对革兰氏阴性细菌也具有抗菌或抑菌活性的天然提取物的组合物的制作方法

对革兰氏阴性细菌也具有抗菌或抑菌活性的天然提取物的组合物
1.本发明涉及一种混合物m，该混合物包括以下或由以下组成：(a)松萝酸和/或(b)其盐，优选所述松萝酸和/或其盐为外消旋或右旋d( )形式。此外，本发明涉及一种半成品ps，优选以半固体膏剂或糊剂形式，包含：所述混合物m和树脂，以及涉及一种成品pf，优选液体或分散体形式，包含所述半成品ps和油漆产品。所述混合物m、所述半成品ps和成品pf显示出抗细菌、抗细菌增殖、抑细菌、杀微生物、防霉菌、抗酵母(例如念珠菌)、抗真菌或抗霉菌(antimycotic)(例如酵母菌)活性，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的活性，例如抗学名为克雷伯氏菌、肠内菌(enterobafferiacee)、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些的活性。最后，本发明涉及一种使表面具有抗细菌性、抗细菌增殖性、抑细菌性、杀微生物性、防霉性、抗酵母(例如念珠菌)性、抗真菌性或抗霉菌(例如酵母菌)性，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的方法，所述方法提供通过喷涂、辊涂或刷涂技术将所述混合物m、所述半成品ps和成品pf施涂在所述表面上。
2.此外，本发明涉及一种包合物(ci)，其包括以下或由以下组成：(i)天然来源的作为对映体的d-松萝酸，或其盐或它们的混合物和(ii)β-环糊精。所述包合物(ci)对革兰氏阳性致病菌和革兰氏阴性致病菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些都具有抗菌或抑菌活性。此外，本发明涉及所述包合物(ci)作为革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抗菌或抑菌剂的应用。此外，本发明涉及一种液体组合物，包括以下或由以下组成：(a)所述包合物(ci)；(b)丙烯酸类树脂、聚氨酯树脂或丙烯酸-聚氨酯树脂，或其混合物；(c)可选的颜料或遮光剂；和(d)水。此外，本发明还涉及将所述液体组合物用作表面和墙壁的油漆或建筑涂料的应用，优选用作抗菌或抑菌的建筑涂料，既对革兰氏阳性和革兰氏阴性的致病菌都有抗性，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些。最后，本发明涉及环糊精，优选是β-环糊精，例如(2-羟基丙基)-β-环糊精，作为从松萝酸的外消旋混合物选择性络合d-松萝酸或其盐或其混合物的选择性络合剂的应用，松萝酸的外消旋混合物以天然材料为原料通过也是本发明主题的提取过程获得。
3.致病性微生物，也称为致病剂，是对宿主生物体内疾病的发生负责的生物制剂。它们被区分为：病毒；原核生物：细菌；真核生物：真菌(mycetes)和原生动物。致病性，或决定病态的一般能力，由两个因素界定：(i)毒力，表示产生疾病的能力的大小；(ii)侵入性，即侵入宿主组织并在其中繁殖的能力。侵袭性又取决于以下因素：粘附性，即病原体用其外表面结构与宿主细胞的受体部位结合的能力；产生有利于破坏宿主组织的胞外酶；产生抗吞噬物质或存在抗吞噬囊，使病原体能够抵御宿主的防御机制。长期以来，由于多重耐药微生物的传播，医院感染(与医疗机构内的护理有关的传染病)的发病率增加，一直是研究和调查的主题。许多科学研究表明，医院的环境表面在医院内各种微生物的污染、持续存在和传播方面起着突出的作用；这些表面因此成为住院设施中病原体的持久储存库。在医院环境以及其他环境中，有必要限制有害细菌的载量(不仅如此)，让患者呆在尽可能无菌的环境中。同样的情况也适用于学校、幼儿园、运动场或公共场所，如超市和购物中心，在这些地方，由于人数众多，往往有非常高的细菌载量。此外，感染性(致病性)微生物已经进化成能
够抵御迄今为止市场上大多数抗生素的菌株。因此，使用对活的微生物(包括抗药性的微生物)仍然未知的活性物质或化合物，对表面进行处理可能是非常有用的，例如由织物、皮革、木材、玻璃、塑料、钢铁、油毡或混凝土墙壁和地板制成的表面，以便使微生物在经过处理的表面上难以扩散或尽可能地减少。要处理的表面的实例，可以例如但不限于在医疗诊所、急诊室、医院、牙科诊所、运动场、幼儿园、学校或公共或私人设施中的盥洗室和厕所，或例如在超市和购物中心或运动场中发现。
4.在意大利，住院期间感染的概率为6％，每年的病例数从45万至70万，估计每年的死亡人数约为7800人。后面的统计数字使意大利在欧洲国家中不幸地居于首位。目前，环境污染的表面使用洗涤混合物或合成消毒剂进行处理，其除了无效或不适合防止短期再污染(消毒后30分钟内)的情况外，还对环境有很大影响。
5.因此，感觉需要有表面处理、活性化合物和活性组合物，其对环境的影响较小，而且可能完全具有自然来源。因此，仅使用合成剂进行消毒不能保证医院、幼儿园或学校的健康和安全环境，因为它不能长期保持环境表面的卫生。因此，需要处理、活性化合物和活性组合物，其对环境的影响较小，能够减少或对抗病原体细菌的载量，或有效对抗公共和私人环境和空间(例如医院或幼儿园或学校)中病原体细菌的污染、持续存在和传播，防止病原体细菌繁殖和/或产生抗性。
6.经过长期深入的研究和开发活动，申请人开发了一种混合物m，一种含有所述混合物m和树脂的半成品ps，一种含有所述半成品ps和油漆产品的成品pf，一种包合物和其组合物，能够对现有的限制、缺点和问题作出充分的解决。此外，申请人完善了一种表面处理方法，其使得用混合物m、含有所述混合物m和树脂的半成品ps、含有所述半成品ps和油漆产品的成品pf、包合物及其组合物处理的所述表面具有抗细菌性、抗细菌增殖性、抑细菌性、杀微生物性、防霉性、抗酵母性、抗真菌或抗霉菌性，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌。
7.可以施涂所述混合物m、含有所述混合物m和树脂的所述半成品ps、含有所述半成品ps和油漆产品的所述成品pf、所述包合物及其组合物的表面的实例是，例如水平或垂直表面，例如由混凝土、石灰或石膏板、油毡或聚氯乙烯(pvc)、聚酰胺(pa)、聚乙烯(pe)、聚酯(pes)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(ptf)制成的表面。这种类型的表面，不受限制，例如可以在医疗诊所、急诊室、医院、牙科诊所、运动场、幼儿园、学校或盥洗室和厕所设施中，例如存在于公共或私人设施中，或例如在超市和购物中心或运动场。或者它们可能是由织物、无纺布(nwf)、天然皮革、人造或合成皮革、皮、木材、玻璃、塑料、聚合物、铝、钢、油毡制成的表面。
8.本发明的一个目的是一种混合物m，它包括松萝酸和/或其盐，优选是松萝酸钠盐，所述松萝酸和/或其盐优选是天然来源的外消旋体或右旋体d( )形式，具有所附权利要求中报告的特征。
9.形成的本发明的一个目的是所述混合物m作为抗细菌剂、抗细菌增殖剂、抑细菌剂、杀微生物剂、防霉剂、抗酵母(例如念珠菌)剂、抗真菌或抗霉菌(antimycotic)(例如酵母菌)剂，优选抗革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些细菌的应用，所述应用具有所附权利要求中报告的特征。
10.形成的本发明的一个目的是一种使表面具有抗细菌性、抗细菌增殖性、抑细菌性、
杀微生物性、防霉性、抗酵母性、抗真菌或抗霉菌性，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些的方法，所述方法提供通过喷涂、辊涂或刷涂技术将所述混合物m施涂到所述表面上，所述方法具有所附权利要求中报告的特征。
11.优选的是，所述待处理的表面也可以首先进行预处理，以增加所述混合物m在所述表面上的附着力、稳定性或有效性。该预处理例如可以是机械式的，例如用金刚砂对表面进行机械研磨，也可以是化学式的，例如应用浸泡液，或涂膜，例如聚合物膜或油漆或固定剂或粘附剂。
12.形成的本发明的一个目的是一种半成品ps，包括所述混合物m和树脂，其具有所附权利要求中报告的特征。举例来说，该树脂是那些在清漆、瓷漆和油漆(水基或有机溶剂基；透明、光亮或不透明，或彩色)领域的技术人员已知的树脂，例如单组分或双组分树脂。树脂通过本领域技术人员已知的程序和装置添加到所述混合物m中。
13.形成的本发明的一个目的是半成品ps作为抗细菌剂、抗细菌增殖剂、抑细菌剂、杀微生物剂、防霉剂、抗酵母(例如念珠菌)剂、抗真菌或抗霉菌(例如酵母菌)剂，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些细菌的应用，所述应用具有所附权利要求中报告的特征。
14.形成的本发明的一个目的是一种使表面具有抗细菌性、抗细菌增殖性、抑细菌性、杀微生物性、防霉性、抗酵母性、抗真菌或抗霉菌性，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些的方法，所述方法提供通过喷涂、辊涂或刷涂技术将所述半成品ps施涂在所述表面上，所述方法具有所附权利要求中报告的特征。
15.优选的是，所述待处理的表面也可以先进行预处理，以增加所述半成品ps在所述表面上的附着力、稳定性或有效性。该预处理可以是机械式的，例如用金刚砂对表面进行机械研磨，也可以是化学式的，例如应用浸泡液，或涂膜，例如聚合物膜或油漆或固定剂或粘附剂。
16.形成的本发明的一个目的是包含所述半成品ps和油漆产品的成品pf，其具有所附权利要求中报告的特征。举例来说，油漆产品是例如那些在清漆、瓷漆和油漆(水基或有机溶剂基；透明、有光泽或不透明，或彩色)领域的技术人员已知的产品。油漆产品通过本领域技术人员已知的程序和装置添加到所述半成品ps中。
17.形成的本发明的一个目的是成品pf用作抗细菌剂、抗细菌增殖剂、抑细菌剂、杀微生物剂、防霉剂、抗酵母(例如念珠菌)剂、抗真菌或抗霉菌(例如酵母菌)剂，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些的应用，所述应用具有所附权利要求中报告的特征。
