一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用

1.本发明涉及干细胞技术领域，具体地，涉及一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用。


背景技术：

2.成体干细胞是一类存在于生物体内，具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，成体干细胞在机体的新陈代谢及损伤修复中起着不可或缺的作用。其中的间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，msc)更是干细胞研究与再生医学领域的“主角”。msc的研究始于1968年，当时freidenstein提出骨髓中存在一群形态和成纤维细胞相似且呈克隆性增殖的贴壁细胞，随后经证实其具有自我更新和多向分化潜能。目前研究支持人体多种组织甚至实体器官中均能分离获得msc。由于msc具有自我复制、多向分化和免疫调节、旁分泌和造血支持等出众的优点，在组织工程、临床研究中被广泛应用，据clinicaltrials.gov 网站介绍，自2006年以来，msc相关临床试验的数量不断增加，迄今已注册的msc临床试验有1400多项。这些临床试验多集中于关节炎、慢性移植物抗宿主病、心脏病、阿兹海默症等疾病，使用包括骨髓、脂肪、脐带等不同组织来源甚至不同个体来源的msc。然而msc临床试验的结果显示其治疗效果个体化差异较大，缺乏可重复性、甚至有效性。除了msc治疗机制不明确、批次间细胞质量难控制之外，更深层次的原因可能是不同组织来源msc中存在不同发育起源/不同功能的异质性细胞群，因此不同发育起源的msc 可能在细胞治疗应用中具有不尽相同的优势作用。
3.已知msc的发育起源包括神经嵴(形成牙髓、牙龈及骨髓msc等)、中胚层(形成骨髓和脏器msc等)和滋养层(形成脐带和胎盘msc等)。中胚层作为间充质干细胞的主要来源之一，本身在体内发育的过程中，可以细分成轴旁中胚层(paraxial mesodermpm)、侧板中胚层(lateral mesoderm lm)、中间中胚层(intermediate mesoderm im)。其中中间中胚层(im)位于轴旁中胚层与侧板中胚层之间的狭长区域，是形成泌尿与生殖系统的主要器官原基，在体内能进一步发育成肾脏以及性腺。
4.近年来，绝大部分研究致力于在体外将多能干细胞经历中间中胚层阶段后诱导为成熟肾脏细胞，而这种成熟的肾脏细胞不但诱导周期长，诱导效率低、存在免疫原性而且在体外扩增代数受限，很难进一步应用于临床治疗中。(例如：journal of the american society of nephrology,2014,25(6):1211-1225；nature communications,2014,4:1367；kidney development,disease,repair and regeneration,2016:473-490.)
5.另外，已有文献报道(biomaterials.2015may；50:56-66.)称小鼠肾脏中分离得到的 nestin msc亚群，具备很强的旁分泌、免疫调节和肾脏组织原位损伤修复能力，提示与肾脏来源msc具有相同发育起源的中间中胚层来源msc可能促进肾脏的损伤修复。但是由于人成体内分离肾脏msc有极大的创伤性且伦理受限，也难以进一步应用于临床。
6.目前，并未见有任何报道将多能干细胞诱导为特异性中间中胚层细胞(排除混杂细胞，包括其他中胚层细胞，甚至是其他胚层细胞)，同时进一步将特异性中间中胚层细胞
诱导为低免疫原性、可在体外大量扩增肾脏间充质干细胞。因此，研究如何在体外由多能干细胞诱导并获得能发育成肾脏的中间中胚层细胞，以及中间中胚层来源肾脏间充质干细胞对肾脏相关疾病治疗有着非常重大的研究意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了克服现有技术的中非限定诱导方法诱导的各中胚层细胞混杂及间充质干细胞异质性问题，提供一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法及其应用。本发明方案可以高效诱导得到特异性的中间中胚层细胞(ims)，解决了非限定诱导方法诱导的各中胚层细胞(包括pms和lms)混杂问题，还提供了一种均质的、能够有效治疗肾脏损伤的肾脏间充质干细胞。同时本发明研制的一种用于肾脏间充质干细胞的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)，排除现有培养液动物源性成分及人源性培养液扩增培养带来的免疫排斥问题。两者共同解决了肾脏细胞来源受限、扩增受限、纯度受限的问题，最终获得的肾脏间充质干细胞将会是临床治疗肾脏损伤相关疾病中新的、高质量的细胞来源。
8.本发明的第一个目的是提供一种特异性诱导中间中胚层细胞的培养液组合物。
9.本发明的第二个目的是提供一种特异性诱导中间中胚层细胞的制备方法。
10.本发明的第三个目的是提供所述制备方法诱导得到的中间中胚层细胞。
11.本发明的第四个目的是提供一种间充质干细胞无血清完全培养液。
12.本发明的第五个目的是提供一种多能干细胞来源肾脏间充质干细胞的制备方法。
13.本发明的第六个目的是提供所述的制备方法诱导得到的肾脏间充质干细胞。
14.本发明的第七个目的是提供所述的中间中胚层细胞和/或所述的肾脏间充质干细胞，在制备抑制炎症因子tnfα表达和/或促进ido-1表达的免疫调节药物，或细胞治疗肾脏损伤的制剂中的应用。
15.本发明的第八个目的是提供所述的组合物在诱导中间中胚层细胞和/或肾脏间充质干细胞中的应用。
16.本发明的第九个目的是提供所述的间充质干细胞无血清完全培养液在诱导肾脏间充质干细胞中的应用。
17.本发明制定标准化的诱导分化流程，将多能干细胞(pluripotent stem cell，psc)先后经历三个不同阶段的限定诱导培养液特异性诱导为中间中胚层细胞(hipsc-ims)，并经中间中胚层细胞(ims)阶段在间充质干细胞培养液中进一步诱导为间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，mscs)，最终获得多能干细胞来源肾脏间充质干细胞。
18.本发明为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
19.本发明中所使用的“ims”是指中间中胚层细胞。
20.本发明中所使用的“pms”是指轴旁中胚层细胞。
21.本发明中所使用的“lms”是指侧板中胚层细胞。
22.本发明中所使用的“hipsc-ims”是指由人诱导多能干细胞特异性诱导的中间中胚层细胞。
23.本发明中所使用的“h1-ims”是指由胚胎干细胞特异性诱导的中间中胚层细胞。
24.本发明中所使用的“im-mscs”是指由多能干细胞特异性诱导的中间中胚层来源肾脏间充质干细胞。
25.因此本发明要求保护一种特异性诱导中间中胚层细胞的培养液的组合物，包括stage
ꢀⅰ
培养液、stageⅱ培养液、和stageⅲ培养液；
26.其中，stageⅰ培养液为含有rock信号通路抑制剂的mtesr培养液或essential 8
tm
培养液；
27.stageⅱ培养液为含有的its培养补充剂、neaa细胞培养添加物、gsk3抑制剂、 tgfβ信号通路激动剂和fgf信号通路激动剂的基础培养液；
28.stageⅲ培养液为含有的its培养补充剂、neaa细胞培养添加物、视黄酸(retinoicacid,ra)、bmp信号通路抑制剂、fgf信号通路激动剂和tgfβ信号通路激动剂的基础培养液。
29.优选地，stageⅰ培养液中所述培养液为mtesr培养液。
30.优选地，stageⅰ培养液中，rock抑制剂为y27632或gsk429286a的一种或几种。
31.更优选地，stageⅰ培养液中，rock抑制剂为y27632。
32.进一步优选地，stageⅰ培养液中，y27632的用量为5～10μm。
