔顿；“lc-ms”是指液相色谱-质谱法；“min”是指分钟；“ms”是指质谱法；“orn”或“o”是指鸟氨酸；“otbu”是指o-叔丁基；“pbf”是指ng-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；“rp-hplc”是指反相高效液相色谱法；“sec”是指秒；“sem”是指平均数标准误差；“spa”是指闪烁迫近分析法；“sq”是指皮下；“tfa”是指三氟乙酸；“tbu”是指叔丁基；和“trt”是指三苯甲基。
[0048]
肠促胰岛素类似物本文中的肠促胰岛素类似物的结构特征带来在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有足够活性的化合物，以获得在各受体处的活性（即三重受体激动剂活性）的有利作用，但在任一受体处的活性没有高到压倒在其它两种受体处的活性或在以足以在所有三种受体处产生活性的剂量给药时没有造成不合意的副作用。在某些实施方案中和关于seq id no:5，这样的结构特征的非限制性实例包括在位置6的αmef(2f)，其有助于最佳gcg、gip和glp-1活性；在位置10的y或4pal，其有助于平衡活性；在位置13的l或αmel，其有助于最佳
gcg和gip活性；在位置16的o，其有助于平衡活性；在位置17的酰化，其有助于平衡活性；在位置20的4pal、iva或αmel，其有助于最佳gcg活性；在位置21的a或aib，其有助于最佳gcg活性；在位置25的y或αmey，其有助于平衡活性。这些结构特征的其它实例包括在位置28-39的本文所述的氨基酸，其有助于在所有三种受体处的最佳结合和效力。
[0049]
本文中的肠促胰岛素类似物的结构特征还导致类似物具有与它们作为治疗处理的可发展性（developability）相关的许多其它有益属性，包括改进该类似物在水溶液中的溶解度、改进化学和物理制剂稳定性、延长药代动力学分布（pharmacokinetic profile）和使免疫原性潜力最小化。带来这些属性的特定结构特征的非限制性实例包括在位置17用c
20
脂肪酸酰化，其有助于最佳药代动力学(pk)分布和可发展性；在位置10或20的4pal，其有助于最佳溶解度和化学稳定性；在位置16的o，其有助于最佳溶解度和pk；在位置24的e或e，其有助于最佳溶解度和稳定性；在位置25的y或αmey，其有助于最佳化学稳定性；和在位置39的e或s，其有助于最佳溶解度；和在位置6、13、16和28-39的本文所述的氨基酸，其有助于最佳pk、免疫原性、可发展性和稳定性。
[0050]
应该指出，结构特征的上述列举是示例性的而非全面的，并且本文所述的示例性类似物的有益特征的组合不是单独的任一修饰的结果，而是通过本文所述的结构特征的新颖组合实现的。此外，上述列举的修饰的上述作用不是排他的，因为许多这些修饰也具有如下所述对本文所述的化合物的特征重要的其它作用。
[0051]
本文中的肠促胰岛素类似物的氨基酸序列包含在本文中通常使用单字母代码（例如l = 亮氨酸；k = 赖氨酸）描绘的天然存在的（标准）氨基酸，以及非标准氨基酸和/或标准氨基酸的α-甲基取代的残基（例如αmel、αmek、αmef、αmef(2f)和αmey，和某些其它非标准氨基酸，如4pal、aib、iva、o和d-谷氨酸(e)）。为清楚起见，下面描绘这些其它氨基酸的结构：构：构：。
[0052]
如上所述，本文中的肠促胰岛素类似物与任何天然人肽具有结构相似性但还有许多结构差异。例如，与天然人gip（seq id no:1）相比，肠促胰岛素类似物包括在位置2-3、6-7、13-14、16-18、20-21、23-25和28-42的一个或多个处的修饰。在一些情况下，肠促胰岛素类似物包括在位置2-3、6-7、13-14、16-18、20-21、23-25和28-42各处对天然人gip（seq id no:1）的氨基酸的修饰。在某些情况下，肠促胰岛素类似物包括以下氨基酸修饰：在位置2的aib；在位置3的q；在位置6的αmef(2f)；在位置7的t；在位置10的y或4pal；在位置13的l或αmel；在位置14的l；在位置17的修饰k残基，其用c
16
至c
22
脂肪酸通过缀合到k侧链的ε-氨基上修饰，任选通过使用接头；在位置18的a；在位置20的4pal、iva或αmel；在位置21的a或aib；在位置23的i；在位置24的e或e；在位置25的y或αmey；在位置28的e；在位置29的g；和用以下氨基酸序列替代位置30-42的氨基酸：gpssgapppe（seq id no:12）或gpssgappps（seq id no:13）（和这些任一尾部的截短类似物）。在另一些情况下，肠促胰岛素类似物是酰胺化的。除本文所述的修饰外，肠促胰岛素类似物还可包括一种或多种另外的氨基酸修饰，如添加、删除、插入和/或置换，但保持能够结合到gip、glp-1和gcg受体的每一种上并将其活化。
[0053]
如上所述，本文中的肠促胰岛素类似物包括例如经由接头缀合到具有可供缀合的官能团的标准或非标准氨基酸上的脂肪酸部分。这样的缀合有时被称为酰化。在某些情况下，具有可供缀合的官能团的氨基酸可以是c、d、e、k或q。在特定情况下，具有可供缀合的官能团的氨基酸是k，其中缀合到k侧链的ε-氨基上。
[0054]
本文所述的肠促胰岛素类似物的酰化在seq id no:5中的位置17，这被确定为是并入这一结构的最佳位置。脂肪酸部分和在某些情况下的接头，充当白蛋白粘合剂，并提供生成长效化合物的潜力。
[0055]
本文中的肠促胰岛素类似物利用通过直接键或通过接头化学缀合到氨基酸的官能团上的c
16-c
22
脂肪酸部分。脂肪酸部分的长度和组成影响肠促胰岛素类似物的半衰期、肠促胰岛素类似物在体内动物模型中的效力和肠促胰岛素类似物的溶解度和稳定性。缀合到c
16-c
22
饱和脂肪单酸或二酸上产生表现出理想半衰期、在体内动物模型中的理想效力和理想的可溶性和稳定性特征的肠促胰岛素类似物。
[0056]
本文所用的饱和c
16-c
22
脂肪酸的实例包括但不限于棕榈酸（十六烷酸）（c
16
单酸）、十六烷二酸（c
16
二酸）、珍珠酸（margaric acid）（十七烷酸）（c
17
单酸）、十七烷二酸（c
17
二酸）、硬脂酸（c
18
单酸）、十八烷二酸（c
18
二酸）、十九酸（十九烷酸）（c
19
单酸）、十九烷二酸（c
19
二酸）、花生酸（二十烷酸）（c
20
单酸）、二十烷二酸（c
20
二酸）、二十一酸（二十一烷酸）（c
21
单酸）、二十一烷二酸（c
21
二酸）、山嵛酸（二十二烷酸）（c
22
单酸）、二十二烷二酸（c
22
二酸），包括它们的支化和取代衍生物。
[0057]
在某些情况下，c
16-c
22
脂肪酸可以是饱和c
20
单酸、饱和c
20
二酸及其支化和取代衍生物。在更特别的情况下，c
16-c
22
脂肪酸可以是二十烷二酸。
[0058]
在一些情况下，接头可具有1至4个氨基酸、氨基聚乙二醇羧酸或其混合物。在某些情况下，氨基聚乙二醇羧酸具有下列结构：其中m是1至12的任何整数，n是1至12的任何整数，且p是1或2。
[0059]
在某些情况下，接头可具有一个或多个aeea部分，任选与1至4个氨基酸组合。
[0060]
在接头包括至少一个氨基酸的情况下，该氨基酸可以是1至4个e或γe氨基酸残基。在一些情况下，接头可包括一个或两个e或γe氨基酸残基，包括其d形式。例如，接头可包括一个或两个γe氨基酸残基。或者，接头可包括与最多36个aeea部分组合使用的1至4个氨基酸残基（例如e或γe氨基酸）。具体地，接头可以是1至4个e或γe氨基酸和1至4个aeea部分的组合。在另一些情况下，接头可以是一个或两个γe氨基酸和一个或两个aeea部分的组合。
[0061]
在一种具体情况下，本文中的肠促胰岛素类似物含有具有下列结构的接头-脂肪酸部分：((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)
a-(γe)
b-co-(ch2)
c-co2h,其中a是0、1或2，b是1或2，且c是16或18。在一种特定情况下，a是1，b是1，且c是20，其具有下列结构：。
[0062]
如下列实施例1-3的化学结构中所示，上述接头-脂肪酸部分可连接到k侧链的epsilon (ε)-氨基上。
[0063]
可使用本领域中已知的测量受体结合水平的技术，包括例如以下实施例中描述的那些技术测量本文中的肠促胰岛素类似物对gip、glp-1和gcg受体的每一种的亲和力，并通常表示为抑制常数(ki)值。也可使用本领域中已知的技术，包括例如下述体外活性测定法测量肠促胰岛素类似物在各受体处的活性，并通常表示为有效浓度50 (ec
50
)值，这是在剂量响应曲线中造成半最大模拟（half-maximal simulation）的化合物浓度。
[0064]
本文中的肠促胰岛素类似物可配制为药物组合物，其可通过肠胃外途径（例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内或透皮）给药。这样的药物组合物及其制备技术是本领域中公知的。参见例如remington: the science and practice of pharmacy (troy, ed., 第21版, lippincott, williams & wilkins, 2006)。在特定情况下，肠促胰岛素类似物皮下给药。
[0065]
本文中的肠促胰岛素类似物可与几种无机和有机酸/碱的任一种反应以形成可药用酸/碱加成盐。可药用盐及其常用制备技术是本领域中公知的（参见例如stahl等人, handbook of pharmaceutical salts: properties, selection and use, 第2修订版(wiley-vch, 2011)）。本文所用的可药用盐包括但不限于钠盐、三氟乙酸盐、盐酸盐和乙酸盐。
[0066]