18.形成的本发明的一个目的是一种使表面具有抗细菌性、抗细菌增殖性、抑细菌性、杀微生物性、防霉性、抗酵母(例如念珠菌)性、抗真菌性或抗霉菌(例如酵母菌)性，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠内菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的那些的方法，所述方法提供通过喷涂、辊涂或刷涂技术将成品pf施涂在所述表面上，所述方法具有所附权利要求中报告的特征。
19.在一个实施方式中，所述待处理的表面也可以首先进行预处理，以增加所述成品
pf在所述表面上的附着力、稳定性或有效性。该预处理可以是机械式的，例如用金刚砂对表面进行机械研磨，也可以是化学式的，例如应用浸泡溶液，或涂膜，例如聚合物膜或油漆或固定剂或粘附剂。
20.在一个实施方式中，成品pf，优选以液体或分散体的形式，包括所述半成品ps，和油漆产品，例如彩色、不透明或透明的油漆产品。所述油漆产品例如可以是水基或有机溶剂基清漆、瓷漆或油漆。所述半成品ps(优选为膏剂或半固体糊剂)与清漆或瓷漆或油漆(优选为液体或分散体状)之间的组合或联合，产生了彩色、不透明或透明油漆形式的成品，或彩色、不透明或透明瓷漆形式的成品，或彩色、不透明或透明油漆形式的成品。后一种清漆、瓷漆或油漆形式的成品可以用喷涂、辊涂或刷涂技术施涂在可能经过预处理的表面上，以便使所述表面，例如医院中的由木或钢或玻璃或混凝土墙制成的表面具有抗细菌性、抗细菌增殖性、抑细菌性、杀微生物性、防霉性、抗酵母性、抗真菌性或抗霉菌性，优选抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的特性。
21.在另一个实施方式中，半成品ps或成品pf例如可以添加到来自通常用于制备涂膜或彩色、不透明或透明膜的聚合物材料(例如pvc、pe或ptf)中。然后，该聚合物膜或膜材料被定位和固定，例如使用胶水或通过热加热定位和固定在桌子、厨房架子或墙壁的例如由木、塑料、铝或钢制成的表面。
22.在另一个实施方式中，半成品ps或成品pf可以添加到通常用于处理或抛光天然或合成皮革，例如椅子或扶手椅的溶液或膏剂中。
23.此外，形成的本发明的一个目的是一种包合物(ci)，其包含以下或由以下组成：(i)作为对映体(优选是作为纯的对映体)的d-松萝酸，或其盐，或它们的混合物，和(ii)β-环糊精，具有所附权利要求中定义的特征。所述d-松萝酸化合物(i)是天然来源的，因为它是通过从天然材料开始的工艺提取的。
24.此外，形成的本发明的一个目的是所述包合物(ci)作为对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抗菌剂或抑菌剂的应用，其特征如所附权利要求中所定义。
25.此外，形成的本发明的一个目的是一种液体组合物，它包括以下或由以下组成：(a)所述包合物(ci)；(b)丙烯酸类树脂、聚氨酯树脂或丙烯酸-聚氨酯树脂，或其混合物；(c)可选的颜料或遮光剂；以及(d)水，其具有所附权利要求中定义的特征。
26.此外，形成的本发明的一个目的是所述液体组合物作为表面和墙壁的油漆或建筑涂层，优选是作为既针对革兰氏阳性细菌又针对革兰氏阴性细菌的抗菌或抑菌建筑涂层的应用，其具有所附权利要求中定义的特性。
27.最后，形成的本发明的一个目的是环糊精，优选是β-环糊精，例如(2-羟基丙基)-β-环糊精，作为d-松萝酸，或其盐，或其混合物的选择性络合剂的应用，其具有所附权利要求中定义的特征。
28.现在将参照以非限制性实例的方式提供的附图对本发明进行说明，其中：
[0029]-图1示例了根据可能的实施方式的用于生产松萝酸的方法的流程图；
[0030]-图2显示了根据可能的实施方式的d-松萝酸的固体颗粒的平均分布；
[0031]-图3和4分别图示了与实施例2和实施例3有关的细菌活性r；
[0032]-图5表示实施例4中使用的测试；
[0033]-图6图示了实施例4中讨论的微生物载量的减少；
[0034]-图7、8、9和10显示了实施例5中讨论的微生物监测的结果；
[0035]-图11涉及将根据本发明的成品pf施涂于表面后，与松萝酸和/或其盐的晶格的最初形成(开始交联)有关的显微镜图像；
[0036]-图12涉及将根据本发明的成品pf施涂于表面后，所述成品pf中所含的溶剂开始从表面蒸发时，与松萝酸和/或其盐的结晶开花(flowering)(交联的继续)有关的显微镜图像；
[0037]-图13指的是将根据本发明的成品pf施涂于表面，所述成品pf中所含的溶剂从表面蒸发后，与松萝酸和/或其盐的晶体完全形成有关的显微镜图像；
[0038]-图14指的是由松萝酸晶体和/或其盐对存在于用根据本发明的成品pf处理的表面上的细菌的细胞壁造成的刺穿作用的显微镜图像。
[0039]
因此，形成的本发明的一个目的是一种包合物(ci)，它包括以下或由以下组成：(i)作为对映体(优选是纯对映体)的d-松萝酸，或其盐，或它们的混合物，和(ii)环糊精。所述(i)d-松萝酸是天然来源的，因为它是通过也作为本发明主题的方法从天然材料中提取的。另外，所述(ii)β-环糊精也是天然来源的。因此，所述包合物(ci)也是天然来源的。所述包合物(ci)有利地对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌都具有抑菌或抗菌活性。
[0040]
在本说明书中，表述“包合物”是指类似于化学络合物的化学结构，其中化合物(主体)可以有相互之间相等或不同的一定尺寸的空腔(例如，一个或两个或三个空腔，优选是一个)，其中可以分配、定位或建立第二种化学化合物(客体)的分子(例如一个或两个或三个分子，优选是一个)，其尺寸与各自空腔的尺寸相似，其中主体和客体非共价结合，通常是通过分子间的力，如范德瓦尔斯力。环糊精是由6、7或8个d-( )吡喃葡萄糖单体通过α1-4糖苷键结合在一起形成并且是环密闭的天然环状低聚糖，具有彼此之间相等或不同的一定大小的空腔(例如一个或两个空腔)。本发明的环糊精(ii)形成了分子笼，界定了亲脂性空腔，能够容纳本发明的作为对映体的d-松萝酸，或其盐，或它们的混合物(i)。
[0041]
优选地，用于包合物(ci)中的所述环糊精(ii)选自包括以下或由以下组成的组：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精及其混合物的组。更优选地，所述环糊精(ii)是β-环糊精。
[0042]
在实施方式中，(ii)环糊精选自β-环糊精。该(ii)环糊精包括以下或由以下组成：(2-羟基丙基)-β-环糊精(cas no 128446-35-5)。
[0043]
事实上，(2-羟基丙基)-β-环糊精与其他物质一起被证明是从本发明的方法中得到的松萝酸的外消旋混合物(或外消旋物)中有利地选择d-松萝酸或其盐，或其混合物的选择性络合剂。
[0044]
外消旋松萝酸(cas号：125-46-2)是地衣的生物活性次级代谢物。由于在水中的溶解度较低(0,06mg/cm3，在20℃室温和1个大气压下)，上述松萝酸的大规模使用一直受到限制。
[0045]
因此，松萝酸在水中的溶解度一直是，并且仍然是对其使用的一个巨大限制。此外，关于松萝酸(或其相关盐)在抗菌活性方面的功效，本发明的发明人观察到，它取决于松萝酸的来源(天然或合成)和使用的异构体(左旋体(-)和/或右旋体( ))的类型。据观察，来自松萝的天然来源的右旋形式( )比合成来源的右旋形式( )更稳定、有效和有活性。
[0046]
经过紧张深入的研究活动，本发明的发明人出人意料地发现，通过形成包合化合物(ci)，可以使松萝酸的d对映体或其盐或它们的混合物在水中的溶解度(i)提高不同的数
量级(例如高达约4,2mg/cm3，考虑到相同的温度20℃和1个大气压)。如上所述，在这种化合物(ci)中，环糊精(主体)的亲脂腔通过可逆的非共价相互作用包合d-松萝酸或其盐，或它们的混合物(i)(客体)。事实上，在包合物(ci)的形成过程中，没有形成共价键，也没有破坏共价键。-至少是主要的-促进包合物形成的机制是溶剂分子(优选是水分子)从环糊精空腔(ii)中释放出来，这是一种高焓交换反应。由于这种主体/客体的相互作用(可逆的静电化学结合)，本发明的发明人惊奇地发现，d-松萝酸或其盐或它们的混合物(i)在包合物中没有被困住/限制或无法发挥其功能，相反，它很容易从其主体的亲脂性空腔中释放出来，因此很容易就能发挥其活性。此外，包合物(ci)使d-松萝酸(或其盐)相容于水溶液或水分散体或水悬浮液中。当含有所述包合物(ci)的所述水溶液或分散体或悬浮液被手动
‑‑
通过喷涂或机械
‑‑
施涂到诸如医院或幼儿园或学校房间的墙壁或地板的表面时，所述包合物(ci)中含有的所述酸或其盐能够被放置、粘附并均匀地涂覆所述表面，就像涂抹油漆一样。
[0047]
作为对映体(i)，优选是纯对映体的所述d-松萝酸是天然来源的，并且作为化学结构，可以与具有cas no.7562-61-0的相应合成化合物，即所述酸的右旋对映体相关联。作为本发明的纯对映体，d-松萝酸可溶于氯仿和乙酸乙酯。而它在乙醇中的溶解度中等，不溶于水。作为纯对映体的所述d-松萝酸的熔点为192℃至204℃，闪点为223℃，沸点为605℃。优选的是，作为纯对映体的所述d-松萝酸盐是钠盐。所述包合物(ci)优选包括作为纯对映体的d-松萝酸，或其盐，或它们的混合物(i)的固体颗粒。更优选地，所述固体颗粒的平均颗粒分布为0.01微米至50微米，优选0.1微米至30微米，更优选0.15微米至20微米，甚至更优选0.2微米至15微米。根据gb/t 19077-2016标准，例如用malvern mastersizer 3000仪器，使用激光衍射法确定和测量所述平均颗粒分布。所述标准是指在本专利申请的优先权日有效的版本。优选的是，所述固体颗粒的平均颗粒分布为：d10＝0,236微米，d50＝1,570微米，d90＝31,800微米。在本发明的一个实施方式中，所述固体颗粒具有按照图2的分布。所述固体颗粒分散在液体组合物的水相中，以获得作为纯对映体的d-松萝酸的水性液体分散体。