33.进一步更优选地，stageⅰ培养液中，y27632的用量为10μm。
34.再优选地，stageⅰ培养液为含有y27632的mtesr培养液。
35.最优选地，stageⅰ培养液为含有10μm y27632的mtesr培养液。
36.优选地，stageⅱ培养液中，所述gsk3抑制剂为ly2090314、sb216763、azd1080、或chir99021中的一种或几种。
37.更优选地，stageⅱ培养液中，所述gsk3抑制剂为chir99021。
38.进一步优选地，stageⅱ培养液中，chir99021的用量为1～10μm。
39.进一步更优选地，stageⅱ培养液中，chir99021的用量为10μm。
40.优选地，stageⅱ培养液中，所述tgf-β超家族通路激动剂为tgfβ1、activin a或 bmp7中的一种或两种。
41.更优选地，stageⅱ培养液中，所述tgfβ信号通路激动剂为activin a。
42.进一步优选地，stageⅱ培养液中，activin a的用量为1～200ng/ml。
43.进一步更优选地，stageⅱ培养液中，activin a的用量为100ng/ml。
44.优选地，stageⅱ培养液中，fgf信号通路激动剂为重组人碱性成纤维生长因子bfgf。
45.进一步优选地，stageⅱ培养液中，bfgf的用量为1～100ng/ml。
46.进一步更优选地，stageⅱ培养液中，bfgf的用量为10ng/ml。
47.优选地，stageⅱ培养液中，its培养补充剂的用量为1～5％(v/v)。
48.更优选地，stageⅱ培养液中，its培养补充剂的用量为1％(v/v)。
49.优选地，stageⅱ培养液中，neaa细胞培养添加物的用量为1～5％(v/v)。
50.更优选地，stageⅱ培养液中，neaa细胞培养添加物的用量为1％(v/v)。
51.再优选地，stageⅱ培养液为含有its培养补充剂、neaa细胞培养添加物、activin a、 chir99021和bfgf的dmem-f12培养液。
52.最优选地，stageⅱ培养液为含有1％(v/v)its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、100ng/ml activin a、10μm chir99021和10ng/ml bfgf的dmem-f12培养液。
53.优选地，stageⅲ培养液中，bmp信号通路抑制剂为noggin、ldn193189、ldn212854 中的一种或几种。
54.更优选地，stageⅲ培养液中，bmp信号通路抑制剂为ldn193189。
55.进一步优选地，stageⅲ培养液中，ldn193189的用量为0.1～10μm。
56.进一步更优选地，stageⅲ养液中，ldn193189的用量为1μm。
57.优选地，stageⅲ培养液中，tgfβ信号通路激动剂为tgfβ1、activin a中的一种或两种。
58.更优选地，stageⅲ培养液中，tgfβ信号通路激动剂为tgfβ1。
59.进一步优选地，stageⅲ培养液中，tgfβ1的用量为1～100ng/ml。
60.进一步更优选地，stageⅲ养液中，tgfβ1的用量为10ng/ml。
61.优选地，stageⅲ培养液中，fgf信号通路激动剂为重组人碱性成纤维生长因子bfgf。
62.进一步优选地，stageⅲ培养液中，bfgf的用量为0.1～200ng/ml。
63.进一步更优选地，stageⅲ培养液中，bfgf的用量为10ng/ml。
64.优选地，stageⅲ培养液中，视黄酸(retinoic acid,ra)的用量为1～10μm。
65.进一步优选地，stageⅲ培养液中，视黄酸(retinoic acid,ra)的用量为100nm。
66.优选地，stageⅲ培养液中，its培养补充剂的用量为1～5％(v/v)。
67.更优选地，stageⅲ培养液中，its培养补充剂的用量为1％(v/v)。
68.优选地，stageⅲ培养液中，neaa细胞培养添加物的用量为1～5％(v/v)。
69.更优选地，stageⅲ培养液中，neaa细胞培养添加物的用量为1％(v/v)。
70.再优选地，stageⅲ培养液为含its培养补充剂、neaa细胞培养添加物、bfgf、tgfβ1、视黄酸(retinoic acid,ra)、和ldn193189的dmem-f12培养液。
71.最优选地，stageⅲ培养液为含有的1％(v/v)its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、10ng/ml bfgf、10ng/ml tgfβ1、100nm视黄酸(retinoic acid,ra)、1μm ldn193189的dmem-f12培养液
72.进一步本发明要求一种特异性诱导中间中胚层细胞的制备方法，包括以下步骤：
73.s1.未分化状态的多能干细胞体外贴壁培养至80～90％密度后，用细胞消化液消化成单个细胞或多细胞团块；
74.s2.用所述的stageⅰ培养液重悬上一步的产物，贴壁培养，接种到matrigel或纤连蛋白包被的培养容器，以促进细胞的贴壁；
75.s3.贴壁培养1～4天后换成所述的stageⅱ培养液培养1～10天；
76.s4.换成中所述的stageⅲ培养液，培养2～10天，即得中间中胚层细胞。
77.本发明利用不同阶段诱导培养液来模拟体内胚胎发育的过程，将多能干细胞诱导至特异性的中间中胚层细胞。首先多能干细胞通过stageⅰ和stageⅱ培养液的诱导后得到原条阶段的细胞；随后进一步经过stageⅲ的培养液诱导使原条阶段的细胞分化得到中间中胚层细胞，其具有类似于体内中间中胚层发育成肾脏细胞的潜能。
78.优选地，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
79.优选地，所述细胞消化液包括但不限于accutase或胰酶等。
80.优选地，使用stageⅱ培养液培养每天更换培养液。
81.优选地，使用stageⅲ培养液培养每天更换培养液。
82.优选地，步骤s2中，贴壁培养1～2天后换成stageⅱ培养液。
83.更优选地，步骤s2中，贴壁培养1天后换成stageⅱ培养液。
84.优选地，步骤s3中，换成stageⅱ培养液培养2～4天。
85.更优选地，步骤s3中，换成stageⅱ培养液培养2天。
86.优选地，步骤s4中，换成stageⅲ培养液，培养3～6天。
87.更优选地，步骤s4中，换成stageⅲ培养液，培养3天。
88.优选地，步骤s2中，贴壁培养，至1
×
104～1
×
105/cm2的密度接种到matrigel或纤连蛋白包被的培养容器。
89.所述制备方法诱导得到的中间中胚层细胞，也属于本发明的保护范围。
90.本发明还要求保护一种间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)，为含有血清替代物、neaa细胞培养添加物、its培养补充剂、l-谷氨酸、β-巯基乙醇、维生素c、尿苷、白血病抑制因子lif、还包括pdgf信号通路激动剂、egf信号通路激动剂、fgf信号通路激动剂的基础培养液。
91.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，基础培养液为dmem(l)培养液或α-dmem培养液。
92.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，基础培养液为dmem(l)培养液。
93.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，血清替代物为kosr或ultroser
tm
g serum substitute。
94.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，血清替代物为kosr。
95.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，its培养补充剂的用量为1～ 5％(v/v)。