本公开还提供了并因此包括合成本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的新型中间体和方法。本文中的中间体和肠促胰岛素类似物可通过本领域已知的各种技术制备。例如，在以下实施例中例示了使用化学合成的方法。所述各路线的具体合成步骤可以不同方式组合以制备本文中的肠促胰岛素类似物。试剂和原材料是本领域技术人员易得的。
[0067]
本文中的某些肠促胰岛素类似物通常在宽剂量范围内有效。例如，用于每周一次给药的剂量可落在大约0.01至大约30 mg/个体/周的范围内、在大约0.1至大约10 mg/个体/周的范围内或甚至在大约0.1至大约3 mg/个体/周的范围内。因此，本文中的肠促胰岛素类似物可每日、每周三次、每周两次或每周一次给药，尤其是每周一次给药。
[0068]
本文中的肠促胰岛素类似物可用于治疗各种病况、障碍、疾病或症状。特别地，提供了治疗个体的t2dm的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0069]
另外，提供了治疗个体的血脂异常的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0070]
另外，提供了治疗个体的代谢综合征的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0071]
另外，提供了治疗个体的nafld的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0072]
另外，提供了治疗个体的nash的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0073]
另外，提供了治疗个体的肥胖的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0074]
另外，提供了诱发个体的非治疗性体重减轻的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0075]
另外，提供了治疗不被视为代谢疾病的心血管疾病的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0076]
另外，提供了治疗神经退行性疾病的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0077]
在这些方法中，可以通过例如观察血糖的显著降低、观察胰岛素的显著增加、观察hba1c的显著降低、观察血脂的显著降低、观察体重或体脂的显著降低和/或观察身体组成的变化来评估本文中的肠促胰岛素类似物的有效性。
[0078]
或者，本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐可用于改善需要其的个体的骨强度。在一些情况下，需要其的个体具有骨生成不足（hypoostosis）或骨质缺乏症（hypoosteoidosis），或正从骨折、矫形手术、假肢植入、牙植入和/或脊柱融合术中愈合。肠促胰岛素类似物也可用于治疗其它障碍，如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。
实施例
[0079]
为了举例说明而非限制，提供以下非限制性实施例。
[0080]
多肽合成实施例1: 肠促胰岛素类似物1的合成实施例1是下列描述代表的化合物：yaibqgt-αmef(2f)-tsdysilldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-γe-co-(ch2)
18-co2h)aq-4pal-afieylleggpssgepppe-nh
2 (seq id no:9)。
[0081]
下面除残基aib2、αmef(2f)6、o16、k17、4pal20和e39外使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例1的结构，其中已展开这些氨基酸残基的结构：
[0082]
在symphony x肽合成仪(gyros protein technologies；tucson, az)上使用fmoc/t-bu化学合成实施例1的肽骨架。
[0083]
树脂是在0.3-0.4 meq/g的取代度下的1% dvb交联的聚苯乙烯（fmoc-rink-mbha低载量树脂，100-200目；emd millipore）。使用标准侧链保护基，以下除外。fmoc-lys
(mtt)-oh用于位置17的k，boc-tyr(tbu)-oh)用于位置1的y。在各偶联步骤(2 x 7分钟)前使用20%哌啶/dmf除去fmoc基团。所有标准氨基酸偶联使用等摩尔比的fmoc氨基酸（0.3 mm）、二异丙基碳二亚胺（0.9 mm）和oxyma（0.9 mm）在相对于理论肽载量9倍摩尔过量下进行1小时（偶联到伯胺）和3小时（偶联到仲胺）。例外是偶联到cα-甲基化氨基酸，其偶联3小时。在完成肽骨架的合成后，树脂用dcm充分洗涤6次以除去残余dmf。使用30%六氟异丙醇（oakwood chemicals）/dcm的两次处理（2 x 40分钟处理）从肽树脂中选择性除去在位置17的k上的mtt保护基。
[0084]
通过2-[2-(2-fmoc-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸（fmoc-aeea-oh, chempep, inc.）、fmoc-谷氨酸α-t-丁基酯（fmoc-e-otbu, ark pharm, inc.）和单-otbu-二十烷酸（wuxi apptec, shanghai, china）的偶联实现脂肪酸-接头部分的随后连接。3倍过量的试剂（aa: pyaop: dipea=1: 1 :1 mol/mol）用于每个偶联1小时。
[0085]
在合成完成后，用dcm洗涤肽树脂，然后充分晾干。干燥树脂用10毫升裂解混合物（cleavage cocktail）（tfa:三异丙基甲硅烷:水，92.5:2.5:5体积比）在40℃下处理30分钟。滤出树脂，各用2毫升纯tfa洗涤两次，合并的滤液用5倍过量体积的冷乙醚（-20℃）处理以沉淀粗制肽。肽/乙醚悬浮液然后在3500 rpm下离心2分钟以形成固体团块（pellet），滗析上清液，固体团块用冷乙醚研制另外两次并在真空中干燥。将粗制肽溶解在20%乙腈/20%乙酸/60%水中并通过在luna 5
ꢀµ
m苯基-己基制备柱（21 x 250 mm；phenomenex）上用100%乙腈和0.1% tfa/水缓冲体系的线性梯度（30-50%乙腈，在60 min内）的rp-hplc提纯。使用分析rp-hplc评估肽的纯度并且合并标准（pooling criteria）是》95%。发现实施例1的主要合并纯度（pool purity）为》98.0%。最终主要产物合并物的随后冻干产生冻干的肽tfa盐。通过lc-ms测定分子量（观测值: m 3 =1633.7；计算值m 3 =1633.8）。
[0086]
实施例2: 肠促胰岛素类似物2的合成实施例2是下列描述代表的化合物：yaibqgt-αmef(2f)-tsdysi-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-γe-co-(ch2)
18-co2h)aq-iva-afie-αmey-lleggpssgeppps-nh
2 (seq id no:10)。
[0087]
下面除残基aib2、αmef(2f)6、αmel13、o16、k17、iva20、αmey25和s39外使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例2的结构，其中已展开这些氨基酸残基的结构：
[0088]
使用与上文对实施例1所述类似的方法合成肽骨架、缀合脂肪酸-接头部分、检查纯度和确认实施例2的分子量。
[0089]
实施例3: 肠促胰岛素类似物3的合成实施例3是下列描述代表的化合物：yaibqgt-αmef(2f)-tsd-4pal-si-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-γe-co-(ch2)
18-co2h)aq-αmel-aib-fie-αmey-lleggpssgeppps-nh
2 (seq id no:
11)。
[0090]
下面除残基aib2、αmef(2f)6、4pal10、αmel13、o16、k17、αmel20、aib21、e24、αmey25和s39外使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例3的结构，其中已展开这些氨基酸残基的结构：
[0091]
使用与上文对实施例1所述类似的方法合成肽骨架、缀合脂肪酸-接头部分、检查
cat# 35050）、0.1%牛酪蛋白（sigma c4765-10ml）、250
ꢀµ
m ibmx（3-异丁基-1-甲基黄嘌吟, acros cat# 228420010）和20 mm hepes（gibco cat# 15630）的dmem（gibco cat# 31053）中用对照多肽或实施例1至3之一（在dmso中的20点浓度-响应曲线，2.75倍labcyte echo直接稀释，384孔板corning cat# 3570）处理表达hgipr、hglp-1r或hgcgr受体的细胞。也在添加了1.0%无脂肪酸、无球蛋白的人血清白蛋白（sigma cat# a3782）的相同测定条件下进行实验。
[0100]
在37℃下温育30分钟后，使用cisbio camp dynamic 2 htrf检测试剂盒(62am4pej)定量测定所造成的细胞内camp的增加。简言之，通过加入在细胞裂解缓冲液（10