[0048]
d-松萝酸，或其盐或它们的混合物(i)有利地是天然和非合成的d-松萝酸，它优选是从地衣中提取。有不同的方法来对地衣进行分类；其中一种方法在于检查不同的生长形式，在此基础上，我们有：
[0049]-灌木状地衣。属于这一类的地衣种类有茶渍地衣(letharia vulpina)，或松萝属的地衣，又称胡须地衣和树花属。
[0050]-叶状地衣。这类地衣包括梅衣属、胶质地衣属(collema)、蜈蚣衣属(physcia)、大孢蜈蚣衣属(physconia)、石黄衣属(xanthoria)。
[0051]-壳状地衣。
[0052]-胶质地衣。
[0053]-鳞片状地衣。在这一类别中可以找到的一些地衣是：密鳞核衣(catapyrenium psoromoides)、枪石蕊(cladonia coniocraea)、粉石蕊(cladonia bimbriata)、瘦柄红石蕊(cladonia macilenta)、喇叭石蕊(cladonia pyxidata)、小皿叶(normandina pulchella)。
[0054]
地衣优选选自包括或由以下组成的组：松萝属(usnea)、石蕊属(cladonia)、双歧根属(hypotrachyna)、茶渍衣属(lecanora)、树花属(ramalina)、扁枝衣属(evernia)、梅衣属(parmelia)、树发属(alectoria)及其组合，更优选来自松萝属，甚至更优选来自长松萝，
通过本发明的提取工艺。
[0055]
附图1示意性地显示了根据可能的实施方式所示的所述方法实施方式的流程图，以获得天然来源的d-松萝酸。根据该方法的实施方式，在以下步骤后获得干燥形式的松萝酸：
[0056]
(a.1)将选自地衣的植物材料用有机溶剂浸泡和提取，该地衣优选选自包括或由以下组成的组：松萝属(usnea)、石蕊属(cladonia)、双歧根属(hypotrachyna)、茶渍衣属(lecanora)、树花属(ramalina)、扁枝衣属(evernia)、梅衣属(parmelia)、树发属(alectoria)及其组合，更优选松萝属，甚至更优选长松萝，所述有机溶剂优选选自包括或由以下组成的组的溶剂：苯、己烷、丙酮、氯仿、三氯乙烯或醇溶剂，甚至更优选乙醇，以获得提取液，并浓缩所述提取液以获得浓缩的提取液和残余溶剂；
[0057]
(a.2)将步骤(a.1)得到的浓缩提取液进行结晶和过滤，以获得结晶和过滤的提取产物；
[0058]
(a.3)将步骤(a.2)中获得的结晶和过滤的提取产物溶解、过滤和浓缩，以获得浓缩提取物和残留的溶剂；
[0059]
(a.4)将步骤(a.3)得到的浓缩提取物进行结晶、过滤，随后进行干燥和研磨，以获得松萝酸的干磨提取物，其滴度优选是80％至99.9％，更优选90％至99.5％，甚至更优选95％至98％。
[0060]
步骤(a.1)的浸泡和提取优选在提取罐中进行，该提取罐优选由不锈钢制成，配备有搅拌和加热装置。优选地，在步骤(a.1)的浸泡和提取中，使用10:1至1:50，优选5:1至1:40，甚至更优选1:1至1:35的[植物材料的重量]：[有机溶剂的体积]比例。步骤(a.1)的浸泡和提取优选在环境压力下进行，温度为10℃至80℃，优选20℃至70℃，甚至更优选25℃至60℃。
[0061]
步骤(a.1)的浓缩优选在浓缩器(或蒸发器)中进行，更优选的是单动式的，甚至更优选的是由不锈钢制成。
[0062]
在步骤(a.1)中，松萝(长松萝，longissima ach.)的叶状体(芽或接穗)与乙酸乙酯溶剂一起，例如，用量为350kg植物部分和2600升溶剂。浸泡优选在约25℃的温度和1个大气压下进行，时间为2小时到10小时，优选4小时到8小时，例如5小时到6小时。浸泡可以在配备有搅拌、加热和循环液体的装置的反应器中进行。基本上，浸泡通过在植物部分上连续循环蒸馏物(溶剂)来进行。作为单一步骤进行的提取在大约25℃的温度和1个大气压下进行。考虑到乙酸乙酯的沸腾温度约为77.1℃，含有从植物部分提取的松萝酸的所使用的提取溶剂的浓缩也可选择在提取压力下进行。得到稠密的浓缩液体和溶剂回收物(几乎完全回收)。
[0063]
在步骤(a.1)之后的步骤(a.2)的结晶和过滤中，为了获得结晶和过滤的提取产物，优选使用选自包括以下或由以下组成的组的有机溶剂：苯、己烷、丙酮、氯仿、三氯乙烯或醇溶剂，甚至更优选乙醇。在步骤(a.2)的结晶和过滤中，优选使用体积比为10:1至1:40，优选为5:1至1:30，甚至更优选为1:1至1:20的[浓缩提取液]：[有机溶剂]。在步骤(a.2)的结晶中，优选将从步骤(a.1)得到的浓缩提取液冷却以促进结晶，更优选在环境压力下1℃至20℃的温度下，甚至更优选在环境压力下5℃至15℃的温度下。在步骤(a.2)结束时，获得纯度至少为80％、85％至90％的晶体材料，如果从约350kg的植物部分开始，则量约为20kg。
[0064]
在步骤(a.3)中，在步骤(a.2)之后，将从步骤(a.2)中得到的结晶和过滤的提取产物溶解、过滤和浓缩，得到浓缩的提取液和残留的溶剂。在步骤(a.3)中，优选使用有机溶剂，更优选选自包括以下或由以下组成的组的溶剂：苯、己烷、丙酮、氯仿、三氯乙烯，或醇类溶剂，甚至更优选乙醇。在步骤(a.3)的溶解中，优选使用10:1至1:40，优选5:1至1:30，甚至更优选1:1至1:20的[结晶和过滤的提取产物重量]：[有机溶剂体积]比例。在步骤(a.3)中，它们溶解在2x20kg氯仿中，以获得20kg纯度至少为98％的松萝酸。
[0065]
在步骤(a.3)之后的步骤(a.4)中，将步骤(a.3)得到的浓缩提取物进行结晶、过滤，随后进行干燥和研磨，以得到松萝酸的干磨提取物。在步骤(a.4)的结晶中，优选使用有机溶剂，更优选选自包括以下或由以下组成的组的溶剂：苯、己烷、丙酮、氯仿、三氯乙烯组成的组，或醇类溶剂，甚至更优选乙醇。在步骤(a.4)的结晶中，优选使用为10:1至1:40，优选为5:1至1:30，甚至更优选为1:1至1:20比例的[浓缩提取物重量]：[有机溶剂体积]。在步骤(a.4)的结晶中，优选将从步骤(a.3)得到的浓缩提取物冷却以促进结晶，更优选在环境压力下1℃至20℃的温度下，甚至更优选在环境压力下5℃至15℃的温度下。优选进行步骤(a.4)的干燥，直至相对于松萝酸干提取物的总重量，残余溶剂含量为0.5％至10％(重量)，优选为1％至5％(重量)，甚至更优选为1.5％至3％(重量)。优选地，步骤(a.4)的研磨是通过磨机，更优选旋转球磨机进行的。当剩下残留溶剂含量相当于初始重量的2％-5％时，从步骤(a.4)得到的过滤和结晶的固体的干燥完成。在约为95℃-99℃的温度和空气循环下，使用板式干燥器(无压力真空)。经研磨的固体的平均颗粒分布在20目到40目，它含有98重量％的松萝酸(用sigma aldrich的hplc方法)。从工艺开始时的2x350kg植物部分(起始材料)开始，在工艺结束时可获得约3％-4％产率的材料(干固体)，这相当于约14kg-28kg的松萝酸，含量为98重量％(13.72kg-27.44kg)。获得的松萝酸为d( )99.9％的纯松萝酸形式，或为外消旋体。
[0066]
在获得作为外消旋混合物的松萝酸干磨提取物(步骤(a.4))后，使所述干磨提取物与环糊精，优选β-环糊精选择性地络合，以获得所述包合物(ci)。优选地，所述选择性络合是通过d-松萝酸或其盐或它们的混合物(i)和环糊精(ii)的共同沉淀获得。包合物(ci)优选通过d-松萝酸或其盐，或它们的混合物(i)和环糊精(ii)，优选β-环糊精的共同沉淀获得。更确切地说，环糊精(ii)最初溶解在水或其他合适的水性溶剂中，随后加入步骤(a.4)中的干磨松萝酸提取物，同时含有环糊精(ii)的水溶液则保持搅拌状态。在溶液中存在足够高浓度的环糊精(ii)时，随着环糊精(ii)对d-松萝酸或其盐或它们的混合物(i)的络合反应逐步进行，包合物(ci)将开始沉淀。优选地，含有包合物(ci)的溶液可能必须冷却到1℃至18℃的温度，优选在搅拌下，以引发沉淀。可以通过倾析、离心或过滤来收集包合物(ci)。包合物(ci)优选为水溶性笼形包合物(clathrate)或水悬浮性笼形包合物，其中作为纯对映体的所述d-松萝酸，或其盐，或它们的混合物(i)被容纳在所述凝集物的空腔中，一旦所述d-松萝酸，或其盐，或它们的混合物(i)与所述环糊精(ii)接触，d-松萝酸或其盐或它们的混合物(i)和环糊精(ii)，优选β-环糊精，在包合物(ci)中优选以3∶1至1∶3的重量比存在，优选以2∶1至1∶2的重量比存在，更优选以1.5∶1至1∶1.5存在，甚至更优选为1∶1。如果使用(2-羟基丙基)-β-环糊精，其与d-松萝酸的重量比为1:1。所述包合物(ci)优选用作针对革兰氏阴性和革兰氏阳性致病菌，优选革兰氏阴性细菌的抗菌剂或抑菌剂，所述包合物(ci)已证明对其特别有效。
[0067]
优选的是，包合物(ci)对其发挥抗菌或抑菌功能的革兰氏阴性细菌选自包括以下或由以下组成的组：大肠杆菌、克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌，以及它们的组合。优选的是，包合物(ci)对其发挥抗菌或抑菌功能的革兰氏阳性细菌选自包括以下或由以下组成的组：金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、肠球菌、耐万古霉素肠球菌(vre)、放线菌(actinobacter)、放线菌物种(actinobacter spp.)、艰难梭菌及其组合。优选地，在这种应用中，所述包合物(ci)在塑料膜或层、热塑性树脂或聚合物、聚乙烯(pe)、聚氯乙烯(pvc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)乳胶形式的产品的制备过程中添加；或者所述包合物(ci)以相对于产品重量为0.1％至20％的量涂抹或放置在所述产品的表面。