96.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，its培养补充剂的用量为1％(v/v)。
97.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，neaa细胞培养添加物的用量为1～ 5％(v/v)。
98.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，neaa细胞培养添加物的用量为 1％(v/v)。
99.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，l-谷氨酸的用量为1～10mm。
100.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，l-谷氨酸的用量为5mm。
101.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，β-巯基乙醇的用量为0.1～10mm。
102.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，β-巯基乙醇的用量为1mm。
103.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，维生素c的用量为0.1～10mg/ml。
104.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，维生素c的用量为300ng/ml。
105.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，尿苷的用量为1～500μm。
106.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，尿苷的用量为100μm。
107.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，白血病抑制因子lif的用量为1～ 100ng/ml。
108.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，白血病抑制因子lif的用量为 2ng/ml。
109.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，fgf信号通路激动剂为重组人碱性成纤维生长因子bfgf。
110.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，bfgf的用量为1～100ng/ml。
111.进一步优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，bfgf的用量为2ng/ml。
112.优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，egf信号通路激动剂为egf。
113.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，egf的用量为1～100ng/ml
114.进一步优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，egf的用量为2ng/ml。优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，pdgf信号通路激动剂为pdgfaa、pdgfbb、 pdgfab中的一种或几种。
115.更优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，pdgf信号通路激动剂为10～ 100ng/ml pdgfaa、10～100ng/ml pdgfbb、10～100ng/ml pdgfab中的一种或几种。
116.进一步优选地，所述间充质干细胞无血清完全培养液中，pdgf信号通路激动剂为 50ng/ml pdgfaa、50ng/ml pdgfbb、50ng/ml pdgfab中的一种或几种。
117.再优选地，间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)为含有血清替代物kosr、neaa 细胞培养添加物、its培养补充剂、l-谷氨酸、β-巯基乙醇、维生素c、尿苷、白血病抑制因子lif、bfgf、egf、pdgfbb、pdgfab的dmem(l)培养液。
118.最优选地，间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)为含有5％血清替代物kosr、 1％(v/v)neaa细胞培养添加物、1％(v/v)its培养补充剂、5mm l-谷氨酸、1mm的β
‑ꢀ
巯基乙醇、300ng/ml维生素c、100μm尿苷、1ng/ml白血病抑制因子lif、2ng/ml的bfgf、 2ng/ml的egf、50ng/ml pdgfbb、50ng/ml pdgfab的dmem(l)培养液。
119.进一步，本发明还要求保护一种特异性诱导肾脏间充质干细胞的方法，将所述方法得到的中间中胚层细胞，在间充质干细胞培养液进行传代培养后得到。
120.优选地，所述间充质干细胞培养液为所述间充质干细胞无血清完全培养液或市售商业化msc培养液。
121.更优选地，消化所述中间中胚层细胞，使用所述间充质干细胞培养液贴壁培养。
122.优选地，消化所述中间中胚层细胞至单个细胞或多细胞团块。
123.优选地，按4
×
104～1
×
105/cm2的密度连续培养传代3～4周。
124.优选地，所述市售商业化msc培养液为stemcell technologies市售的msc培养液(acf)或ajinomoto市售的msc培养液(stemfit)。
125.所述制备方法诱导得到的肾脏间充质干细胞，也属于本发明的保护范围。
126.所述的中间中胚层细胞和/或所述的肾脏间充质干细胞，在制备抑制炎症因子tnfα表达和/或促进ido-1表达的免疫调节药物，或细胞治疗肾脏损伤的制剂中的应用，也属于本发明的保护范围。
127.优选的，所述肾脏损伤为急性肾损伤或慢性肾损伤。
128.所述的组合物在诱导中间中胚层细胞和/或肾脏间充质干细胞中的应用，也属于本发明的保护范围。
129.所述的间充质干细胞无血清完全培养液在诱导肾脏间充质干细胞中的应用，也属
bmscs比较免疫调节能力，在炎症因子ifnγ刺激下，荧光定量pcr检测实施例5得到的im-mscs与对照例中人长骨骨髓分离得到的bmscs的ido-1的表达情况(图6a)；在与t细胞共培养条件下，流式检测实施例5得到的im-mscs与对照例中人长骨骨髓分离得到的bmscs对t细胞中炎症因子tnfα和ifnγ的表达情况(图6b)。
139.图7为实施例4中得到的im-cms与实施例5得到的im-msc，与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs用荧光定量pcr检测并比较vegf的基因表达量。
140.图8为实施例7中利用实施例4得到的im-cms与实施例5得到的im-mscs，与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs分别用于小鼠急性缺血性肾脏损伤模型治疗，用试剂盒测定后，酶标仪检测结果并进行比较，在肾脏急性损伤后第3、6和9天不同治疗组的血清肌酐(creatindine)检测图(图8a)，在肾脏急性损伤后第3、6和9天不同治疗组的尿素氮(bun)水平检测图(图8b)。