ꢀµ
l）中的camp-d2缀合物，接着加入也在细胞裂解缓冲液（10
ꢀµ
l）中的抗体抗-camp-eu
3 -穴状化合物，检测细胞内的camp水平。所得竞争分析在室温下温育至少60分钟，然后使用perkinelmer envision
®
仪器在320 nm的激发和在665 nm和620 nm的发射下检测。envision单位（在665nm/620nm的发射*10,000）与存在的camp的量成反比并使用camp标准曲线换算成每孔的nm camp。将在每个孔中生成的camp量（nm）换算成用人gip(1-42)nh2、hglp-1(7-36)nh2或hgcg观察到的最大响应的百分比。使用最大响应百分比 vs. 添加的肽浓度通过非线性回归分析推导出相对ec
50
值和% top（e
max
），拟合到四参数对数方程中。
[0101]
结果: 下面在表3（0.1%牛酪蛋白）和表4（0.1%牛酪蛋白、1.0%人血清白蛋白）中提供hgip(1-42)nh2、hglp-1(7-36)nh2、hgcg和实施例化合物的功能数据。
[0102]
表3: 在37℃下（在0.1%牛酪蛋白存在下）温育的肽的功能camp效力（ec
50
）和功效（e
max
）注: a 使用[
125
i]glp-1(7-36)nh2在hglp-1r处（112 fmol/mg蛋白质）、[
125
i]gcg在hgcgr处（98 fmol/mg蛋白质）和[
125
i]gip(1-42)在hgipr处（124 fmol/mg 蛋白质）的同源竞争结合测定表达密度。
b ec
50
, nm = 具有平均数标准误差的几何平均数，后接在括号中的观察次数。
c e
max
, %= 在hglp-1r处对glp-1(7-36)nh2、在hgcgr处对gcg或在hgipr处对gip(1-42)nh2的最大响应百分比的算术平均数
ꢀ±ꢀ
平均数标准误差。显示的所有值到三位(3)有效位数。
[0103]
表4: 在37℃下（在0.1%牛酪蛋白和1.0%人血清白蛋白存在下）温育的肽的功能camp效力（ec
50
）和功效（e
max
）注: a 使用[
125
i]glp-1(7-36)nh2在hglp-1r处（112 fmol/mg蛋白质）、[
125
i]gcg在hgcgr处（98 fmol/mg蛋白质）和[
125
i]gip(1-42)在hgipr处（124 fmol/mg 蛋白质）的同源竞争结合测定表达密度。
b ec
50
, nm = 具有平均数标准误差的几何平均数，后接在括号中的观察次数。
c e
max
, %= 在hglp-1r处对glp-1(7-36)nh2、在hgcgr处对gcg或在hgipr处对gip(1-42)nh2的最大响应百分比的算术平均数
ꢀ±ꢀ
平均数标准误差。显示的所有值到三位(3)有效位数。
[0104]
如表3中所见，在0.1%酪蛋白存在下，实施例化合物刺激来自hglp-1r、hgcgr和hgipr的camp。
[0105]
如表4中所见，在0.1%牛酪蛋白和1%人血清白蛋白存在下，实施例化合物刺激来自hglp-1r、hgcgr和hgipr的camp。
[0106]
体内功能实施例6: 在雄性饮食诱导肥胖（dio）小鼠中的药代动力学方法: 在含有0.02% ps80的40 mm tris-hcl ph8缓冲液中的200 nmol/kg（0.98 mg/kg）单次sq剂量的实施例化合物以10 ml/kg的体积给药于雄性dio小鼠。在给药后1、3、6、12、24、48和72小时收集血液进行药代动力学表征。在q squared solutions biosciences llc (ithaca, ny)通过合格的液相色谱质谱法（lc/ms）测定实施例化合物的血浆浓度。使用蛋白质沉淀、然后固相萃取从100%小鼠血浆中提取实施例化合物和内标。通过q-exactive
™ꢀ
orbitrap
®
质谱仪检测包括肽和酰基链的实施例化合物的完整质量。
[0107]
结果: 下面在表5中提供实施例化合物的数据。
[0108]
表5: 在单次200 nmol/kg皮下给药于雄性dio小鼠后的平均血浆药代动力学参数
注: 缩写: t
1/2 = 半衰期，t
max = 达到最大浓度的时间，c
max = 最大观察血浆浓度，auc
0-inf = 从时间0小时至无穷大的曲线下面积，cl/f = 清除率/生物利用度。n=3只动物/组/时间点。
[0109]
如表5中所见，实施例化合物在dio小鼠中表现出延长的药代动力学分布。
[0110]
实施例7: 对雄性wistar大鼠中的胰岛素分泌的体内作用方法: 使用在雄性wistar大鼠中的静脉葡萄糖耐量试验（ivgtt）评估实施例化合物的促胰岛素效力。使用glp-1r激动剂索马鲁肽（semaglutide）作为阳性对照。在带有滤气顶的聚碳酸酯笼中每笼一只圈养在颈静脉和颈动脉中手术植入套管的大鼠（envigo；indianapolis, in，280-320克）。大鼠在21℃下维持12小时光暗循环并随意获取2014 teklad global饮食（envigo）和去离子水。大鼠按体重随机分配并在给予葡萄糖之前16小时皮下给予1.5 ml/kg实施例化合物，然后禁食。211 nm/ml的储备浓度的实施例化合物在含0.02% ps80的40mm tris-hcl缓冲液ph 8.0中稀释到所需给药浓度；受试剂量是媒介物、0.1、0.3、1、3、10和30 nm/kg。与实施例化合物（10 nm/kg剂量）的每次运行（run）关联地使用索马鲁肽作为阳性对照。
[0111]
在时间0将血样收集到edta管中，此后给予葡萄糖（0.5 mg/kg, 5 ml/kg）。在静脉给予葡萄糖后2、4、6、10、20和30分钟收集血样以测定葡萄糖和胰岛素水平。使用电化学发光分析法（meso scale；rockville, md）测定血浆胰岛素。与媒介物对照比较地检查胰岛素auc，n = 每组6只动物。
[0112]
使用jmp用单因素anova，接着与媒介物对照的dunnett’s比较进行统计分析。
[0113]
结果: 下面在表6中提供实施例化合物的数据。
[0114]
表6:在wistar大鼠中的ivgtt过程中媒介物、索马鲁肽（sema，10 nmol/kg）和实施例化合物对胰岛素分泌的影响
注: 结果表示为每组6只大鼠的平均数
ꢀ±ꢀ
平均数标准误差（sem）。统计试验是单因素anova，接着dunnett’s与媒介物相比*p《0.05；与索马鲁肽相比 p《0.05。
[0115]
如表6中所见，实施例化合物剂量依赖性地增加胰岛素分泌。
[0116]
实施例8: 在dio c57/b16小鼠中对体重减轻、代谢和身体组成的体内研究方法: 为了研究实施例化合物对如体重减轻、代谢和身体组成之类参数的影响，将实施例化合物给药于c57bl6 dio小鼠。在置于高脂肪饮食20周后，这些动物尽管没有糖尿病，但表现出胰岛素抵抗和血脂异常，这些都是代谢综合征的特征。
[0117]
在此，在下列研究中使用依赖高热量饮食的20周龄的dio雄性c57/bl6小鼠。动物单只圈养在温度受控（23℃至26℃）的设施中，具有12小时光暗循环（在21:00点灯）并随意获取食物（td95217）和水。在适应该设施3周后（包括1周的媒介物驯化给药），小鼠根据它们的体重随机分配，因此各实验组的动物具有类似体重。体重为40 g至51 g。
[0118]
所有组包含6只小鼠。每天在黑暗周期开始前30分钟至120分钟将实施例化合物和索马鲁肽溶解在媒介物（40 mm tris-hcl，ph 8.0，含0.02% ps-80）中并通过sq注射（10 ml/kg）给药于自由进食的dio小鼠，持续14天（第1至14天）。在研究全程每天测量体重和食物摄入，包括在最后一次给药后1天（第15天）。
[0119]
通过减去在第一次注射分子前同一动物的体重，计算体重的绝对变化。在第0和15天，通过使用echo medical system（houston, tx）仪器的核磁共振（nmr）测量总脂肪质量。在第15天，使用accu-chek
®ꢀ
aviva
®
血糖仪（roche；indianapolis, in）或hitachi临床血液分析仪（roche, indianapolis, in）测量代谢参数。使用电化学发光分析法（meso scale discovery, rockville, md）测定血浆胰岛素。
[0120]
数据作为每组6只动物的平均数
ꢀ±ꢀ
sem显示在下表7和8中。使用重复测量anova、接着用于多重比较的dunnett’s方法进行统计分析。p《0.05的显著性差异被认定为*。
[0121]
结果: 下面在表7和8中提供实施例化合物的数据。
[0122]
表7. 在用索马鲁肽和实施例化合物治疗后在15天后的体重变化
注:
ꢀ“
δ体重(g)”是指在试验组和媒介物组之间在第15天的体重差异。“δ体重(%)”是指在试验组中在第1天和第15天之间的体重下降百分比。“脂肪质量(%)”是指在试验组中在第0天和第15天之间的脂肪质量差异。“sema”是指索马鲁肽。所有数据来自单一代表性研究。记录接受媒介物的动物的体重和脂肪质量的变化百分比，并在各研究中小于2%。除在低剂量0.15625 nmol/kg下的实施例肽外，对于索马鲁肽和所有实施例，在所有受试剂量下，“δ体重(g)”、“δ体重(%)”和“δ脂肪质量(%)”都在统计上显著不同于（*, p《0.05）对照。
[0123]
如表7中所见，实施例化合物剂量依赖性地降低体重和脂肪质量。
[0124]
表8: 用实施例化合物治疗对15天后的血糖、胰岛素、总胆固醇和甘油三酯的影响
注: 所有数据参考试验组和媒介物组之间在第15天的差异，并来自单一代表性研究。“sema”是指索马鲁肽。与媒介物组相比*p《0.05；单因素anova，dunnett’s。
[0125]
如表8中所见，实施例化合物也降低血糖、胰岛素（作为提高胰岛素敏感度的标志）、胆固醇和甘油三酯。