[0068]
此外，形成的本发明的一个目的是一种液体组合物，其包含以下或由以下组成：
[0069]
(a)所述包合物(ci)；
[0070]
(b)丙烯酸类树脂、聚氨酯树脂、丙烯酸-聚氨酯树脂，或其混合物；
[0071]
(c)任选地，一种颜料或遮光剂。
[0072]
(d)水。
[0073]
所述液体组合物对革兰氏阳性致病菌和革兰氏阴性致病菌，例如学名为克雷伯氏菌、肠杆菌、肠杆菌、假单胞菌和埃希氏菌的细菌具有抑菌或抗菌活性。所述液体组合物可以是水溶液或水分散液或水悬浮液或水乳剂的形式。
[0074]
在所述组合物中与(a)所述包合物(ci)一起使用的丙烯酸类树脂(b)优选包括选自包括以下或由以下组成的组的单体：丙烯酸、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、苯乙烯、乙烯基甲苯、乙酸乙烯酯、高于乙酸的羧酸的乙烯酯、丙烯腈、丙烯酰胺、丁二烯、乙烯、氯乙烯及其混合物。更优选的是，丙烯酸类树脂(b)包括以下或由以下组成：甲基丙烯酸-苯乙烯共聚物。
[0075]
与包合物(ci)和丙烯酸类树脂(b)一起存在于所述液体组合物中的可选的颜料或遮光剂(c)优选选自由以下组成的组：铁氧化物、钛氧化物、钴基染料、邻苯二甲酸酯(盐)、偶氮染料及其混合物。优选地，所述颜料或遮光剂包括以下或由以下组成：二氧化钛。
[0076]
与包合物(ci)、丙烯酸类树脂(b)和可选的颜料或遮光剂(c)一起存在于所述液体组合物中的水(d)，没有特别的限制。优选的是，水(d)是自来水、纯净水或去离子水。
[0077]
所述液体组合物优选包括。
[0078]
(a)包合物(ci)，其量相对于所述液体组合物的总重量为0.1％至15％(重量)，优选为0.2％至10％(重量)，甚至更优选为0.3％至7％(重量)；
[0079]
(b)所述丙烯酸类树脂、所述聚氨酯树脂或所述丙烯酸-聚氨酯树脂，其量相对于所述液体组合物的总重量为1％至80％(重量)，优选为2％至75％(重量)，甚至更优选为5％至70％(重量)；
[0080]
(c)可选的所述颜料或所述遮光剂，其量相对于所述液体组合物的总重量为10％至40％，优选15％至35％，甚至更优选20％至30％的重量；
[0081]
(d)水，其量相对于所述液体组合物的总重量为1％至40％，优选为2％至30％(重量)，甚至更优选为3％至22％。
[0082]
形成本发明的一个目的是所述液体组合物作为油漆或建筑涂料的应用，优选用作砌墙涂料或油漆或墙壁和地板的涂料或油漆的应用，例如用于油毡地板，更优选用作抗菌建筑涂料或作为对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抑菌剂的应用。
[0083]
最后，本发明的一个目的是环糊精，优选β-环糊精，优选(2-羟基丙基)-β-环糊精作为从天然来源的松萝酸的外消旋混合物(或外消旋物)选择性络合d-松萝酸或其盐，或它们的混合物(i)的选择性络合剂的应用。
[0084]
可以应用本发明的混合物或产品的表面的实例是水平或垂直表面，例如地板、墙壁或天花板，例如由混凝土、石灰或石膏板、油毡、或聚氯乙烯(pvc)、聚酰胺(pa)、聚乙烯(pe)、聚酯(pes)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(ptf)制成的表面。这种类型的表面，例如可见于但不限于医疗诊所、急诊室、医院、牙科诊所、运动场、幼儿园、学校或盥洗室和厕所设施，例如在公共或私人设施中，或例如在超市和商场或运动场中都可以找到。
[0085]
形成本发明的一个目的是一种混合物m，它包括以下或由以下组成：(a)天然来源的松萝酸和/或(b)其相关盐。
[0086]
包含在所述的混合物m中的所述(a)天然来源的松萝酸是右旋的天然松萝酸d( )和左旋的天然松萝酸l(-)之间的组合或联合c/a。
[0087]
在本发明的背景下，术语“组合”例如用于表示在使用前，右旋天然松萝酸d( )和左旋天然松萝酸l(-)一起，在彼此接触的状态下同时存在，而在本发明的上下文中，术语“联合”用于表示，例如，右旋天然松萝酸d( )和左旋天然松萝酸l(-)在使用前彼此分离，而在使用时它们可以彼此接触。物质之间的“组合”和“联合”的该含义也适用于例如松萝酸盐，以及本发明中使用的其他物质或化合物。
[0088]
术语“天然”或“天然来源”或“天然松萝酸或松萝酸盐或天然来源”用于表示所述松萝酸或松萝酸盐是从植物中获得的，特别是从松萝科、松萝属的植物中获得。
[0089]
优选地，在所述(a)天然来源的松萝酸中，右旋形式d( )的存在量占组合或联合c/a总重量的0.1％至99.9％，而左旋形式l(-)，在所述(a)天然来源的松萝酸中，其存在量占组合或联合c/a总重量的99.9％至0.1％。例如，松萝酸可以以50％( )和50％(-)的外消旋体形式存在，或者例如以100％的右旋形式d( )存在。
[0090]
所述(b)包含在所述混合物m中的松萝酸的盐是碱金属或碱土金属的盐。优选地，所述(b)松萝酸盐是松萝酸的右旋形式d( )的盐，其相对于组合或联合c/a的总重量的存在量按重量计可以是0.1％至99.9％，以及左旋形式l(-)，其相对于组合或联合c/a的总重量的存在量按重量计可以是99.9％至0.1％。例如，松萝酸盐，优选是松萝酸钠盐，可以以50％( )和50％(-)的外消旋体形式存在，或例如以右旋松萝酸钠盐d( )形式存在。
[0091]
所述(a)天然来源的松萝酸和所述(b)其相关盐在所述混合物m中以1:10至10:1，优选1:5至5:1，甚至更优选1:3至3:1；例如，3:1、2.5:1、2:1、1,5:1或1:1的重量比存在。
[0092]
所述混合物m可以是固体或半固体状态，分散或悬浮形式，膏剂或糊剂或凝胶形式，或液体状态；优选所述混合物m可以是片状、颗粒状、粉末状、丸状，或可以是水溶液或水醇溶液或在有机溶剂中。所述(a)天然来源的松萝酸和/或所述(b)其相关盐是固体形式的粉末，其平均粒径为1微米至100微米，优选5微米至50微米，甚至更优选10微米至20微米。
[0093]
例如，松萝酸可以表示如下：( )-松萝酸2,6-二乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b,d]呋喃-1,3(2h,9bh)-二酮；( )-松萝酸，来自松萝；cas：7562-61-0，ec：231-456-0。松萝酸的钠盐可以表示例如如下：2,6-二乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并呋喃-1,3(2h,9bh)-二酮单钠盐；cas:34769-44-3,ec:252-2046。所述(a)松萝酸和/或所述(b)松萝酸盐的纯度为95％至99.9％，优选96％至99.5％，甚至更优选97％至98％，例如
98％。
[0094]
形成本发明的一个目的是一种半成品ps，优选是以半固体膏剂或糊剂的形式，包括所述混合物m和树脂。
[0095]
所述混合物m包括以下或者由以下组成：所述(a)天然来源的松萝酸和/或所述(b)其相关盐，优选所述混合物m存在于所述半成品ps中，相对于所述半成品ps的总重量，其量为20％至80％，优选35％至65％，甚至更优选40％至50％，例如41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％或49％。
[0096]
在一个实施方式中，包含在半成品ps中的所述混合物m仅包括所述(a)松萝酸。在这种情况下，相对于所述半成品ps的总重量，所述(a)松萝酸在所述半成品ps中的存在量按重量计为20％至80％，优选35％至65％，甚至更优选40％至50％，例如41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％或49％。
[0097]
在另一个实施方式中，包含在半成品ps中的所述混合物m包括所述(a)松萝酸和所述(b)其相关盐，优选钠盐。在这种情况下，相对于所述半成品ps的总重量，所述松萝酸在所述半成品ps中的存在量按重量计为10％至60％，优选20％至50％，甚至更优选30％至40％，例如24％，或32％。而相对于所述半成品ps的总重量，所述松萝酸的(b)盐在所述半成品ps中的存在量按重量计为5％至50％，优选10％至40％，甚至更优选15％至30％，例如16％、18％、20％、22％、24％、26％或28％。
[0098]
与混合物m一起，所述树脂存在于所述半成品ps中，相对于所述半成品ps的总重量，其量按重量计为20％至70％，优选30％至60％，甚至更优选35％至50％，例如38％、40％、42％或45％。
[0099]
除了混合物m和树脂，半成品ps优选还包括：(i)水，相对于所述半成品ps的总重量，其量按重量计为5％至30％，优选是10％至20％，例如15％；(ii)添加剂、防腐剂和二醇，例如丙二醇或二乙二醇，相对于所述半成品ps的总重量，其量按重量计为0.5％至5％，优选是1％至1.5％，例如2％。
[0100]
除了所述混合物m和所述树脂外，半成品ps优选还含有防腐剂，例如，作为两种防腐剂，5-氯-2-甲基-2h-异噻唑-3-酮[ec号247-500-7]和2-甲基-2h-异噻唑-3-酮[ec号220-239-6]的重量比为3：1的混合物，索引号：613-167-00-5和cas：55965-849。
[0101]
表1中报告了本发明的半成品ps的优选实施方式。
[0102]
表1
[0103] ps1ps2ps3ps4ps5ps6ps7天然来源的外消旋物，或d( )松萝酸40％48％32％30％24％24％48％天然来源外消旋物，或d( )的松萝酸盐0016％18％24％24％0树脂48％40％40％36％42％52％52％水10％10％9％12％8％00添加剂 二醇2％2％3％4％2％00
[0104]
这些树脂选自包括以下或由以下组成的组：本领域技术人员已知的聚氨酯、氨基甲酸酯、聚丙烯酸类、丙烯酸类、聚乙烯类、乙烯类、聚酰胺或酰胺。