141.图9为实施例7中利用实施例4得到的im-cms与实施例5得到的im-mscs，与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs分别用于小鼠急性缺血性肾脏损伤模型治疗，在肾脏缺血损伤第9天后肾小管坏死分级评分图(图9a)；在肾脏缺血损伤第3天和9天后 tunel染色统计图(图9b)，及实施例5得到的im-mscs与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs表明在肾脏缺血损伤第3天和9天后tunel免疫荧光染色图(图9c)
142.图10为实施例8中利用实施例3中中间中胚层细胞在不同间充质干细胞培养液(mm
ꢀⅰ
、acf、stemfit)中诱导得到im-msc后，继续在相应培养液中的增殖速度检测图 (图10a)与扩增代数统计图(图10b)。
具体实施方式
143.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
144.以下实施例中荧光定量pcr使用的引物见下表：
145.20s,72℃延伸30s，共45次循环。以gapdh作为内参，采用2-δδct法计算基因表达量。
153.流式检测的方法：将细胞用accutase消化，1100rpm离心4min后弃上清，用50ul pbs 重悬细胞，用同型同源抗体(bd pharmingen)作为阴性对照(同型对照)。在另外的管中分别加入流式抗体(cd34、cd45、cd44、cd73、cd90、cd105)染色20min，用pbs 洗涤2次，每次5min，1100rpm离心4min后，弃上清，用200ul pbs重悬细胞后在流式细胞仪上机检测阳性细胞的比例。
154.实施例1一种多能干细胞诱导为特异性中间中胚层细胞的培养液组合物
155.stageⅰ培养液为含有10μm y27632的mtesr培养液。
156.stageⅱ培养液为含有、1％(v/v)its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、 100ng/ml activin a、10μm chir99021和10ng/ml bfgf的dmem-f12培养液。
157.stageⅲ培养液为含有、1％(v/v)its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、 10ng/ml bfgf、10ng/ml tgfβ1、100nm视黄酸(retinoic acid,ra)、1μm ldn193189的 dmem-f12培养液。
158.实施例2一种间充质干细胞无血清完全培养液
159.一种间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)：含有5％血清替代物kosr、、 1％(v/v)neaa细胞培养添加物、1％(v/v)its培养补充剂、5mm l-谷氨酸、1mm的β
‑ꢀ
巯基乙醇、300ng/ml维生素c、100μm尿苷、1ng/ml白血病抑制因子lif、2ng/ml的bfgf、 2ng/ml的egf、50ng/ml pdgfbb、50ng/ml pdgfab的dmem(l)培养液。
160.对照例1骨髓间充质干细胞(bmscs)的制备及培养方法
161.本实施例的目的在于说明本发明后续实施例中使用的骨髓间充质干细胞(bmscs)的分离、制备及培养方法。
162.其中使用密度梯度离心法分离人长骨骨髓中的间充质干细胞；使用的是间充质干细胞培养液进行扩增培养，其中间充质干细胞培养液为：实施例2中的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)、或市售商业化msc培养液(acf；stem cell technologies)或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)。
163.具体的操作步骤如下：
164.(1)将5ml的人骨髓液，用等体积pbs稀释混匀，室温下1500rpm离心10分钟；
165.(2)弃去脂肪层后将剩余的骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积ficoll分离液(1.077g/ml)上面，室温2500rpm离心30分钟；
166.(3)吸取分离液中界面为白膜状层的单个核细胞，用40ml pbs混悬后，室温1500rpm 离心10分钟；
167.(4)弃上清并用50ml pbs重复洗涤2次。
168.(5)用骨髓基质细胞培养液重悬细胞，进行扩增培养，以2
×
105/ml的细胞密度，接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5％co2培养箱中进行培养。
169.(6)于3天后首次换液，弃去悬浮细胞后，之后每2～3天换液一次。每日镜下观察细胞形态及生长变化，14天培养瓶中基本无悬浮细胞，所有细胞呈纤维状贴壁生长，且细胞状态良好。
170.(7)待细胞生长达80％～90％融合时，用accutase进行消化，按1：3比例进行传代培养，并将细胞用于后续实验。
171.实施例3人诱导多能干细胞(hipsc)向中间中胚层细胞(intermediate mesoderm cells, ims)诱导分化
172.一、扩增多能干细胞，保持其未分化状态
173.1、实验方法人诱导多能干细胞(hipsc)指的是人皮肤成纤维细胞诱导的多能干细胞，由实验室利用诱导多能干细胞技术(ipscs)构建获得。本实施例着重阐述在建立的多能干细胞系基础上进一步培养与分化操作。
174.多能干细胞需要在无饲养层条件下大规模扩增且保持未分化状态，细胞可选用stemcell公司的mtesr系列产品、e8培养液等。多能干细胞贴壁的培养皿需提前包被matrigel 或层粘连蛋白，保证高质量、状态好的多能干细胞是进行下一步诱导的关键。此时，多能干细胞呈扁平克隆样生长、细胞排列紧密，表达多能干细胞干性标志物sox2、nanog 等。
175.具体的操作步骤如下
176.(1)包被培养皿：冰上融解matrigel原液后，用冷的dmem-f12按体积1：100的比例稀释后加入孔板中37℃包被过夜备用。
177.(2)复苏多能干细胞：37℃水浴锅中快速解冻-80℃取出的胚胎干细胞(h1-es)或人诱导多能干细胞(hipsc)，转移至含有5ml mtesr培养液的15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
178.(3)培养多能干细胞：吸去包被的matrigel，以2ml mtesr重悬细胞，均匀接种细胞，放入37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置培养。每天更换培养液，观察细胞状态，培养直至克隆生长至80～90％的密度再次进行传代。
179.(4)细胞传代：pbs洗涤细胞两次，加入0.5mm的edta，于37℃孵育1至10min，弃去edta，以pbs轻轻吹打细胞，收集细胞团块至15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。利用1ml mtesr重悬细胞，以每孔100μl体积均匀地将细胞接种入事先铺有 matrigel的孔板中，放入37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
180.(5)拍照并染色鉴定：用leica显微镜拍取hipsc的克隆形态照片，并且将细胞用 4％多聚甲醛pfa固定后，进行免疫荧光染色鉴定其多能性。
181.(6)重复上述培养扩增步骤，以便获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
182.2、实验结果
183.图1为实施例1中培养的人诱导多能干细胞(hipsc)的形态白光图(图1a)及其干细胞多能性标记(sox2和nanog)的免疫荧光染色图(图1b)。可见细胞呈紧密的克隆生长，且其表达多能性干细胞标志性转录因子sox2和nanog。其中选用层粘连蛋白 ln包被细胞培养板，效果与matrigel差不多，能维持多能干细胞的多能性，保持克隆形态。说明本实施例中用于诱导的hipsc细胞确为多能干细胞。