[0126]
序列表在上文的公开中提到以下核酸和/或氨基酸序列，并在下面提供以供参考。
[0127]
seq id no:1
ꢀ–
人gipseq id no:2
ꢀ–
人glp-1
7-36
酰胺seq id no:3
ꢀ–
人胰高血糖素
seq id no:4
ꢀ–
人oxmseq id no:5
ꢀ–
肠促胰岛素类似物其中：x2是aib，x6是αmef(2f),x
10
可以是y或4pal，x
13
可以是l或αmel，x
16
是orn，x
17
是任何具有可供缀合的官能团的氨基酸，x
20
可以是4pal、iva或αmel，x
21
可以是a或aib，x
24
可以是e或e，x
25
可以是y或αmey，且x
39
可以是e或sseq id no:6
ꢀ–
肠促胰岛素类似物seq id no:7
ꢀ–
肠促胰岛素类似物seq id no:8
ꢀ–
肠促胰岛素类似物seq id no:9
ꢀ–
肠促胰岛素类似物y-aib-qgt-αmef(2f)-tsdysilldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基seq id no:10
ꢀ–
肠促胰岛素类似物y-aib-qgt-αmef(2f)-tsdysi-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基seq id no:11
ꢀ–
肠促胰岛素类似物y-aib-qgt-αmef(2f)-tsd-4pal-si-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基seq id no:12
ꢀ–
人工序列seq id no:13
ꢀ–
人工序列
seq id no:14
ꢀ–
人gip受体seq id no:15
ꢀ–
人glp-1受体seq id no:16
ꢀ–
人gcg受体
ü
ller等人(2017) physiol. rev. 97:721-766；finan等人(2013) sci. transl. med. 5:209；h
ö
lscher (2014) biochem. soc. trans. 42:593-600。
7.但是，仍然需要能够提供有效血糖控制、具有减重益处和/或有利的副作用状况（side effect profile）的对这些病况、疾病和障碍，尤其是t2dm的疗法。还需要可以足够长的作用持续时间使用以允许像每日一次、每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药的治疗剂。
8.本文中的肠促胰岛素类似物试图满足上述需要。相应地，本公开描述了在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物。有利地，本文中的肠促胰岛素类似物在这些受体处具有平衡活性，因此允许所给剂量在各受体处提供足够的活性以提供该受体的激动效益，同时避免与太高活性相关的不合意副作用。此外，本文中的肠促胰岛素类似物在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有延长的作用持续时间以允许像每日一次、每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药。以这种方式，该肠促胰岛素类似物带来增强的血糖控制、代谢益处如体重降低和/或改善身体组成、脂质益处如降低前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）/kexin type 9（pcsk9），和/或其它益处如增加骨量或骨形成或减少骨吸收。本公开还描述了对包括t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和/或肥胖在内的病况、疾病和障碍的有效治疗。
9.相应地，本公开首先描述了肠促胰岛素类似物或其可药用盐，所述肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：其中x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是y或4pal，x
13
是l或αmel，x
16
是o，x
17
是任何具有可供缀合的官能团的氨基酸，并且所述官能团缀合到c
16-c
22
脂肪酸部分上，x
20
是4pal、iva或αmel，x
21
是a或aib，x
24
是e或e，x
25
是y或αmey，且x
39
是e或s（seq id no:5），并且其中羧基末端（c末端）氨基酸任选酰胺化。
10.在一些情况下，在位置x
17
的具有可供缀合的官能团的氨基酸是c、d、e、k或q。在某些情况下，在位置x
17
的具有可供缀合的官能团的氨基酸是k。
11.在某些情况下，x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是y，x
13
是l，x
16
是o，x
17
是k，x
20
是4pal，x
21
是a，x
24
是e，x
25
是y且x
39
是e，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：是e，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：。
12.在某些情况下，x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是y，x
13
是αmel，x
16
是o，x
17
是k，x
20
是iva，x
21
是a，x
24
是e，x
25
是αmey且x
39
是s，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：列：。
13.在某些情况下，x2是aib，x6是αmef(2f)，x
10
是4pal，x
13
是αmel，x
16
是o，x
17
是k，x
20
是αmel，x
21
是aib，x
24
是e，x
25
是αmey且x
39
是s，以使该肠促胰岛素类似物包括以下碱基氨基酸序列：
。
14.在一些情况下，c
16-c
22
脂肪酸部分经由接头缀合到具有可供缀合的官能团的氨基酸上。在某些情况下，c
16-c
22
脂肪酸部分具有结构-co-(ch2)
a-co2h，其中a是16至22的整数。在某些情况下，该脂肪酸部分是c
18
二酸或c
20
。同样地和在一些情况下，该接头是[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]]-乙酰基（aeea）、氨基己酸（ahx）、e、γ-谷氨酸（γe）或其组合的一个或多个单元。
[0015]
在特定情况下，本文中的肠促胰岛素类似物，包括接头和脂肪酸部分，可以是以下之一：
(seq id no:9),(seq id no:10)，或
(seq id no:11)。
[0016]
其次，描述了药物组合物，其包含至少一种本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐（例如三氟乙酸盐、乙酸盐或盐酸盐）和可药用载体。在一些情况下，该药物组合物可进
一步包含载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0017]
第三，描述治疗疾病如t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和肥胖的方法。这样的方法可包括至少给予需要其的个体有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物的步骤。在一些情况下，该疾病是t2dm、nafld、nash或肥胖。在另一些情况下，该疾病是不被视为代谢疾病的心血管疾病和神经退行性疾病。
[0018]
在一些情况下，本文中的所述至少一种肠促胰岛素类似物可皮下（sq）给药于个体。同样地和在一些情况下，所述至少一种肠促胰岛素类似物可每日、每隔一日、每周三次、每周两次、每周一次（即每周）、每两周一次（即每隔一周）或每月一次给药。在某些情况下，所述至少一种肠促胰岛素类似物可每隔一日皮下给药、每周三次皮下给药、每周两次皮下给药、每周一次皮下给药、每隔一周皮下给药或每月一次皮下给药。在特定情况下，所述至少一种肠促胰岛素类似物每周一次（qw）皮下给药。
[0019]
该方法还可包括如下步骤：测量或获得个体的体重或身体组成和/或血糖和/或血胰岛素和/或血红蛋白a1c（hba1c）和/或血脂，然后将由此获得的值与一个或多个基线值或先前获得的值比较以评估治疗的有效性。
[0020]
在一些情况下，个体是肥胖或超重的。在另一些情况下，个体是糖尿病（pwd），尤其是t2dm的患者。在某些情况下，个体是肥胖并伴有t2dm的，或超重并伴有t2dm的。
[0021]
该方法也可与饮食和锻炼结合和/或可与另外的治疗剂组合。
[0022]
第四，肠促胰岛素类似物被描述用于疗法，如用于治疗疾病如t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和肥胖。在一些情况下，该疾病是t2dm、nafld、nash或肥胖。在另一些情况下，该疾病是不被视为代谢疾病的心血管疾病和神经退行性疾病。
[0023]
第五，描述了本文中的肠促胰岛素类似物在制备用于治疗t2dm、血脂异常、代谢综合征、nafld、nash和肥胖的药物中的用途。在一些情况下，该疾病是t2dm、nafld、nash或肥胖。在另一些情况下，该疾病是不被视为代谢疾病的心血管疾病和神经退行性疾病。
[0024]