[0105]
形成本发明的一个目的是成品pf，其包括所述半成品ps，和油漆产品。
[0106]
相对于油漆产品的重量，包含在所述成品pf中的所述半成品ps的存在量按重量计
为0.1％至10％；优选为0.5％至8％；甚至更优选为1％至6％，例如1％、2％、3％、4％或5％。
[0107]
在实施方式中，所述油漆产品可与所述半成品ps一起存在于所述成品pf中，优选是以液体、分散体或水分散体的形式存在。
[0108]
在实施方式中，所述油漆产品可优选选自包括以下或由以下组成的组：清漆、瓷漆或油漆或水溶性油漆；优选所述清漆、瓷漆或油漆，用于室外或室内表面，优选选自水基或有机溶剂基的那些。例如，水溶性油漆可用于室外或室内表面。
[0109]
在实施方式中，所述水基油漆产品可优选选自相容性的单组分或双组分产品，用于喷涂、刷涂或辊涂式施加于砖石墙、油毡或木材制成的室内或室外表面。
[0110]
在另一个实施方式中，所述有机溶剂基油漆产品可以优选选自丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或氨基甲酸酯和/或聚氨酯基双组分的产品，用于室内或室外表面，例如由玻璃、铝、钢、塑料、聚合物、油毡、织物、天然皮革、合成皮革、木材、天然织物、人造织物或合成织物制成的表面，用于喷涂或辊涂或刷涂式应用。
[0111]
本发明的成品pf可以看作是具有聚合物基质和溶质(右旋松萝酸和/或其盐，如钠盐)的流体溶液。鉴于上述情况，油漆产品可包括水基和溶剂基油漆、清漆和瓷漆。清漆用于产生例如透明的膜。此外，考虑到油漆、清漆和瓷漆有许多应用，下面报告了专业应用清漆、油漆和瓷漆领域最常见和广泛使用的原材料，例如溶剂、聚合物基质(树脂)、添加剂和颜料/填料。溶液可以作为清漆的实例提及，例如透明的，而当不溶解的组分被分散时，这是分散体的情况。
[0112]
最常用于制备清漆(透明)、瓷漆(彩色)和油漆(建筑产品)的溶剂列表：水、丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、甲苯、二甲苯、石脑油溶剂、矿物油精、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、丁二醇、二丁二醇、乙二醇醚、乙酸甲氧基丙酯。
[0113]
最常见的聚合物基质列表：通常在溶剂溶液中或水乳液中出现的树脂。聚合物基质溶解在溶剂中，在水中的乳液/分散体中不溶解。例如，合成油或植物油、植物脂肪酸、蓖麻、饱和或不饱和脂肪酸。
[0114]
虽然到目前为止，我们已经看到了构成清漆(在制成品上沉积或多或少的光泽透明膜)的成分类别，但在特定情况下，必须添加颜料和填料以及染料，因为它们与油漆(树脂聚合物粉末)和瓷漆(富含树脂)有关。然后是功能成分。填料使涂料和背景具有特征，颜料使瓷漆具有特征。例如，填料可包括：碳酸钙、云母、滑石、硫酸钡、石英；功能性颜料，例如：磷酸锌、氧化铁；防腐颜料：铝膏状；颜料：二氧化钛、氧化铁、有机颜料黄、橙、红、绿、蓝、品紫；效果颜料(光学干扰)。
[0115]
在实施方式中，例如施涂于天然或合成皮革或皮的pf成品可以被添加到具有以下组成的基料(油漆产品)中：(i)水，按重量计其量为75％至85％，优选为78％至80％；(ii)sio2，按重量计其量为1％至8％，优选为2％至5％；(iii)二丙二醇甲醚，按重量计其量为0.5％至5％，优选为1％至2％；(iv)硅氧烷和硅酮，按重量计其量为2％至5％，优选为2.5％至3.5％；以及(v)聚合物，按重量计其量为10％至20％，优选为16％至18％。在这种情况下，还可以使用交联剂进行交联，以获得具有诸如抗磨损试验(如taber试验)、抗酒精和汽油摩擦等特性的膜。至于织物，例如由聚丙烯或聚酯制成的无纺布(nwf)，可以使用含有以下的溶液(成品)：100重量份的去离子水，0.6重量份的外消旋松罗酸，或糊精形式的d( )和0.9重量份的β-环糊精。
[0116]
在另一个实施方式中，施涂于例如由混凝土或石膏板、油毡或木材制成的墙壁或天花板和表面(水平和垂直)的成品pf可以被添加到例如具有以下组成的基料(油漆产品
‑‑
不透明的单组分和双组分水漆背景)中：(i)树脂(作为油漆产品的一部分)，按重量计其量为60％至80％，优选为70％，例如72％；(ii)惰性添加剂，按重量计其量为2％至10％，优选为3.5％至8％，例如6.5％；(iii)水，按重量计其量为10％至30％，优选为15％至25％，例如17％；(iv)二(丙二醇)甲基醚，按重量计其量为0.5％至5％，优选为1％至3％，例如2％；(v)二乙二醇，按重量计其量为1％至4％，优选为1.5％至3％，例如2.5％。这种基料可施涂于例如木质或镶木地板的表面，也可用于室外表面。这种基料具有优异的表面硬度、耐磨性、耐化学性和抗紫外线性。为了进一步提高其耐化学性，例如，可以添加相对于成品pf的总重量其量按重量计为3％至15％，优选是10％的催化剂，所述催化剂例如包括相对于催化剂的总重量按重量计其量70％至9量％，优选是80％的聚异氰酸酯树脂和10％至30％，优选是20％的碳酸丙烯酯。这种成品pf可以使用喷涂、辊涂或刷涂技术进行施涂。
[0117]
在另一个实施方式中，例如施涂于玻璃、铝或钢上的成品pf可添加到例如具有以下组成的基料(油漆产品
‑‑
丙烯酸双组分透明光泽涂料)中：(i)丙烯酸类树脂，按重量计其量为60％至85％，优选为70％至80％，例如75％；(ii)二甲苯，按重量计其量为10％至30％，优选为15％至25％，例如20％；(iii)添加剂，按重量计其量为0.5％至4％，优选为1％至3％，例如2％。这种基料能够提供高度耐久和耐光的抗性涂层，因此适用于户外和室内应用。为了进一步提高成品pf的耐化学性，当它被施涂于玻璃上时，相对于成品pf的总重量，例如可以加入按重量计其量1％至10％，优选为3％至5％的催化剂，所述催化剂包含量以重量计为30％至50％，优选35％至45％，例如40％的脂肪族多异氰酸酯树脂；量以重量计为20％至40％，优选25％至35％，例如30％的二甲苯；量以重量计为20％至40％，优选25％至35％，例如30％的甲乙酮(相对于配方的总重量)。该成品p可使用喷涂技术进行施涂。
[0118]
下面报告本发明的优选实施方式fpn。
[0119]
fp1.一种包合物(ci)，其包含以下或由以下组成：(i)天然来源的作为对映异构体的d-松萝酸，或其盐，或它们的混合物，和(ii)β-环糊精。
[0120]
fp2.如fp1所述的包合物(ci)，其中，所述d-松萝酸或其盐或它们的混合物(i)和β-环糊精(ii)，优选(2-羟丙基)-β-环糊精以以下重量比存在于所述包合物(ci)中：3:1至1:3，优选2:1至1:2，更优选1.5:1至1:1.5，甚至更优选为1:1。
[0121]
fp3.如fp1或fp2所述的包合物(ci)，其中，所述d-松萝酸或其盐或它们的混合物(i)提取自地衣，优选地选自包括以下或由以下组成的组：松萝属(usnea)、石蕊属(cladonia)、双歧根属(hypotrachyna)、茶渍衣属(lecanora)、树花属(ramalina)、扁枝衣属(evernia)、梅衣属(parmelia)、树发属(alectoria)及其组合，更优选来自松萝属，甚至更优选来自长松萝，并且其中所述环糊精(ii)包括以下或由以下组成：环糊精，优选为(2-羟丙基)-β-环糊精，比例为1:1。
[0122]
fp4.根据fp1-fp3中任一项所述的包合物(ci，其中所述包合物(ci包含作为纯对映异构体的d-松萝酸或其盐或它们的混合物的固体颗粒(i)，其中所述固体颗粒的平均颗粒分布为0.01μm至50μm，优选0.1μm至30μm，更优选0.15μm至20μm，甚至更优选0.2μm至15μm。
[0123]
fp5.根据fp1-fp4中任一项所述的包合物(ci)作为革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性
细菌的抗细菌剂或抑细菌剂的应用；其中所述细菌优选选自包含以下或由以下组成的组：大肠杆菌、克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、肠球菌属(enterococcus)、肠球菌属物种(enterococcus spp.)、耐万古霉素肠球菌属(vre)、放线菌(actinobacter)、放线菌物种、艰难梭菌及其组合。
[0124]
fp6.根据权利要求fp5所述的应用，其中，在制备由塑料制成的膜或层、树脂或热塑性聚合物、聚乙烯(pe)、聚氯乙烯(pvc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、乳胶形式的制品的制备过程中加入所述包合物(ci)；或所述包合物(ci)以相对于制品重量为0.1％至20％的量铺设或放置在所述产品表面上。
[0125]
fp7.一种液体组合物，其包含以下或由以下组成：
[0126]
(a)fp1-fp4中任一项所述的包合物(ci)；
[0127]
(b)丙烯酸类树脂、聚氨酯树脂、丙烯酸-聚氨酯树脂或它们的混合物；
[0128]
(c)任选地，颜料或遮光剂；
[0129]
(d)水。
[0130]
fp8.根据fp7所述的液体组合物，其包含以下或由以下组成：
[0131]
(a)包合物(ci)，相对于所述液体组合物的总重量，其量为0.1重量％至15重量％，优选为0.2重量％至10重量％，甚至更优选为0.3重量％至7重量％，；
[0132]
(b)所述丙烯酸类树脂、所述聚氨酯树脂、所述丙烯酸-聚氨酯树脂或它们的混合物，相对于所述液体组合物的总重量，其量为1重量％至80重量％，优选为2重量％至75重量％，甚至更优选为5重量％至70重量％；
[0133]
(c)任选地，所述颜料或所述遮光剂，相对于所述液体组合物的总重量，其量为10重量％至40重量％，优选15重量％至35重量％，甚至更优选20重量％至30重量％；
[0134]