184.二、人诱导多能干细胞(hipsc)向中间中胚层细胞(hipsc-ims)诱导分化
185.1、实验方法
186.(1)消化hipsc克隆：将上一步培养的hipsc克隆用1mlaccutase细胞消化液覆盖并在37℃培养箱消化3min，随后用5ml pbs稀释，收集hipsc单细胞至15ml离心管中， 1100rpm离心4min收集细胞沉淀，其中所使用的accutase细胞消化液购自stemcell。
187.(2)制备细胞悬液：弃上清，将细胞沉淀用1ml stageⅰ培养液重悬。
188.其中stageⅰ培养液为：mtesr培养液、1％(v/v)青链霉素、10μm y27632(calbiochem, san diego,ca)。
189.(3)贴壁培养24h：将上一步中用stageⅰ培养液重悬后的细胞，以1
×
104cm2的密度接种到matrigel或纤连蛋白提前包被的培养皿中贴壁培养24h。用leica显微镜拍取其细胞形态照片。
190.(4)stageⅱ阶段：将贴壁24h细胞的培养液更换成stageⅱ培养液培养2天，每天更换一次stageⅱ培养液。2天后用leica显微镜拍取其细胞形态照片，并且将细胞用4％多聚甲醛pfa固定后，进行免疫荧光染色鉴定原条阶段的细胞的标志物(t和mixl1)。
191.其中stageⅱ培养液为：dmem-f12培养液并添加1％(v/v)青链霉素混合液、 1％(v/v)its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、100ng/ml activin a、10μmchir99021和10ng/ml bfgf。
192.(5)stageⅲ阶段：在上步中的stageⅱ培养液培养2天后，换成stageⅲ培养液培养3天，每天更换一次stageⅲ培养液。在stageⅲ培养3天后用leica显微镜拍取其细胞形态照片，并且将细胞用4％多聚甲醛pfa固定后，进行免疫荧光染色鉴定中间中胚层细胞标志物(pax2)、轴旁中胚层细胞标志物(tbx6)以及侧板中胚层细胞标志物(hand1 和foxf1)。
193.其中stageⅲ培养液含有dmem-f12培养液并添加1％(v/v)青链霉素混合液、 1％(v/v)its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、10ng/ml bfgf、10ng/ml tgfβ1、 100nm视黄酸(retinoic acid,ra)、1μm ldn193189。
194.2、实验结果
195.图2为本实施例中人诱导多能干细胞(hipsc)向中间中胚层细胞诱导的示意图(图 2a)，hipsc消化后经stageⅰ培养液贴壁培养1天后的细胞形态、经stageⅱ培养液培养2天后的细胞形态图、经stageⅲ培养液培养3天后的细胞形态(图2b)。hipsc向ims 诱导过程中经stageⅱ培养液培养2天后的免疫荧光染色图(图2c)；hipsc向ims诱导过程中经stageⅲ培养液培养3天后的免疫荧光染色图(图2d)。
196.结果显示经stageⅱ培养液培养2天后的细胞形态区较为松散，别与hipsc紧密的克隆形态(图2b)，且表达原条阶段的标志(t和mixl1)，效率接近98％(图2c)，表明其stageⅱ培养液能高效的将hipsc诱导为原条阶段的细胞；而原条阶段的细胞经stage
ꢀⅲ
培养液诱导培养3天后可见清晰的单个细胞形态(图2b)，同时免疫荧光染色结果显示其高表达中间中胚层细胞标志物pax2(图2d)，而几乎不表达其他中胚层标志物(轴旁中胚层细胞tbx6、侧板中胚层细胞hand1和foxf1)，表明原条阶段的细胞经stage
ꢀⅲ
培养液诱导后能高效且特异性的诱导得到中间中胚层细胞。
197.上述证据表明本发明方案中多能干细胞依次经实施例1的stageⅰ、stageⅱ、stageⅲ培养液可以高效诱导得到特异性的中间中胚层细胞(ims)，解决了非限定诱导方法诱导的各中胚层细胞(包括pms和lms)混杂问题。
198.实施例4人诱导多能干细胞(hipsc)得到的中间中胚层细胞向后肾帽状间质细胞 (intermediate mesodermderived metanephric cap mesenchyme，im-cms)及成熟肾足细胞(podocytes)的诱导分化方法
199.1、实验方法
200.(1)诱导后肾帽状间质细胞(im-cms)：将实施例3中诱导得到的的中间中胚层细胞
(ims)用1mlaccutase细胞消化液覆盖并在37℃培养箱消化约3min，随后用5ml pbs 稀释，收集ims单细胞至15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞沉淀。随后将ims 以1
×
104cm2的密度接种到matrigel或纤连蛋白提前包被的培养皿中，并以im-cms-1培养液诱导1天后换成im-cms-2培养液继续培养3天后，得到im-cms。
201.其中im-cms-1培养液含有rpmi 1640培养液并添加1％(v/v)青链霉素混合液、 1％(v/v)neaa细胞培养添加物、100ng/ml bfgf、5μm chir99021、1μm视黄酸(retinoicacid,ra)。
202.其中im-cms-2培养液含有rpmi 1640培养液并添加1％(v/v)青链霉素混合液、 1％(v/v)neaa细胞培养添加物、100ng/mlfgf-9、10ng/ml activin a。
203.(2)诱导成熟肾足细胞(podocytes)：将实施例3中诱导得到的中间中胚层细胞(ims) 用1ml accutase覆盖并在37℃培养箱消化约3min，随后用5ml pbs稀释，收集ims单细胞至15ml离心管中，1100rpm离心4min收集细胞沉淀。随后将ims以1
×
104cm2的密度接种到matrigel或纤连蛋白提前包被的培养皿中，并以肾足细胞培养液进行诱导培养7天。
204.其中肾足细胞(podocytes)培养液含有rpmi 1640培养液并添加1％(v/v)青链霉素混合液、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、10ng/ml bfgf、10μm视黄酸(retinoic acid,ra)。
205.(3)拍照并染色鉴定：用leica显微镜拍取上述步骤(1)和步骤(2)中分别诱导得到的后肾帽间质细胞(im-cms)和成熟肾足细胞(podocytes)细胞形态图并且将细胞用 4％多聚甲醛pfa固定后，用免疫荧光染色分别鉴定标志物的表达情况。
206.(4)使用rnazol提取上述实施例3、以及本实施例4步骤(1)和步骤(2)中分别诱导得到的中间中胚层细胞(ims)、后肾帽间质细胞(im-cms)、成熟肾足细胞(podocytes) 的总rna后用逆转录试剂盒，按规范步骤将得到的rna进行逆转录。逆转录成cdna 后，荧光定量pcr检测中间中胚层标志物(pax2和pax8)、后肾帽间质细胞标志物(wt1 和six2)、以及成熟肾足细胞标志物(podocine和synaptopodin)的表达情况。
207.2、实验结果
208.图3为实施例4中人诱导多能干细胞诱导的中间中胚层细胞(hipsc-ims)向后肾帽间质细胞(im-cms)诱导的细胞形态图(图3a)以及其标志物(wt1)免疫荧光染色图 (图3b)；中间中胚层进一步诱导分化成成熟肾足细胞(podocytes)的细胞形态图(图 3c)以及其标志物(podocin)免疫荧光染色图(图3d)；以及中间中胚层细胞(pax2 和pax8)诱导分化成后肾帽间质细胞(wt1和six2)、成熟肾足细胞(podocine和 synaptopodin)过程中各阶段标志物的荧光定量pcr检测图(图3e)。
209.结果显示在实施例3中诱导得到的中间中胚层细胞有分化成后肾帽间质细胞 (im-cms)和成熟肾足细胞(podocytes)的潜能，表明体外分化方法得到的中间中胚层细胞(ims)有类似于体内中间中胚层细胞的发育潜能，可以为研究肾脏发育和肾脏细胞诱导提供完美的起源细胞。