除非另行规定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管在肠促胰岛素类似物、药物组合物和方法的实践或测试中可使用与本文中描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但在本文中描述了优选的方法和材料。
[0025]
此外，由不定冠词“一”提到一要素不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文清楚地要求有一个且只有一个要素。不定冠词“一”因此通常是指“至少一个”。
[0026]
定义本文所用的“大约”是指在数值例如指定浓度、长度、分子量、ph、序列一致性、时间范围、温度或体积的统计学有意义的范围内。这样的数值或范围可在给定数值或范围的通常20%内，更通常10%内，再更通常5%内的量级内。“大约”所涵盖的容许偏差取决于受研究的特定体系，并且是本领域技术人员容易认识到的。
[0027]
如本文所用并且关于gip、glp-1或gcg受体的一种或多种，“活性”、“活化”、“激活”等是指如使用本领域中已知的测定法，如下述体外测定法测得的化合物如本文中的肠促胰岛素类似物结合到受体上并在受体处诱发响应的能力。
[0028]
本文所用的“氨基酸”是指从化学角度看以含有一个或多个胺基团和一个或多个羧酸基团为特征并可能含有其它官能团的分子。如本领域中已知，有一组20种氨基酸被指
定为标准氨基酸并用作任何生物生成的大多数肽/多肽/蛋白质的结构单元。
[0029]
本文所用的“具有可供缀合的官能团的氨基酸”是指具有可借助例如接头缀合到脂肪酸部分上的官能团的任何标准或非标准氨基酸。这样的官能团的实例包括但不限于炔基、烯基、氨基、叠氮基、溴、羧基、氯、碘和巯基基团。另外，包括这样的官能团的标准氨基酸的实例包括c（巯基）、d（羧基）、e（羧基）、k（氨基）和q（酰胺）。
[0030]
本文所用的“类似物”是指活化靶受体并引发至少一种由天然受体激动剂引发的体内或体外效应的化合物，如合成肽或多肽。
[0031]
本文所用的“不被视为代谢疾病的心血管疾病”等是指例如动脉粥样硬化或心力衰竭之类的疾病。
[0032]
本文所用的“c
16-c
22
脂肪酸”是指具有16至22个碳原子的羧酸。适用于本文的c
16-c
22
脂肪酸可以是饱和单酸或饱和二酸（“二酸”在每端具有羧基）。
[0033]
本文所用的“有效量”是指在单剂或多剂给药于需要其的个体时在被诊断或治疗的这种个体中提供所需作用（即可产生临床可测量的个体状况的差异，例如血糖降低、hba1c降低、体重或体脂降低和/或身体组成变化）的一种或多种本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的量、浓度或剂量。本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果容易确定有效量。在确定对个体而言有效的量时，考虑许多因素，包括但不限于哺乳动物的物种、其体型、年龄和一般健康状况、涉及的特定疾病或障碍、疾病或障碍的涉入程度或严重程度、个体的响应、给予的特定肠促胰岛素类似物、给药模式、给予的制剂的生物利用度特征、所选给药方案、伴随药物治疗的使用和其它相关情况。
[0034]
本文所用的“延长的作用持续时间”是指肠促胰岛素类似物的结合亲和力和活性的持续时间大于天然人gip、glp-1和gcg，以允许至少像每日一次或甚至每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药。可使用已知的药代动力学试验方法，如下文的实施例中所用的那些测量肠促胰岛素类似物的作用时间分布（time action profile）。
[0035]
本文所用的“葡萄糖依赖性促胰岛素多肽”或“gip”是指一种42-氨基酸肽（seq id no:1），其是一种肠促胰岛素，通过刺激在葡萄糖存在下从胰腺β细胞分泌胰岛素而在葡萄糖稳态中发挥生理作用。
[0036]
本文所用的“胰高血糖素样肽-1”或“glp-1”是指一种36-氨基酸肽（seq id no:2），其也是一种肠促胰岛素，刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌并且已表明防止糖尿病患者的高血糖。
[0037]
本文所用的“胰高血糖素”或“gcg”是指一种29-氨基酸肽（seq id no:3），其通过结合到肝细胞上的gcg受体上并将其活化以使肝通过所谓的糖原分解过程释放以糖原形式储存的葡萄糖而有助于维持血糖。
[0038]
本文所用的“胃泌酸调节素”或“oxm”是指一种37-氨基酸肽（seq id no:4），其不仅包括gcg的29-氨基酸序列，还包括八肽羧基末端延伸，其激活gcg和glp-1受体，对gcg受体的效力略高于glp-1受体。
[0039]
本文所用的“半最大效应浓度”或“ec
50”是指带来检测终点如剂量响应曲线（例如camp）的50%活化/刺激的化合物浓度。
[0040]
本文所用的“肠促胰岛素类似物”是指与gip、glp-1和gcg，尤其是人gip（seq id no:1）、人glp-1（seq id no:2）和人gcg（seq id no:3）的每一种具有结构相似性但还有许
多差异的化合物。本文中的肠促胰岛素类似物包括导致该化合物对gip、glp-1和gcg受体的每一种具有亲和力和活性（即三重受体激动剂活性）的氨基酸序列。
[0041]
本文所用的“需要其的个体”是指具有需要处理或治疗的病况、疾病、障碍或症状，包括例如本文中列举的那些的哺乳动物，如人类。特别地，要治疗的优选个体是人类。
[0042]
本文所用的“长效”是指本文中的肠促胰岛素类似物的结合亲和力和活性的持续时间大于参考肽，如天然人gip（seq id no:1）、人glp-1（seq id no:2）和/或人gcg（seq id no:3），以允许至少像每日一次、每周三次、每周两次、每周一次或甚至每月一次这样低频率给药。可使用已知的药代动力学方法，如下文的实施例中描述的那些测量本文中的肠促胰岛素类似物的作用时间分布。
[0043]
本文所用的“非标准氨基酸”是指可能天然存在于细胞中但不参与肽合成的氨基酸。非标准氨基酸可以是肽的成分并可通过修饰肽中的标准氨基酸（即通过翻译后修饰）生成。非标准氨基酸可包括d-氨基酸，其具有上述标准l-氨基酸的相反的绝对手性。
[0044]
本文所用的“饱和”是指不含碳-碳双键或三键的脂肪酸部分。
[0045]
本文所用的“治疗”等是指抑制、减慢、停止或逆转已有病况、疾病、障碍或症状的进展或严重程度。
[0046]
如本文所用并且关于肠促胰岛素类似物，“三重受体激动剂活性”是指在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物，尤其是在各受体处具有平衡和充足活性以提供该受体的激动效益，同时避免与该受体的太高活性相关的不合意副作用的肠促胰岛素类似物。此外，具有三重受体激动剂活性的肠促胰岛素类似物在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有延长的作用持续时间，这有利地允许像每日一次、每周三次、每周两次或每周一次这样低频率给药。
[0047]
某些缩写如下定义：“4pal”是指3-(4-吡啶基)-l-丙氨酸；“acr”是指尿白蛋白/尿肌酐比值；“aib”是指α-氨基异丁酸；“αmel”是指α-甲基亮氨酸；“αmek”是指α-甲基赖氨酸；“αmef”是指α-甲基苯丙氨酸；“αmef(2f)”是指α-甲基2-氟苯丙氨酸；“αmey”是指α-甲基酪氨酸；“amu”是指原子质量单位；“auc”是指曲线下面积；“boc”是指叔丁氧基羰基；“camp”是指环磷酸腺苷；“dmso”是指二甲亚砜；“eia/ria”是指酶免疫测定/放射免疫测定；“fmoc”是指芴甲氧羰基；“hr”是指小时；“htrf”是指均相时间分辨荧光；“iv”是指静脉内；“iva”是指异缬氨酸；“kda”是指千道尔顿；“lc-ms”是指液相色谱-质谱法；“min”是指分钟；“ms”是指质谱法；“orn”或“o”是指鸟氨酸；“otbu”是指o-叔丁基；“pbf”是指ng-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；“rp-hplc”是指反相高效液相色谱法；“sec”是指秒；“sem”是指平均数标准误差；“spa”是指闪烁迫近分析法；“sq”是指皮下；“tfa”是指三氟乙酸；“tbu”是指叔丁基；和“trt”是指三苯甲基。
[0048]
肠促胰岛素类似物本文中的肠促胰岛素类似物的结构特征带来在gip、glp-1和gcg受体的每一种处具有足够活性的化合物，以获得在各受体处的活性（即三重受体激动剂活性）的有利作用，但在任一受体处的活性没有高到压倒在其它两种受体处的活性或在以足以在所有三种受体处产生活性的剂量给药时没有造成不合意的副作用。在某些实施方案中和关于seq id no:5，这样的结构特征的非限制性实例包括在位置6的αmef(2f)，其有助于最佳gcg、gip和glp-1活性；在位置10的y或4pal，其有助于平衡活性；在位置13的l或αmel，其有助于最佳
gcg和gip活性；在位置16的o，其有助于平衡活性；在位置17的酰化，其有助于平衡活性；在位置20的4pal、iva或αmel，其有助于最佳gcg活性；在位置21的a或aib，其有助于最佳gcg活性；在位置25的y或αmey，其有助于平衡活性。这些结构特征的其它实例包括在位置28-39的本文所述的氨基酸，其有助于在所有三种受体处的最佳结合和效力。
[0049]
本文中的肠促胰岛素类似物的结构特征还导致类似物具有与它们作为治疗处理的可发展性（developability）相关的许多其它有益属性，包括改进该类似物在水溶液中的溶解度、改进化学和物理制剂稳定性、延长药代动力学分布（pharmacokinetic profile）和使免疫原性潜力最小化。带来这些属性的特定结构特征的非限制性实例包括在位置17用c