(d)水，相对于所述液体组合物的总重量，其量为1重量％至40重量％，优选2重量％至30重量％，甚至更优选3重量％至22重量％。
[0135]
fp9.根据fp7-fp8中任一项所述的液体组合物作为油漆或建筑涂料的应用，优选作为砌体墙涂料或油漆，或用于墙壁和地板，例如用于油毡地板，更优选作为针对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抗细菌或抑菌性建筑涂料。
[0136]
fp10.β-环糊精，优选(2-羟丙基)-β-环糊精，作为来自天然来源的松萝酸的外消旋混合物(或外消旋物)的纯对映异构体的d-松萝酸或其盐或它们的混合物(i)的选择性络合剂的应用。
[0137]
下面报告的是以非限制性的方式提供的本发明的一些实施例。考虑到iso 22196，来测量混合物m、半成品ps和成品pf的抗菌活性，混合物m、半成品ps和成品pf都根据表1，施涂在塑料表面。
[0138]
有利的是，所述混合物m、所述半成品ps和所述成品pf符合以下标准的要求：
[0139]
uni en iso 7784:2016(耐磨性)和uni en iso 18593:2018。
[0140]
有利的是，所述混合物m、所述半成品ps和所述成品pf不需要光激活剂或外部能量，例如紫外光或任何波长的光，因为它们一旦施涂在表面上就能独立固定。
[0141]
实验部分a
实施例：
[0142]
实施例1：测试本发明的水性液体组合物对革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌(mrsa)的有效性。
[0143]
根据iso 22196:2007的测试方法，测试了该水水性液体组合物对革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌的功效。该水性液体组合物包括作为天然来源的纯对映体的d-松萝酸包合物和(2-羟基丙基)-β-环糊精。
[0144]
测试的材料类型是6个未处理的样品(分为两组)和6个用根据本发明的组合物处理的样品(分为两组)，划分如下。
[0145]-参比(时间0h)：ctrl1、ctrl2、ctrl3；
[0146]-参比(时间24小时)：ctrl4、ctrl5、ctrl6；
[0147]-用根据本发明的组合物处理的样品：ssc7、ssc8、ssc9；
[0148]-经过老化方法的用根据本发明的组合物处理的样品：ssc10、ssc11,ssc12。
[0149]
被分析的样品包括50x50毫米的正方形塑料支撑体，其涂布有待测材料，通过喷漆的方式处理。使用40x40毫米、厚度为0.1毫米的正方形聚乙烯涂膜。测试的细菌菌株是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)atcc 43300(106细胞/ml)，细菌接种量为0.4ml。对国际标准方案所做的改变是中和剂(scdlp)的体积＝20ml。
[0150]
该测试应被视为有效，因为它符合iso 22196:2007：标准中规定的以下条件：
[0151]
1)(log
最大
–
log
最小
)/log
平均
≤0.2
[0152]
2)接种未经处理的试验品(参比)后，其即刻平均活菌数在6.2x103细胞/cm2–
2.5x104细胞/cm2的范围内。
[0153]
3)接种24小时后，每个对照样品中的活菌数不低于6.2x101细胞/cm2。
[0154]
细菌活性r是根据以下公式计算的。
[0155]
r＝(u
t-u0)-(a
t-u0)＝u
t-a
t
[0156][0157]
细菌活性r如附图3所示。
[0158]
实施例2：根据实施例1的水性液体组合物对革兰氏阴性病原体大肠杆菌的功效测试。
[0159]
遵循与实施例1相同的程序，但在这种情况下，测试的细菌菌株是革兰氏阴性病原体菌株大肠杆菌atcc 8739(6x105细胞/ml)。
[0160]
细菌活性r是根据以下公式计算的。
[0161]
r＝(u
t-u0)-(a
t-u0)＝u
t-a
t
[0162][0163]
细菌活性r如附图4所示。
[0164]
前面的实施例1和实施例2显示，经过只24小时的接触，细菌活性下降约100％(r％》99,99％)，根据指南，该结果以抗菌材料的对数功效指数计算。
[0165]
这种减少在两种测试的微生物上无差别地出现(r
大肠杆菌
log＝4.96；r
金黄色葡萄球菌
log＝4.30)，其数值非常相似，有利地显示了对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌均有效的抗菌能力。
[0166]
从这一考虑可以看出，本发明的组合物主题可用于许多目的，包括日常生活环境和部门环境：商业、家庭、临床-医院。
[0167]
实施例3：根据实施例1的水性液体组合物在细菌污染水平的非特异性方面的功效测试。
[0168]
从适合标示取样点的细菌污染水平的非特异性方面的表面测试中获得的实验室结果总结如下。
[0169]
在医院设施中进行的第一轮试验中，确定了用作牙科诊所的房间，该房间的表面上先前已经应用本发明的主题
‑‑
实施例1的水性液体组合物，使所述表面能够抵抗细菌污染。
[0170]
在幼儿园进行的第二轮试验中，将本发明的主题
‑‑
实施例1的水性液体组合物施涂在房间(公共区域和休息室)地板的可踩踏表面上，使所述表面能够抵抗细菌污染。
[0171]
考虑到利用接触板的uni en iso 18593:2018“表面取样的水平方法”标准，以便对上述获得的结果具有可追溯性。具体来说，使用了“接触板2liofilchem”。在墙壁和表面上也进行了测试，以确定代表自然背景(起始情况)的细菌污染水平，然后将本发明的主题
‑‑
实施例1的水性液体组合物施涂于墙壁和可踩踏表面。
[0172]
这些活动是在牙科诊所的房间(医院设施)或用于照顾儿童的房间(幼儿园)的正常使用条件下进行的。因此，本研究是在细菌群真实存在的情况下进行的，在某些情况下，甚至可能是在诊所使用者在场的情况下进行的。这些情况证实了经过处理的表面有抵御再污染的趋势，因为它们显示为点状污染，而不是分布在所有的表面。
[0173]
除了个人防护装置(防护服、手套和口罩)，用于细菌负荷测试的材料是liofilchem接触板，事物代码为525272，根据指定的标准进行具体使用。该产品用于专业应用，规定直接使用与房间的墙壁或可踩踏的表面接触的板的表面，随后在30℃的恒温箱中温育24小时，并读取以菌落形成单位(cfu)/cm2表示的结果。
[0174]
对于在医院设施中进行的测试，认定的协议规定，在诊室的四面墙中每一个上确定四个独立的点，按照逆时针方向，从一到四，按照采样表面尽可能有代表性的分布逻辑来确定这些点。因此，应该认为每个样品就表面积而言代表10cm2。因此，每个采样环节分析的表面区域包括16个样品，每面墙4个，总共160cm2。样品在四个墙上位置上从1到4编号，因此从房间入口处右边的墙开始，到有小窗户的扶手椅前的墙，有窗户的墙，最后是入口处左边的墙，如附图5的照片所示。
[0175]
在医院设施中进行采样时，遵循了要检测的点的分布逻辑，以便在四次采样过程中覆盖最大的表面区域。
[0176]
下面的表2总结了每个采样日在医院设施中单独采样的结果。
[0177]
表2
[0178][0179]
对于幼儿园的测试，认定的协议规定按照采样表面尽可能有代表性的分布逻辑，在所用房间的可踩踏表面上确定一系列的点。因此，应认为每个样品就表面积而言代表10cm2。
[0180]
以下表3(公共区域)和表4(休息室)总结了幼儿园中存在的两个区域的测试样品。
[0181]
表3
[0182][0183]
表4
[0184][0185]
总之，在取样过程中收集的数据显示，考虑到初始值的表面对再污染的整体抵抗力，也可以是考虑到初始值的仍然是点状和孤立的菌落，用本发明的组合物主题处理的表面的微生物负荷下降。
[0186]-在医院设施进行的测试中，下降达到了90％，从图6所示的图表中可以看出，从略低于3000cfu/cm2到接近300cfu/cm2。另一个需要注意的重要数据是获得的结果的数值常数(468,75cfu/cm2,468,75cfu/cm2,405,0cfu/cm2,312,5cfu/cm2)，随着时间的推移，微生物的数量呈下降的趋势。
[0187]-在幼儿园进行的测试中，细菌负荷残余在8％到12％之间，从前面的表3和表4可以观察到。
[0188]
实施例4：根据实施例1的水性液体组合物在细菌污染水平的非特异性方面的进一步功效测试。
[0189]
测试是根据iso 18593标准进行的，显示出良好的可重复性。
[0190]
采样条件如下：
[0191]
参比收集：在消毒后停用的住院/诊所房间；
[0192]
处理后收集：在使用中的住院/诊所房间。
[0193]
这样的条件代表了验证用本发明主题的组合物进行处理的功效的最坏情况。
[0194]
在获得一系列优异的体外试验结果(iso 22196和astm 2180)后，该处理方法被建议作为预防和控制鼻腔表面细菌负荷的候选方法。
[0195]
在上述处理前后，通过“iso 18593接触板”收集细菌负荷样品以进行体内验证，从而监测以cfu/m2(每平方米菌落形成单位)表示的通用负荷趋势。
[0196]
其他样品的采集间隔约25天，以监测功效随时间的发展。
[0197]
通过加速老化的实验室测试表明，随着时间的推移，功效具有良好的稳定性(功效保证3年)。
[0198]
采集的样品数量确保了所获得的统计数据非常好(每个步骤每个房间可进行多达32次测试)。
[0199]
这个验证考虑了5个不同的医院环境，其可分为诊所和住院室。
[0200]
所述测试是在符合医院环境微生物监测的最新指南的情况下进行的。
[0201]
附图7、8、9、10显示了，按房间和采样日期划分的结果，以及它们随时间的趋势。此外，下面的表5逐图报告了细菌负荷减少/降低的百分比。
[0202]
表5
[0203] 18天后细菌负荷减少(％)36天后细菌负荷减少(％)图75087,5图86590图984*75图1095n.d.