210.实施例5人多能干细胞(hipsc)诱导得到的中间中胚层细胞向肾脏间充质干细胞的 (intermediate mesoderm cellsderived mesenchymal stem cells,im-mscs)诱导分化方法及结果检测
211.一、中间中胚层细胞向肾脏间充质干细胞的诱导分化方法
212.1、实验方法
213.将实施例3中制备得到的人多能干细胞(hipsc)来源的中间中胚层细胞进一步诱导为肾脏间充质干细胞使用的是间充质干细胞培养液，其中间充质干细胞培养液为：实施例 2中的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)、或市售商业化msc培养液(acf； stem cell technologies)或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)。
214.具体的操作步骤如下：
215.(1)细胞培养：实施例3制备得到的中间中胚层细胞(hipsc-ims)用accutase细胞消化液消化成单细胞后，用间充质干细胞培养液(实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)或市售商业化msc培养液(acf；stem cell technologies)，或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto))分别重悬细胞，并按4
×
104cm2的密度种于培养瓶中，每2～3天更换新鲜培养液，于37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置培养。其中所使用的accutase细胞消化液购自stemcell。
216.(2)细胞传代：细胞生长至80～90％融合后，用accutase细胞消化液，消化传代，将细胞转移入15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。之后将间充质干细胞培养液(实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)或市售商业化msc培养液(acf； stem cell technologies)，或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto))培养的细胞分别按4
×
104cm2的密度接种入新的细胞培养皿中继续培养。
217.(3)流式检测：重复上述步骤(2)，将上一步中使用的间充质干细胞培养液(实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)或市售商业化msc培养液(acf；stemcell technologies)，或市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto))诱导培养的细胞以accutase细胞消化液，消化成单细胞后，取部分细胞流式检测cd34、cd45、cd44、 cd73、cd90、cd105等；在诱导传代的过程中重复检测，直到cd44、cd105、cd73、 cd90达95％以上，cd34、cd45在2％以下，即得到中间中胚层来源的肾脏间充质干细胞。
218.二、肾脏间充质干细胞的多向分化能力的检测
219.1.实验方法
220.(1)成骨分化：用accutase消化收集实施例5中在间充质干细胞无血清完全培养液 (mmⅰ)中制备得到的肾脏间充质干细胞(im-mscs)，并接种在六孔板中至密度达 80～90％时，将培养液更换为成骨诱导分化培养液(dmem(l) 10％(v/v)fbs 10mm β-glycerophosphate 50μg/ml维生素c及100nm的地塞米松)，每3天换液一次，诱导培养21天后进行茜素红s染色。
221.(2)成脂分化：用accutase消化收集实施例5中在间充质干细胞无血清完全培养液 (mmⅰ)中制备得到的肾脏间充质干细胞(im-mscs)，并接种在六孔板中长至完全融合，此时将培养液换为成脂诱导分化培养液(dmem(h) 10％(v/v)fbs 100nm indo 0.5mm ibmx及1mm的地塞米松)，每3天换液一次，诱导培养21天后进行油红o 染色。
222.(3)成软骨分化：用accutase消化收集实施例5中在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中制备得到的肾脏间充质干细胞(im-mscs)，以2～3
×
105/1ml离心管的细胞量分接入15ml离心管中，300
×
g离心5min，弃上清，加入1ml软骨分化诱导培养液(dmem(h) 10ng/ml重组人转化生长因子(tgf-β3)，100nm地塞米松，50μg/ml 维生素c，1mm丙酮酸钠，40μg/ml脯氨酸及its培养补充剂 premix)，置于培养箱孵育培养。每3天换液一次，诱导培
养21天后进行阿辛蓝染色。
223.三、实验结果
224.图4为实施例5中人诱导多能干细胞诱导的中间中胚层细胞(hipsc-ims)在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中连续传代3周后的细胞形态图(图4a)，以及在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中培养得到的im-mscs在成骨、成脂、成软骨分化后的茜素红s染色、油红o染色、阿辛蓝染色图(图4a)；同时hipsc-ims在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中传代诱导3周后的细胞表面标记流式分析图(图 4b)。
225.图5为实施例4制备得到的im-cms与实施例5制备得到的im-mscs的扩增代数统计图。
226.结果显示，ims在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)在此过程中可见细胞形态变为梭形，贴壁并呈漩涡状生长；同时流式检测到cd44、cd105、cd73、cd90达95％以上，cd34、cd45在2％以下，表明诱导的细胞符合msc的标准，成功得到了中间中胚层来源间充质干细胞。同时茜素红s染色呈现深红色，表明钙结节形成，证实实施例5制备得到的im-mscs可诱导分化为成骨细胞；油红o染色呈现橘红色或鲜红色，表明有脂滴形成，证实im-mscs可向脂肪细胞分化；阿辛蓝染色呈紫蓝色，表明有丰富的软骨基质，证实实施例1制备得到的im-mscs可向软骨细胞分化。另外，实施例5制备得到的 im-mscs与实施例4制备得到的im-mscs相比，能在体外长时间扩增，获得大量的细胞。
227.综述所述，本发明的制备方法不仅能高效的得到肾脏间充质干细胞，且其在体外能大量扩增，解决了成熟肾脏细胞诱导周期长、诱导效率低且在体外扩增代数受限的问题，为临床细胞治疗肾脏损伤提供了充足的细胞基础。
228.实施例6肾脏间充质干细胞(im-mscs)的免疫调节能力检测
229.一、检测肾脏间充质干细胞(im-mscs)在炎症因子ifnγ刺激下的ido-1表达情况
230.1、实验方法
231.(1)常规消化实施例5中在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中制备得到的肾脏间充质干细胞(im-mscs)，用mmⅰ重悬细胞后接种到六孔板中，并培养至细胞长至80％左右；
232.(2)当细胞密度达到80％之后，每孔加入20ng/ml ifnγ，24h后，用accutase细胞消化液，消化im-mscs，收集约1
×
105细胞并加入1mltrizol室温裂解5min，准备提取 rna；