20
脂肪酸酰化，其有助于最佳药代动力学(pk)分布和可发展性；在位置10或20的4pal，其有助于最佳溶解度和化学稳定性；在位置16的o，其有助于最佳溶解度和pk；在位置24的e或e，其有助于最佳溶解度和稳定性；在位置25的y或αmey，其有助于最佳化学稳定性；和在位置39的e或s，其有助于最佳溶解度；和在位置6、13、16和28-39的本文所述的氨基酸，其有助于最佳pk、免疫原性、可发展性和稳定性。
[0050]
应该指出，结构特征的上述列举是示例性的而非全面的，并且本文所述的示例性类似物的有益特征的组合不是单独的任一修饰的结果，而是通过本文所述的结构特征的新颖组合实现的。此外，上述列举的修饰的上述作用不是排他的，因为许多这些修饰也具有如下所述对本文所述的化合物的特征重要的其它作用。
[0051]
本文中的肠促胰岛素类似物的氨基酸序列包含在本文中通常使用单字母代码（例如l = 亮氨酸；k = 赖氨酸）描绘的天然存在的（标准）氨基酸，以及非标准氨基酸和/或标准氨基酸的α-甲基取代的残基（例如αmel、αmek、αmef、αmef(2f)和αmey，和某些其它非标准氨基酸，如4pal、aib、iva、o和d-谷氨酸(e)）。为清楚起见，下面描绘这些其它氨基酸的结构：构：构：。
[0052]
如上所述，本文中的肠促胰岛素类似物与任何天然人肽具有结构相似性但还有许多结构差异。例如，与天然人gip（seq id no:1）相比，肠促胰岛素类似物包括在位置2-3、6-7、13-14、16-18、20-21、23-25和28-42的一个或多个处的修饰。在一些情况下，肠促胰岛素类似物包括在位置2-3、6-7、13-14、16-18、20-21、23-25和28-42各处对天然人gip（seq id no:1）的氨基酸的修饰。在某些情况下，肠促胰岛素类似物包括以下氨基酸修饰：在位置2的aib；在位置3的q；在位置6的αmef(2f)；在位置7的t；在位置10的y或4pal；在位置13的l或αmel；在位置14的l；在位置17的修饰k残基，其用c
16
至c
22
脂肪酸通过缀合到k侧链的ε-氨基上修饰，任选通过使用接头；在位置18的a；在位置20的4pal、iva或αmel；在位置21的a或aib；在位置23的i；在位置24的e或e；在位置25的y或αmey；在位置28的e；在位置29的g；和用以下氨基酸序列替代位置30-42的氨基酸：gpssgapppe（seq id no:12）或gpssgappps（seq id no:13）（和这些任一尾部的截短类似物）。在另一些情况下，肠促胰岛素类似物是酰胺化的。除本文所述的修饰外，肠促胰岛素类似物还可包括一种或多种另外的氨基酸修饰，如添加、删除、插入和/或置换，但保持能够结合到gip、glp-1和gcg受体的每一种上并将其活化。
[0053]
如上所述，本文中的肠促胰岛素类似物包括例如经由接头缀合到具有可供缀合的官能团的标准或非标准氨基酸上的脂肪酸部分。这样的缀合有时被称为酰化。在某些情况下，具有可供缀合的官能团的氨基酸可以是c、d、e、k或q。在特定情况下，具有可供缀合的官能团的氨基酸是k，其中缀合到k侧链的ε-氨基上。
[0054]
本文所述的肠促胰岛素类似物的酰化在seq id no:5中的位置17，这被确定为是并入这一结构的最佳位置。脂肪酸部分和在某些情况下的接头，充当白蛋白粘合剂，并提供生成长效化合物的潜力。
[0055]
本文中的肠促胰岛素类似物利用通过直接键或通过接头化学缀合到氨基酸的官能团上的c
16-c
22
脂肪酸部分。脂肪酸部分的长度和组成影响肠促胰岛素类似物的半衰期、肠促胰岛素类似物在体内动物模型中的效力和肠促胰岛素类似物的溶解度和稳定性。缀合到c
16-c
22
饱和脂肪单酸或二酸上产生表现出理想半衰期、在体内动物模型中的理想效力和理想的可溶性和稳定性特征的肠促胰岛素类似物。
[0056]
本文所用的饱和c
16-c
22
脂肪酸的实例包括但不限于棕榈酸（十六烷酸）（c
16
单酸）、十六烷二酸（c
16
二酸）、珍珠酸（margaric acid）（十七烷酸）（c
17
单酸）、十七烷二酸（c
17
二酸）、硬脂酸（c
18
单酸）、十八烷二酸（c
18
二酸）、十九酸（十九烷酸）（c
19
单酸）、十九烷二酸（c
19
二酸）、花生酸（二十烷酸）（c
20
单酸）、二十烷二酸（c
20
二酸）、二十一酸（二十一烷酸）（c
21
单酸）、二十一烷二酸（c
21
二酸）、山嵛酸（二十二烷酸）（c
22
单酸）、二十二烷二酸（c
22
二酸），包括它们的支化和取代衍生物。
[0057]
在某些情况下，c
16-c
22
脂肪酸可以是饱和c
20
单酸、饱和c
20
二酸及其支化和取代衍生物。在更特别的情况下，c
16-c
22
脂肪酸可以是二十烷二酸。
[0058]
在一些情况下，接头可具有1至4个氨基酸、氨基聚乙二醇羧酸或其混合物。在某些情况下，氨基聚乙二醇羧酸具有下列结构：其中m是1至12的任何整数，n是1至12的任何整数，且p是1或2。
[0059]
在某些情况下，接头可具有一个或多个aeea部分，任选与1至4个氨基酸组合。
[0060]
在接头包括至少一个氨基酸的情况下，该氨基酸可以是1至4个e或γe氨基酸残基。在一些情况下，接头可包括一个或两个e或γe氨基酸残基，包括其d形式。例如，接头可包括一个或两个γe氨基酸残基。或者，接头可包括与最多36个aeea部分组合使用的1至4个氨基酸残基（例如e或γe氨基酸）。具体地，接头可以是1至4个e或γe氨基酸和1至4个aeea部分的组合。在另一些情况下，接头可以是一个或两个γe氨基酸和一个或两个aeea部分的组合。
[0061]
在一种具体情况下，本文中的肠促胰岛素类似物含有具有下列结构的接头-脂肪酸部分：((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)
a-(γe)
b-co-(ch2)
c-co2h,其中a是0、1或2，b是1或2，且c是16或18。在一种特定情况下，a是1，b是1，且c是20，其具有下列结构：。
[0062]
如下列实施例1-3的化学结构中所示，上述接头-脂肪酸部分可连接到k侧链的epsilon (ε)-氨基上。
[0063]
可使用本领域中已知的测量受体结合水平的技术，包括例如以下实施例中描述的那些技术测量本文中的肠促胰岛素类似物对gip、glp-1和gcg受体的每一种的亲和力，并通常表示为抑制常数(ki)值。也可使用本领域中已知的技术，包括例如下述体外活性测定法测量肠促胰岛素类似物在各受体处的活性，并通常表示为有效浓度50 (ec
50
)值，这是在剂量响应曲线中造成半最大模拟（half-maximal simulation）的化合物浓度。
[0064]
本文中的肠促胰岛素类似物可配制为药物组合物，其可通过肠胃外途径（例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内或透皮）给药。这样的药物组合物及其制备技术是本领域中公知的。参见例如remington: the science and practice of pharmacy (troy, ed., 第21版, lippincott, williams & wilkins, 2006)。在特定情况下，肠促胰岛素类似物皮下给药。
[0065]
本文中的肠促胰岛素类似物可与几种无机和有机酸/碱的任一种反应以形成可药用酸/碱加成盐。可药用盐及其常用制备技术是本领域中公知的（参见例如stahl等人, handbook of pharmaceutical salts: properties, selection and use, 第2修订版(wiley-vch, 2011)）。本文所用的可药用盐包括但不限于钠盐、三氟乙酸盐、盐酸盐和乙酸盐。
[0066]
本公开还提供了并因此包括合成本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的新型中间体和方法。本文中的中间体和肠促胰岛素类似物可通过本领域已知的各种技术制备。例如，在以下实施例中例示了使用化学合成的方法。所述各路线的具体合成步骤可以不同方式组合以制备本文中的肠促胰岛素类似物。试剂和原材料是本领域技术人员易得的。
[0067]
本文中的某些肠促胰岛素类似物通常在宽剂量范围内有效。例如，用于每周一次给药的剂量可落在大约0.01至大约30 mg/个体/周的范围内、在大约0.1至大约10 mg/个体/周的范围内或甚至在大约0.1至大约3 mg/个体/周的范围内。因此，本文中的肠促胰岛素类似物可每日、每周三次、每周两次或每周一次给药，尤其是每周一次给药。
[0068]
本文中的肠促胰岛素类似物可用于治疗各种病况、障碍、疾病或症状。特别地，提供了治疗个体的t2dm的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0069]
另外，提供了治疗个体的血脂异常的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0070]
另外，提供了治疗个体的代谢综合征的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0071]
另外，提供了治疗个体的nafld的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0072]
另外，提供了治疗个体的nash的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0073]
另外，提供了治疗个体的肥胖的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0074]
另外，提供了诱发个体的非治疗性体重减轻的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0075]