[0204]
*采样数据(125cfu/m2)是在诊所的不寻常的、活动高峰的时刻进行的。
[0205]
有利的是，由于其中所含的包合物(ci)，用本发明主题实施例1的水性液体组合物处理过的表面被持续消毒。
[0206]
有利的是，根据iso 22196:2007(e)(在本专利申请的优先权日有效的版本)，进行加速老化后通过测试确定，这种消毒效果(病原体负荷的减少)在施涂后至少保持3年。
[0207]
有利的是，本发明的水性液体组合物(例如实施例1的组合物)主题在医院环境中特别有用，因为所述组合物似乎适合于(而且不仅仅是)限制革兰氏阳性致病菌和革兰氏阴性细菌的鼻腔细菌负荷。这一意想不到的结果使病人能够在一个尽可能无菌的环境中生活。
[0208]
实验部分b
[0209]
实施例
[0210]
实施例1
[0211]
1.1目的
[0212]
验证用本发明的抗菌剂主题处理的器材的杀微生物功效，该抗菌剂主题基于天然来源的松萝酸和/或其相关盐，优选钠盐，以外消旋体或右旋体形式d( )。根据描述的程序标准参考文献astm e2180-07，使用被认为是指示性的微生物菌株进行试验。
[0213]
2.1测试方法的原理
[0214]
astm e2180-07标准描述了定量评估纳入聚合物或疏水性表面或其上的试剂的抗微生物功效的测试方法。该方法需要用标准化的微生物细胞培养物接种融化的半固体的琼脂(琼脂浆)。接种的琼脂浆的薄层被转移到要测试的表面上和作为对照的其他表面上。在一个或多个指定的接触时间后，使用确保从测试表面完全去除接种物的方法，通过将琼脂浆接种物从测试基质中洗脱到中和剂中，来回收存活的微生物。然后制备连续的稀释液，每一个用于接种包含在合适的培养基中。在为所使用的测试微生物规定的条件下温育平板后，计数并记录每个稀释液中存活的微生物菌落数量。然后通过比较用抗菌剂处理过的表面样品上的存活的微生物和作为参比的未处理过的表面上的微生物，来计算微生物的减少百分比。
[0215]
3.1.参考法规
[0216]
本报告中描述的测试是指以下规定的法规。astm e2180-07“确定聚合物或疏水性材料中引入的抗微生物剂活性的标准测试方法”。
[0217]
3.2.内部参比
[0218]
下面进行和描述的测试是指提交给iso 9001和iso 13485认证的质量管理系统的以下操作程序和说明。
[0219]-p08“分析和验证测试”，01/10/2013第05版。
[0220]-p09“基础设施管理”，01/10/2013第03版。
[0221]-p10“设备管理”，01/10/2013第03版。
[0222]-i01“菌株管理”，10/05/2011第1版。
[0223]-i02“生长培养基和试剂的管理”，02/03/2015第03版。
[0224]
4.被检样品的确认
[0225]
被检查的产品由用基于外消旋或右旋形式d( )的天然来源的松萝酸和/或其相关盐，优选钠盐的混合物m处理的器材组成，以获得抗菌性能；不含抗微生物剂的相同材料的器材被用作参比。用于试验的经过或未经过抗微生物剂处理的器材样品如下图所示按照内部程序制造。要测试的样品呈长方形，尺寸大约等于2x8cm。
[0226]
表6
[0227][0228]
5.设备和试剂
[0229]
使用以下实验室试剂、材料和设备进行试验：
[0230]
用于制备微生物悬浮液的稀释剂：具有nacl 9g/l的盐水溶液，cod.sa279/2015exp.10/03/2016；
[0231]
细菌的生长培养基：胰蛋白胨大豆琼脂(tsa)cod.sa289/2015exp.22/03/2016；
[0232]
琼脂浆：含有琼脂3g/l和nacl 8,5g/l的半胶状制剂，cod.sa292/2015exp.24/12/2015；
[0233]
回收肉汤/中和剂：胰蛋白胨大豆肉汤中的溶液，含有吐温80 30ml/l、皂苷30g/l、l-组氨酸1g/l、鸡蛋卵磷脂3g/l、硫代硫酸钠5g/l cod.sa230/2015exp.14/01/2016；
[0234]-恒温浴mpm仪器cod.sa65控制在(45
±
1)℃；
[0235]-恒温浴chimica omnia cod.sa15控制在(45
±
1)℃；
[0236]-涡流混合器velp scientifica cod.sa52；
[0237]-恒温器pid system cod.sa66控制在(36
±
1)℃；
[0238]-冰箱恒温器velp scientifica cod.sa82控制在(31
±
1)℃；
[0239]-分光光度计genesys 10cod.sa26；
[0240]-各种无菌材料(例如剪刀、镊子等)。
[0241]
使用的培养基和试剂应根据制造商的说明书和/或参考方法制备，如内部操作说明书中所述。检查测试中使用的培养基的可繁殖性和无菌性。设备按内部程序进行管理；在测试时，设备处于有效校准状态。
[0242]
工作环境准备、物料管理和处理操作应按照相关内部程序中规定的规范进行。
[0243]
6.方法的描述
[0244]
6.1.实验条件
[0245]
抗微生物功效测试是在以下实验条件下进行的。
[0246]-微生物菌株：大肠杆菌atcc 10536(革兰氏阴性细菌)。
[0247]
试验菌株采用的温育条件详见下表。
[0248]
表7微生物菌株开发条件
[0249]
测试菌株培养基温度(℃)时间(h)大肠杆菌tsa(36
±
1)℃48小时
[0250]
接触时间：与客户商定的接触时间在下表中规定。
[0251]
表8接触时间
[0252]
接触时间24小时(1天)和72小时(3天)。
[0253]
参考：未用混合物m(不含松萝酸)处理的器材。
[0254]
6.2.测试的描述
[0255]
将微生物菌株移植到合适的培养基斜面上24小时，然后在盐水溶液中稀释，直至达到通过分光光度计读数估计的浓度，为1-5x108cfu/ml。悬浮液中微生物细胞的数量是用盐水溶液的10倍数稀释来确定的，直到为10-6。从该稀释液中取两份1ml的等分试样，并接种到培养基中。温育并计数平板上出现的菌落后，确定悬浮液中每ml的菌落形成单位(cfu/ml)的数量。
[0256]
将1,0ml的微生物悬浮液接种到100ml的琼脂浆中，在45℃的温度下保持熔融状态，以获得每个琼脂浆中细胞的最终浓度，为1-5x106cfu/ml。通过将5片插入合适的确认板中持续上述定义的接触时间，而制备测试和参考器材。将1,0ml接种的琼脂浆转移到为测试悬浮液准备的每个测试和对照样品中。进行接种时的角度和速度要避免悬浮液分散在样品外。在使琼脂浆接种物凝胶化后，将样品放在温育器中，在适合微生物菌株发育的温度下进行规定的接触时间。在恒温器中使用含水托盘，将湿度保持高于75％，以防止琼脂浆接种物干燥。在每个规定的接触时间，从培养皿中取出经处理的非参考器材的样品，并将其转移到含有中和肉汤的烧瓶中，其体积使得形成初始接种物1：10的稀释液。将烧瓶进行超声处理1分钟，随后用涡旋进行机械混合，以确保琼脂浆从样品中完全释放。然后将中和肉汤进行1:10的连续稀释，每一次通过纳入适当的培养基中进行接种。为了确定从处理过的表面释放的功效，将样品通过包含在熔融培养基中进行接种。温育后，对每个所制备的稀释液形成的菌落数量进行计数和记录，计算出每个接触时间的存活微生物数量(cfu/ml)。
[0257]
6.3.结果的计算和表达
[0258]
结果表示为经处理的器材样品相对于如参考标准所规定的未处理的器材样品的微生物污染减少的百分比。对经抗微生物剂处理的器材和未经处理的器材计算在五次重复中回收的微生物的数量的几何平均值；因此计算对照样品的几何平均值的反对数和经处理的样品的几何平均值的反对数之间的百分比差异。
[0259]
几何平均值＝(logr1 logr2 logr3 logr4 logr5)/5
[0260]
其中：
[0261]
r1/2/3/4/5＝接触被测物或对照物并温育后回收的微生物总数(重复实验1/2/3/4/5)。
[0262]
减少的百分比＝(a-b)x100/a
[0263]
其中：
[0264]
a＝未经处理的参考器材的几何平均值的反对数
[0265]
b＝经处理的器材的几何平均值的反对数
[0266]
6.4.测试的有效性标准
[0267]
当初始微生物的回收率等于或大于104cfu/ml时，该试验被认为是有效的。为了宣布器材在测试条件下有效，astm 2180参考标准要求相对于未处理的参比而言，评估的微生物污染下降百分比等于或大于99％。
[0268]
7.结果
[0269]
获得的结果总结在下表中。
[0270]
表9：菌株计数(cfu/ml)
[0271][0272]
表10：不同接触时间下存活的微生物的平均对数表示
[0273][0274]
表11：不同接触时间的下降百分比
[0275][0276]
表12：不同接触时间的对数下降
[0277][0278]
8.结论
[0279]