233.(3)室温裂解5min后1ml trizol中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置10min；随后2～8℃10000
×
g离心15min。此时样品分为三层，rna主要在水相中，现重新把水相转移到新ep管中；
234.(4)将收集的上清在2～8℃10000
×
g离心10min，离心后可见在管侧和管底出现白色沉淀。移去上清，用75
℅
乙醇洗涤rna沉淀，随后在2～8℃10000
×
g离心5min。重复一次清洗后，将沉淀晾干，用10～50μl ddh2o溶解；
235.(5)用逆转录试剂盒，按规范步骤将得到的rna进行逆转录。最后将得到的im-mscs 的cdna进行荧光定量pcr，检测不同组的细胞在ifnγ作用下ido-1(吲哚胺-2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxy-genase 1，ido-1)的表达情况。
236.二、检测肾脏间充质干细胞(im-mscs)在体外免疫调节能力
237.1、实验方法
238.(1)常规消化实施例5中在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中制备得到的肾脏间充质干细胞(im-mscs)。用间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)重悬细胞，制成4
×
104/cm2的悬液铺至24孔板中过夜；
239.(2)流式分选cd3 t细胞，利用含有10％(v/v)fbs的rpmi-1640培养液重悬细胞沉淀；
240.(3)按1：5的比例将t细胞接种至事先铺好实施例1制备得到的im-mscs的24 孔板中，放置于37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置培养3天。3天后，提前6h 加入刺激剂进行预处理，将t细胞收集入15ml离心管，500g离心10min收集细胞；
241.(4)使用100μl pbs将细胞沉淀重悬后，加入100μl 4％(v/v)多聚甲醛固定液(pfa)，室温固定15min；
242.(5)加入0.2％(v/v)皂苷进行穿透，同时加入适量的tnfα抗体进行室温染色30min；
243.(6)利用pbs洗涤抗体2次，以300μl pbs重悬细胞沉淀，流式检测仪上机。三、实验结果
244.图6为本实施例中利用实施例5在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中培养得到的im-mscs与对照例中人长骨骨髓分离得到的bmscs比较免疫调节能力。在炎症因子ifnγ刺激下，荧光定量pcr检测实施例5得到的im-mscs与对照例中人长骨骨髓分离得到的bmscs的ido-1的表达情况(图6a)；在与t细胞共培养条件下，流式检测实施例5得到的im-mscs与对照例中人长骨骨髓分离得到的bmscs对t细胞中炎症因子tnfα和ifnγ的表达情况(图6b)。
245.结果显示实施例5在间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中培养得到的 im-mscs与对照例中人长骨骨髓分离得到的bmscs相比，其在炎症因子ifnγ刺激下ido-1的表达更高，具有统计学差异；且在t细胞共培养条件下，对t细胞炎症因子tnfα的分泌具有更好的抑制作用。表明诱导得到的肾脏间充质干细胞在炎症刺激状态下通过表达更高的ido-1来抑制淋巴细胞的增殖，诱导t调节细胞(tregs)生成，能更好的调节过度活化的免疫系统，减少免疫应激；同时在与t细胞共培养时更好的抑制炎症因子tnfα的分泌,从而有效的抑制炎症反应。
246.上述证据表明肾脏间充质干细胞(im-mscs)具有很好的免疫调节能力，在炎症状态下能有效抑制炎症因子分泌，减少免疫应激。
247.实施例7肾脏间充质干细胞(im-mscs)治疗小鼠急性缺血性肾损伤
248.一、实验方法
249.本实施例中使用的是实施例4中得到的im-cms、实施例5在实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中培养得到的肾脏间充质干细胞(im-mscs)与对照例1 中分离并在实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)得到的骨髓间充质干细胞(bmscs)。
250.1、实验方法
251.(1)使用rnazol提取实施例4中得到的im-cms、实施例5在实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中培养得到的im-mscs与对照例1中分离并在实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)得到的bmscs的总rna后，用逆转录试剂盒，按规范步骤将得到的rna进行逆转录成cdna，随后荧光定量pcr检测vegf 的表达情况。
252.(2)使用c57bl/6小鼠进行体内实验，每组在每个时间(0、3、6和9天)各设置5 只小鼠。氯胺酮(150μg/ml)麻醉小鼠后，剪开腹后侧肾脏的位置，用非创伤性微动脉瘤钳钳住肾蒂引起肾脏缺血25分钟，建立小鼠急性缺血性肾损伤模型。同时收取0天小鼠的样品，用于下列检测。
253.(3)缺血损伤造模成功的第2天，每组造模小鼠尾静脉分别注射经cm-dii标记的实施例4中得到的im-cms、对照例1中分离得到的bmscs以及实施例5制备得到的 im-mscs各2
×
106cells/200ul细胞悬液，同时另设一组小鼠尾静脉注射200μl pbs作为对照组。
254.(4)分别在缺血损伤造模成功后3、6或9天麻醉处死小鼠，收取其血清和肾脏，使用crea-plus试剂盒(roche，usa)测定血清肌酐和bun水平，同时每组在400倍显微镜下观测10个不同的区域肾脏损伤恢复情况，进行肾小管坏死分级评分。
255.(5)同时在缺血损伤造模成功后3和9天时间点使用tunel染色试剂盒(roche，usa)检测急性缺血性肾脏的凋亡细胞，用dapi(sigma aldrich，usa)对细胞核进行复染。使用蔡司lsm710共聚焦显微镜采集图像。在10个随机区域中统计tunel阳性细胞百分比。
256.2、实验结果
257.图7为实施例4中得到的im-cms与实施例5得到的im-msc，与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs用荧光定量pcr检测并比较vegf的基因表达量。
258.图8为本实施例中利用实施例4得到的im-cms与实施例5得到的im-mscs，与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs分别用于小鼠急性缺血性肾脏损伤模型治疗，用试剂盒测定后，酶标仪检测结果并进行比较。在肾脏急性损伤后第3、6和9天不同治疗组的血清肌酐(creatinine)检测图(图8a)，在肾脏急性损伤后第3、6和9天不同治疗组的尿素氮(bun)水平检测图(图8b)。
259.图9为实施例7中利用实施例4得到的im-cms与实施例5得到的im-mscs，与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs分别用于小鼠急性缺血性肾脏损伤模型治疗，在肾脏缺血损伤第9天后肾小管坏死分级评分图(图9a)；在肾脏缺血损伤第3天和9天后 tunel染色统计图(图9b)，及实施例5得到的im-mscs与对照例1中长骨骨髓分离得到的bmscs表明在肾脏缺血损伤第3天和9天后tunel免疫荧光染色图(图9c)
260.结果显示由实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)制备得到的 im-mscs相较于im-cms及bmscs，有更好的小鼠急性缺血性肾脏损伤修复能力，其在肾脏急性损伤后第3、6和9天都显著降低血清肌酐(图8a)和bun水平(图8b)；同时表现出较低的肾小管坏死分级评分(图9a)；tunel染色表明在缺血损伤后3天和9 天，im-mscs治疗组其肾脏损伤部位凋亡的细胞更少(图9b和图9c)，具有统计学差异。