另外，提供了治疗不被视为代谢疾病的心血管疾病的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0076]
另外，提供了治疗神经退行性疾病的方法，其中这样的方法包括至少给予需要这种治疗的个体有效量的本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐的步骤。
[0077]
在这些方法中，可以通过例如观察血糖的显著降低、观察胰岛素的显著增加、观察hba1c的显著降低、观察血脂的显著降低、观察体重或体脂的显著降低和/或观察身体组成的变化来评估本文中的肠促胰岛素类似物的有效性。
[0078]
或者，本文中的肠促胰岛素类似物或其可药用盐可用于改善需要其的个体的骨强度。在一些情况下，需要其的个体具有骨生成不足（hypoostosis）或骨质缺乏症（hypoosteoidosis），或正从骨折、矫形手术、假肢植入、牙植入和/或脊柱融合术中愈合。肠促胰岛素类似物也可用于治疗其它障碍，如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。
实施例
[0079]
为了举例说明而非限制，提供以下非限制性实施例。
[0080]
多肽合成实施例1: 肠促胰岛素类似物1的合成实施例1是下列描述代表的化合物：yaibqgt-αmef(2f)-tsdysilldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-γe-co-(ch2)
18-co2h)aq-4pal-afieylleggpssgepppe-nh
2 (seq id no:9)。
[0081]
下面除残基aib2、αmef(2f)6、o16、k17、4pal20和e39外使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例1的结构，其中已展开这些氨基酸残基的结构：
[0082]
在symphony x肽合成仪(gyros protein technologies；tucson, az)上使用fmoc/t-bu化学合成实施例1的肽骨架。
[0083]
树脂是在0.3-0.4 meq/g的取代度下的1% dvb交联的聚苯乙烯（fmoc-rink-mbha低载量树脂，100-200目；emd millipore）。使用标准侧链保护基，以下除外。fmoc-lys
(mtt)-oh用于位置17的k，boc-tyr(tbu)-oh)用于位置1的y。在各偶联步骤(2 x 7分钟)前使用20%哌啶/dmf除去fmoc基团。所有标准氨基酸偶联使用等摩尔比的fmoc氨基酸（0.3 mm）、二异丙基碳二亚胺（0.9 mm）和oxyma（0.9 mm）在相对于理论肽载量9倍摩尔过量下进行1小时（偶联到伯胺）和3小时（偶联到仲胺）。例外是偶联到cα-甲基化氨基酸，其偶联3小时。在完成肽骨架的合成后，树脂用dcm充分洗涤6次以除去残余dmf。使用30%六氟异丙醇（oakwood chemicals）/dcm的两次处理（2 x 40分钟处理）从肽树脂中选择性除去在位置17的k上的mtt保护基。
[0084]
通过2-[2-(2-fmoc-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸（fmoc-aeea-oh, chempep, inc.）、fmoc-谷氨酸α-t-丁基酯（fmoc-e-otbu, ark pharm, inc.）和单-otbu-二十烷酸（wuxi apptec, shanghai, china）的偶联实现脂肪酸-接头部分的随后连接。3倍过量的试剂（aa: pyaop: dipea=1: 1 :1 mol/mol）用于每个偶联1小时。
[0085]
在合成完成后，用dcm洗涤肽树脂，然后充分晾干。干燥树脂用10毫升裂解混合物（cleavage cocktail）（tfa:三异丙基甲硅烷:水，92.5:2.5:5体积比）在40℃下处理30分钟。滤出树脂，各用2毫升纯tfa洗涤两次，合并的滤液用5倍过量体积的冷乙醚（-20℃）处理以沉淀粗制肽。肽/乙醚悬浮液然后在3500 rpm下离心2分钟以形成固体团块（pellet），滗析上清液，固体团块用冷乙醚研制另外两次并在真空中干燥。将粗制肽溶解在20%乙腈/20%乙酸/60%水中并通过在luna 5
ꢀµ
m苯基-己基制备柱（21 x 250 mm；phenomenex）上用100%乙腈和0.1% tfa/水缓冲体系的线性梯度（30-50%乙腈，在60 min内）的rp-hplc提纯。使用分析rp-hplc评估肽的纯度并且合并标准（pooling criteria）是》95%。发现实施例1的主要合并纯度（pool purity）为》98.0%。最终主要产物合并物的随后冻干产生冻干的肽tfa盐。通过lc-ms测定分子量（观测值: m 3 =1633.7；计算值m 3 =1633.8）。
[0086]
实施例2: 肠促胰岛素类似物2的合成实施例2是下列描述代表的化合物：yaibqgt-αmef(2f)-tsdysi-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-γe-co-(ch2)
18-co2h)aq-iva-afie-αmey-lleggpssgeppps-nh
2 (seq id no:10)。
[0087]
下面除残基aib2、αmef(2f)6、αmel13、o16、k17、iva20、αmey25和s39外使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例2的结构，其中已展开这些氨基酸残基的结构：
[0088]
使用与上文对实施例1所述类似的方法合成肽骨架、缀合脂肪酸-接头部分、检查纯度和确认实施例2的分子量。
[0089]
实施例3: 肠促胰岛素类似物3的合成实施例3是下列描述代表的化合物：yaibqgt-αmef(2f)-tsd-4pal-si-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-γe-co-(ch2)
18-co2h)aq-αmel-aib-fie-αmey-lleggpssgeppps-nh
2 (seq id no:
11)。
[0090]
下面除残基aib2、αmef(2f)6、4pal10、αmel13、o16、k17、αmel20、aib21、e24、αmey25和s39外使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例3的结构，其中已展开这些氨基酸残基的结构：
[0091]
使用与上文对实施例1所述类似的方法合成肽骨架、缀合脂肪酸-接头部分、检查
cat# 35050）、0.1%牛酪蛋白（sigma c4765-10ml）、250
ꢀµ
m ibmx（3-异丁基-1-甲基黄嘌吟, acros cat# 228420010）和20 mm hepes（gibco cat# 15630）的dmem（gibco cat# 31053）中用对照多肽或实施例1至3之一（在dmso中的20点浓度-响应曲线，2.75倍labcyte echo直接稀释，384孔板corning cat# 3570）处理表达hgipr、hglp-1r或hgcgr受体的细胞。也在添加了1.0%无脂肪酸、无球蛋白的人血清白蛋白（sigma cat# a3782）的相同测定条件下进行实验。
[0100]
在37℃下温育30分钟后，使用cisbio camp dynamic 2 htrf检测试剂盒(62am4pej)定量测定所造成的细胞内camp的增加。简言之，通过加入在细胞裂解缓冲液（10
ꢀµ
l）中的camp-d2缀合物，接着加入也在细胞裂解缓冲液（10
ꢀµ
l）中的抗体抗-camp-eu
3 -穴状化合物，检测细胞内的camp水平。所得竞争分析在室温下温育至少60分钟，然后使用perkinelmer envision
®
仪器在320 nm的激发和在665 nm和620 nm的发射下检测。envision单位（在665nm/620nm的发射*10,000）与存在的camp的量成反比并使用camp标准曲线换算成每孔的nm camp。将在每个孔中生成的camp量（nm）换算成用人gip(1-42)nh2、hglp-1(7-36)nh2或hgcg观察到的最大响应的百分比。使用最大响应百分比 vs. 添加的肽浓度通过非线性回归分析推导出相对ec
50
值和% top（e
max
），拟合到四参数对数方程中。
[0101]
结果: 下面在表3（0.1%牛酪蛋白）和表4（0.1%牛酪蛋白、1.0%人血清白蛋白）中提供hgip(1-42)nh2、hglp-1(7-36)nh2、hgcg和实施例化合物的功能数据。
[0102]
表3: 在37℃下（在0.1%牛酪蛋白存在下）温育的肽的功能camp效力（ec
50
）和功效（e
max
）注: a 使用[
125
i]glp-1(7-36)nh2在hglp-1r处（112 fmol/mg蛋白质）、[
125
i]gcg在hgcgr处（98 fmol/mg蛋白质）和[
125
i]gip(1-42)在hgipr处（124 fmol/mg 蛋白质）的同源竞争结合测定表达密度。
b ec
50
, nm = 具有平均数标准误差的几何平均数，后接在括号中的观察次数。
c e
max
, %= 在hglp-1r处对glp-1(7-36)nh2、在hgcgr处对gcg或在hgipr处对gip(1-42)nh2的最大响应百分比的算术平均数
ꢀ±ꢀ
平均数标准误差。显示的所有值到三位(3)有效位数。
[0103]
表4: 在37℃下（在0.1%牛酪蛋白和1.0%人血清白蛋白存在下）温育的肽的功能camp效力（ec
50