根据所获得的结果，按照测试的有效性标准，根据astm e-2180-07标准的要求(下降幅度大于99％)，可以得出结论：
[0280]
在72小时的接触时间内，确定为“样品1”的用基于松萝酸的混合物m处理的器材(合成来源的松萝酸，非本发明所述)对测试菌株(大肠杆菌)有效；
[0281]
在24小时的接触时间内，确定为“样品2”的用基于松萝酸的混合物处理的器材(根据本发明的天然松萝酸)对测试菌株(大肠杆菌)有效。
[0282]
实施例2
[0283]
2.1目的
[0284]
验证用混合物m处理的器材的杀微生物功效，该混合物m基于外消旋体或右旋体形式d( )的天然来源的松萝酸和/或其相关盐，优选钠盐，。根据描述的程序标准参考文献
astm e2180-07，使用被认为是指示性的微生物菌株进行试验。
[0285]
2.2测试方法的原理
[0286]
astm e2180-07标准描述了定量评估纳入聚合物或疏水性表面或其上的试剂的抗微生物功效的测试方法。该方法需要用标准化的微生物细胞培养物接种融化的半固体的琼脂(琼脂浆)。接种的琼脂浆的薄层被转移到要测试的表面和作为对照的其他表面上。在一个或多个指定的接触时间后，通过将琼脂浆接种物从测试基质中洗脱到中和试剂中，并使用确保从测试表面完全去除接种物的方法，来回收存活的微生物。然后制备连续的稀释液，每一个接种包含在合适的生长培养基中。在为所使用的测试微生物规定的条件下温育平板后，计数并记录每个稀释液中存活的微生物菌落数量。然后通过比较用抗微生物剂处理过的表面样品上的存活的微生物和作为参比的未处理过的表面回收的那些微生物，来计算微生物的减少百分比。
[0287]
3.1.参考法规
[0288]
本报告中描述的法规是指以下规定的法规。
[0289]-astm e2180-07“确定聚合物或疏水性材料中加入的抗菌剂活性的标准测试方法”。
[0290]
3.2.内部参比
[0291]
本报告中进行和描述的测试是指提交给iso 9001和iso 13485认证的质量管理系统的以下操作程序和说明。
[0292]-p08“分析和验证测试”，01/10/2013第05版。
[0293]-p09“基础设施管理”，01/10/2013第03版。
[0294]-p10“设备管理”，01/10/2013第03版。
[0295]-i01“菌株管理”，10/05/2011第1版。
[0296]-i02“生长培养基和试剂的管理”，02/03/2015第03版。
[0297]
4.被检样品的确认
[0298]
被检查的产品由用基于松萝酸的混合物m处理的器材组成，以获得抗微生物性质；不含抗微生物剂的相同材料的器材被用作参比。用于试验的经过或未经过抗微生物剂处理的器械样品如下图所示按照内部程序制造。
[0299]
要测试的样品呈长方形，尺寸大约等于2x8cm。
[0300]
表13
[0301]
确认代码用松萝酸处理的器材测试参比器材-空白测试
[0302]
5.设备和试剂
[0303]
使用以下实验室试剂、材料和设备进行试验：
[0304]
用于制备微生物悬浮液的稀释剂：具有nacl 9g/l的盐水溶液，cod.sa 226/2015exp.10/01/2016；
[0305]
细菌的生长培养基：胰蛋白胨大豆琼脂(tsa)cod.sa 225/2015exp.10/01/2016；
[0306]
酵母菌的生长培养基：沙氏琼脂(sab)cod.sa 219/2015exp.10/01/2016；
[0307]
琼脂浆：含有琼脂3g/l和nacl 8,5g/l的半胶状制剂，cod.sa 229/2015exp.14/
10/2015；
[0308]
回收肉汤/中和剂：胰蛋白胨大豆肉汤中的溶液，含有吐温80 30ml/l、皂苷30g/l、l-组氨酸1g/l、鸡蛋卵磷脂3g/l、硫代硫酸钠5g/l cod.sa 230/2015exp.14/01/2016；
[0309]-恒温浴mpm仪器cod.sa 65控制在(45
±
1)℃；
[0310]-恒温浴chimica omnia cod.sa 15控制在(45
±
1)℃；
[0311]-涡流混合器velp scientifica cod.sa 52；
[0312]-恒温器pid system cod.sa 66控制在(36
±
1)℃；
[0313]-冰箱恒温器velp scientifica cod.sa 82控制在(31
±
1)℃；
[0314]-分光光度计genesys 10cod.sa 26；
[0315]-各种无菌材料(例如剪刀、镊子等)。
[0316]
使用的培养基和试剂应根据制造商的说明书和/或参考方法制备，如环境研究内部操作说明书中所述。检查测试中使用的培养基的可繁殖力和无菌性。
[0317]
6.方法的描述
[0318]
6.1.实验条件
[0319]
抗微生物功效测试是在以下实验条件下进行的。
[0320]
微生物菌株：金黄色葡萄球菌mrsa atcc 43300(革兰氏阳性细菌)，大肠杆菌atcc 10536(革兰氏阴性细菌)，白色念珠菌atcc 10231(酵母菌)。
[0321]
测试菌株采用的温育条件详见下表。
[0322]
表14
[0323][0324]
接触时间：下表中规定的接触时间。
[0325]
表15
[0326]
接触时间24小时(1天)和48小时(2天)
[0327]-参考：未用所述基于松萝酸的混合物m处理的器材。
[0328]
6.2.测试的描述
[0329]
将各微生物菌株移植到合适的培养基斜面上24小时，然后在盐水溶液中稀释，直到达到利用分光光度计读数估计的浓度，为1-5x108cfu/ml。各悬浮液中微生物细胞的数量是用盐水溶液的10倍数稀释来确定的，直到为10-6。从该稀释液中取两份1ml的等分试样，并接种纳入到培养基中。温育并计数平板上出现的菌落后，确定各悬浮液中每ml的菌落形成单位(cfu/ml)的数量。将1,0ml的微生物各悬浮液接种到100ml的琼脂浆中，在45℃的温度下保持熔融状态，以获得每个琼脂浆中细胞的最终浓度，为1-5x106cfu/ml。通过将5片插入合适的确认板中持续上述定义的接触时间，而制备测试和参考器材。将1,0ml接种的琼脂浆转移到为测试各悬浮液准备的每个测试和对照样品中。进行接种时的角度和速度要避免悬浮液分散在样品外。在使琼脂浆接种物凝胶化后，将样品放在温育器中，在适合微生物菌株发育的温度下进行规定的接触时间。在恒温器中使用含水托盘，将湿度保持高于75％，以防止琼脂浆接种物干燥。在每个规定的接触时间，从培养皿中取出经处理的非参考器材的
样品，并将其转移到含有中和肉汤的烧瓶中，其体积使得形成初始接种物1：10的稀释液。将烧瓶进行超声处理1分钟，随后用涡旋进行机械混合，以确保琼脂浆从样品中完全释放。因此，将中和肉汤进行1:10的连续稀释，每一次通过纳入适合于特定微生物菌株发育的培养基中进行接种。为了确定从处理过的表面释放的功效，将样品通过包含在熔融培养基中进行接种。温育后，对每个所制备的稀释液形成的菌落数量进行计数和记录，计算出每个悬浮液和接触时间的存活微生物数量(cfu/ml)。
[0330]
6.3.结果的计算和表达
[0331]
结果表示为经处理的器材样品相对于如参考标准所规定的未处理的器材样品的微生物污染减少的百分比。对经抗微生物剂处理的器材和未经处理的器材计算在五次重复中回收的微生物的数量的几何平均值；因此计算对照样品的几何平均值的反对数和经处理的样品的几何平均值的反对数之间的百分比差异。
[0332]
几何平均值＝(logr1 logr2 logr3 logr4 logr5)/5
[0333]
其中：
[0334]
r1/2/3/4/5＝接触被测物或对照物并温育后回收的微生物总数(重复实验1/2/3/4/5)。
[0335]
减少的百分比＝(a-b)x100/a
[0336]
其中：
[0337]
a＝未经处理的参考器材的几何平均值的反对数
[0338]
b＝经处理的器材的几何平均值的反对数
[0339]
6.4.测试的有效性标准
[0340]
当初始微生物的回收率等于或大于104cfu/ml时，该试验被认为是有效的。为了宣布器材在测试条件下有效，astm 2180参考标准要求相对于未处理的参比而言，评估的微生物污染下降百分比等于或大于99％。
[0341]
7.结果
[0342]
获得的结果总结在下表中。
[0343]
表16：菌株计数(cfu/ml)
[0344][0345]
表17：不同接触时间下存活的微生物的平均对数表示
[0346][0347]
表18：不同接触时间的下降百分比
[0348]
[0349]
表19：不同接触时间的对数下降
[0350][0351]
8.结论
[0352]
根据所获得的结果，在符合测试的有效性标准时，可以得出结论：根据astm e-2180-07标准规定的要求(下降大于99％)和在24小时接触时间的测试条件下，用松萝酸(本发明的主题)处理的器材针对革兰氏阳性细菌的代表性菌株(金黄色葡萄球菌mrsa)有效。