261.上述结果表明肾脏间充质干细胞(im-mscs)在肾损伤修复中具有更好的损伤修复能力，其可能将会是临床治疗肾脏损伤等相关疾病中新的、高质量的细胞来源。
262.实施例8比较肾脏间充质干细胞(im-mscs)在不同msc培养液中的增殖速度和扩增代数
263.本实施例着重阐述在建立的胚胎干细胞系基础上进一步培养与诱导分化为肾脏间充质干细胞操作。
264.一、胚胎干细胞(h1-es)诱导分化为中间中胚层细胞(h1-ims)
265.胚胎干细胞(h1-es)通过商业化购买获得。在无饲养层条件下，提前用基质胶或层
黏连蛋白ln包被培养板并选用stem cell公司的mtesr系列产品、e8培养液等大规模扩增，保持未分化状态。
266.1、实验方法
267.(1)消化胚胎干细胞(h1-es)克隆：将上一步培养的h1-es克隆用1mlaccutase细胞消化液覆盖并在37℃培养箱消化3min，随后用5ml pbs稀释，收集hipsc单细胞至15ml 离心管中，1100rpm离心4min收集细胞沉淀，其中所使用的accutase细胞消化液购自 stemcell。
268.(2)制备细胞悬液：弃上清，将细胞沉淀用1ml stageⅰ培养液重悬。
269.其中stageⅰ培养液为：mtesr培养液、1％(v/v)青链霉素、10μm y27632(calbiochem, san diego,ca)。
270.(3)贴壁培养24h：将上一步中用stageⅰ培养液重悬后的细胞，以1
×
104cm2的密度接种到matrigel或层黏连蛋白ln提前包被的培养皿中贴壁培养24h。
271.(4)stageⅱ阶段：将贴壁24h细胞的培养液更换成stageⅱ培养液培养2天，每天更换一次stageⅱ培养液。
272.其中stageⅱ培养液为：dmem-f12培养液并添加1％(v/v)青链霉素混合液、 1％(v/v)its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、100ng/ml activin a、10μm chir99021和10ng/ml bfgf。
273.(5)stageⅲ阶段：在stageⅱ培养液培养2天后，换成stageⅲ培养液培养3天，每天更换一次stageⅲ培养液。
274.其中stageⅲ培养液含有dmem-f12培养液并添加1％(v/v)青链霉素混合液、1％(v/v) its培养补充剂、1％(v/v)neaa细胞培养添加物、10ng/ml bfgf、10ng/ml tgfβ1、100nm 视黄酸(retinoic acid,ra)、1μm ldn193189。
275.二、胚胎干细胞(h1-es)来源中间中胚层细胞向肾脏间充质干细胞(im-mscs)诱导分化方法
276.1、实验方法
277.上步中通过胚胎干细胞(h1-es)诱导获得的中间中胚层细胞(ims)向肾脏间充质干细胞(im-mscs)诱导使用的是间充质干细胞培养液，其中间充质干细胞培养液包括：实施例2中的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)、市售商业化msc培养液(acf； stem cell technologies)市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)。
278.具体的操作步骤如下：
279.(1)细胞培养：上一步制备得到的中间中胚层细胞(h1-ims)用accutase细胞消化液消化成单细胞后，用间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)、市售商业化msc培养液(acf；stemcell technologies)、市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto) 分别重悬中间中胚层细胞(h1-ims)，并按4
×
104cm2的密度分别种于培养瓶中，每3天更换新鲜培养液，于37℃、5％co2和95％湿度的培养箱中静置培养。其中所使用的 accutase细胞消化液购自stemcell。
280.(2)细胞传代：细胞生长至80～90％融合后，用accutase细胞消化液，消化传代，将细胞转移入15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。之后将用实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)、或市售商业化msc培养液(acf；stem celltechnologies)、市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)培养的细胞分别按4
×
104cm2的密度接种入新的细胞培
养皿中继续培养。
281.(3)流式检测：重复上述步骤(2)，将上一步中使用的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)，或市售商业化msc培养液(acf；stem cell technologies)，市售商业化msc培养液(stemfit；ajinomoto)诱导培养的细胞分别以accutase细胞消化液，消化成单细胞后，分别取部分细胞流式检测cd34、cd45、cd44、cd73、cd90、cd105 等；在诱导传代的过程中重复检测，直到cd44、cd105、cd73、cd90达95％以上，cd34、 cd45在2％以下，即得到三种不同间充质干细胞培养液(mmⅰ、acf、stemfit)诱导的中间中胚层来源的肾脏间充质干细胞。
282.三、比较三种不同间充质干细胞培养液(mmⅰ、acf、stemfit)诱导的中间中胚层来源的肾脏间充质干细胞(im-mscs)在不同msc培养液中的增殖速度和扩增代数
283.1、实验方法
284.(1)cck8检测增殖速度：将上一步中制备得到的三种不同间充质干细胞培养液(mm
ꢀⅰ
、acf、stemfit)诱导的中间中胚层来源的肾脏间充质干细胞(im-mscs)用accutase 细胞消化液消化成单细胞后，将三种细胞分别取1000个细胞种到96孔板中，每种细胞种 7块96孔板。随后每种细胞每天取一块96孔板利用cck-8试剂盒(cck-8)检测细胞增殖速度。其是弃去旧培养液后，在各自的新鲜培养液中加入10％的cck-8，在37℃的孵箱中孵育2小时后，用酶标仪检测波长在450nm处的吸光度。
285.(2)统计细胞传代次数：将上一步中制备得到的三种不同间充质干细胞培养液(mm
ꢀⅰ
、acf、stemfit)诱导的中间中胚层来源的肾脏间充质干细胞(im-mscs)生长至 80～90％融合后，将之进行传代，并统计为一次，其是用accutase消化传代，继续分别在三种不同间充质干细胞培养液(mmⅰ、acf、stemfit)中继续培养。待下一次细胞生长至80～90％融合后，继续进行传代，并统计为二次。按这样连续传代，并统计结果，直到细胞无法增殖传代。
286.四、实验结果
287.图10为实施例8中利用实施例3中中间中胚层细胞在不同间充质干细胞培养液(mm
ꢀⅰ
、acf、stemfit)中诱导得到im-msc后，继续在相应培养液中的增殖速度检测图 (图10a)与扩增代数统计图(图10b)。
288.结果显示除了实施例2的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)可诱导im-mscs 外，市售商业化msc培养液(acf和stemfit)同样可以诱导im-mscs；同时实施例2 的间充质干细胞无血清完全培养液(mmⅰ)中诱导得到的im-mscs其增殖速度更快、扩增代数更多，有统计学差异。
289.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。