）和功效（e
max
）注: a 使用[
125
i]glp-1(7-36)nh2在hglp-1r处（112 fmol/mg蛋白质）、[
125
i]gcg在hgcgr处（98 fmol/mg蛋白质）和[
125
i]gip(1-42)在hgipr处（124 fmol/mg 蛋白质）的同源竞争结合测定表达密度。
b ec
50
, nm = 具有平均数标准误差的几何平均数，后接在括号中的观察次数。
c e
max
, %= 在hglp-1r处对glp-1(7-36)nh2、在hgcgr处对gcg或在hgipr处对gip(1-42)nh2的最大响应百分比的算术平均数
ꢀ±ꢀ
平均数标准误差。显示的所有值到三位(3)有效位数。
[0104]
如表3中所见，在0.1%酪蛋白存在下，实施例化合物刺激来自hglp-1r、hgcgr和hgipr的camp。
[0105]
如表4中所见，在0.1%牛酪蛋白和1%人血清白蛋白存在下，实施例化合物刺激来自hglp-1r、hgcgr和hgipr的camp。
[0106]
体内功能实施例6: 在雄性饮食诱导肥胖（dio）小鼠中的药代动力学方法: 在含有0.02% ps80的40 mm tris-hcl ph8缓冲液中的200 nmol/kg（0.98 mg/kg）单次sq剂量的实施例化合物以10 ml/kg的体积给药于雄性dio小鼠。在给药后1、3、6、12、24、48和72小时收集血液进行药代动力学表征。在q squared solutions biosciences llc (ithaca, ny)通过合格的液相色谱质谱法（lc/ms）测定实施例化合物的血浆浓度。使用蛋白质沉淀、然后固相萃取从100%小鼠血浆中提取实施例化合物和内标。通过q-exactive
™ꢀ
orbitrap
®
质谱仪检测包括肽和酰基链的实施例化合物的完整质量。
[0107]
结果: 下面在表5中提供实施例化合物的数据。
[0108]
表5: 在单次200 nmol/kg皮下给药于雄性dio小鼠后的平均血浆药代动力学参数
注: 缩写: t
1/2 = 半衰期，t
max = 达到最大浓度的时间，c
max = 最大观察血浆浓度，auc
0-inf = 从时间0小时至无穷大的曲线下面积，cl/f = 清除率/生物利用度。n=3只动物/组/时间点。
[0109]
如表5中所见，实施例化合物在dio小鼠中表现出延长的药代动力学分布。
[0110]
实施例7: 对雄性wistar大鼠中的胰岛素分泌的体内作用方法: 使用在雄性wistar大鼠中的静脉葡萄糖耐量试验（ivgtt）评估实施例化合物的促胰岛素效力。使用glp-1r激动剂索马鲁肽（semaglutide）作为阳性对照。在带有滤气顶的聚碳酸酯笼中每笼一只圈养在颈静脉和颈动脉中手术植入套管的大鼠（envigo；indianapolis, in，280-320克）。大鼠在21℃下维持12小时光暗循环并随意获取2014 teklad global饮食（envigo）和去离子水。大鼠按体重随机分配并在给予葡萄糖之前16小时皮下给予1.5 ml/kg实施例化合物，然后禁食。211 nm/ml的储备浓度的实施例化合物在含0.02% ps80的40mm tris-hcl缓冲液ph 8.0中稀释到所需给药浓度；受试剂量是媒介物、0.1、0.3、1、3、10和30 nm/kg。与实施例化合物（10 nm/kg剂量）的每次运行（run）关联地使用索马鲁肽作为阳性对照。
[0111]
在时间0将血样收集到edta管中，此后给予葡萄糖（0.5 mg/kg, 5 ml/kg）。在静脉给予葡萄糖后2、4、6、10、20和30分钟收集血样以测定葡萄糖和胰岛素水平。使用电化学发光分析法（meso scale；rockville, md）测定血浆胰岛素。与媒介物对照比较地检查胰岛素auc，n = 每组6只动物。
[0112]
使用jmp用单因素anova，接着与媒介物对照的dunnett’s比较进行统计分析。
[0113]
结果: 下面在表6中提供实施例化合物的数据。
[0114]
表6:在wistar大鼠中的ivgtt过程中媒介物、索马鲁肽（sema，10 nmol/kg）和实施例化合物对胰岛素分泌的影响
注: 结果表示为每组6只大鼠的平均数
ꢀ±ꢀ
平均数标准误差（sem）。统计试验是单因素anova，接着dunnett’s与媒介物相比*p《0.05；与索马鲁肽相比 p《0.05。
[0115]
如表6中所见，实施例化合物剂量依赖性地增加胰岛素分泌。
[0116]
实施例8: 在dio c57/b16小鼠中对体重减轻、代谢和身体组成的体内研究方法: 为了研究实施例化合物对如体重减轻、代谢和身体组成之类参数的影响，将实施例化合物给药于c57bl6 dio小鼠。在置于高脂肪饮食20周后，这些动物尽管没有糖尿病，但表现出胰岛素抵抗和血脂异常，这些都是代谢综合征的特征。
[0117]
在此，在下列研究中使用依赖高热量饮食的20周龄的dio雄性c57/bl6小鼠。动物单只圈养在温度受控（23℃至26℃）的设施中，具有12小时光暗循环（在21:00点灯）并随意获取食物（td95217）和水。在适应该设施3周后（包括1周的媒介物驯化给药），小鼠根据它们的体重随机分配，因此各实验组的动物具有类似体重。体重为40 g至51 g。
[0118]
所有组包含6只小鼠。每天在黑暗周期开始前30分钟至120分钟将实施例化合物和索马鲁肽溶解在媒介物（40 mm tris-hcl，ph 8.0，含0.02% ps-80）中并通过sq注射（10 ml/kg）给药于自由进食的dio小鼠，持续14天（第1至14天）。在研究全程每天测量体重和食物摄入，包括在最后一次给药后1天（第15天）。
[0119]
通过减去在第一次注射分子前同一动物的体重，计算体重的绝对变化。在第0和15天，通过使用echo medical system（houston, tx）仪器的核磁共振（nmr）测量总脂肪质量。在第15天，使用accu-chek
®ꢀ
aviva
®
血糖仪（roche；indianapolis, in）或hitachi临床血液分析仪（roche, indianapolis, in）测量代谢参数。使用电化学发光分析法（meso scale discovery, rockville, md）测定血浆胰岛素。
[0120]
数据作为每组6只动物的平均数
ꢀ±ꢀ
sem显示在下表7和8中。使用重复测量anova、接着用于多重比较的dunnett’s方法进行统计分析。p《0.05的显著性差异被认定为*。
[0121]
结果: 下面在表7和8中提供实施例化合物的数据。
[0122]
表7. 在用索马鲁肽和实施例化合物治疗后在15天后的体重变化
注:
ꢀ“
δ体重(g)”是指在试验组和媒介物组之间在第15天的体重差异。“δ体重(%)”是指在试验组中在第1天和第15天之间的体重下降百分比。“脂肪质量(%)”是指在试验组中在第0天和第15天之间的脂肪质量差异。“sema”是指索马鲁肽。所有数据来自单一代表性研究。记录接受媒介物的动物的体重和脂肪质量的变化百分比，并在各研究中小于2%。除在低剂量0.15625 nmol/kg下的实施例肽外，对于索马鲁肽和所有实施例，在所有受试剂量下，“δ体重(g)”、“δ体重(%)”和“δ脂肪质量(%)”都在统计上显著不同于（*, p《0.05）对照。
[0123]
如表7中所见，实施例化合物剂量依赖性地降低体重和脂肪质量。
[0124]
表8: 用实施例化合物治疗对15天后的血糖、胰岛素、总胆固醇和甘油三酯的影响
注: 所有数据参考试验组和媒介物组之间在第15天的差异，并来自单一代表性研究。“sema”是指索马鲁肽。与媒介物组相比*p《0.05；单因素anova，dunnett’s。
[0125]
如表8中所见，实施例化合物也降低血糖、胰岛素（作为提高胰岛素敏感度的标志）、胆固醇和甘油三酯。
[0126]
序列表在上文的公开中提到以下核酸和/或氨基酸序列，并在下面提供以供参考。
[0127]
seq id no:1
ꢀ–
人gipseq id no:2
ꢀ–
人glp-1
7-36
酰胺seq id no:3
ꢀ–
人胰高血糖素
seq id no:4
ꢀ–
人oxmseq id no:5
ꢀ–
肠促胰岛素类似物其中：x2是aib，x6是αmef(2f),x
10
可以是y或4pal，x
13
可以是l或αmel，x
16
是orn，x
17
是任何具有可供缀合的官能团的氨基酸，x
20
可以是4pal、iva或αmel，x
21
可以是a或aib，x
24
可以是e或e，x
25
可以是y或αmey，且x
39
可以是e或sseq id no:6
ꢀ–
肠促胰岛素类似物seq id no:7
ꢀ–
肠促胰岛素类似物seq id no:8
ꢀ–
肠促胰岛素类似物seq id no:9
ꢀ–
肠促胰岛素类似物y-aib-qgt-αmef(2f)-tsdysilldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基seq id no:10
ꢀ–
肠促胰岛素类似物y-aib-qgt-αmef(2f)-tsdysi-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基seq id no:11
ꢀ–
肠促胰岛素类似物y-aib-qgt-αmef(2f)-tsd-4pal-si-αmel-ldok(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基seq id no:12
ꢀ–
人工序列seq id no:13
ꢀ–
人工序列
seq id no:14
ꢀ–
人gip受体seq id no:15
ꢀ–
人glp-1受体seq id no:16
ꢀ–
人gcg受体
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。