一种利用大肠杆菌制备大豆豆血红蛋白的方法与流程

一种利用大肠杆菌制备大豆豆血红蛋白的方法
1.本技术要求于2020年1月10日提交的美国临时专利申请第62/959,702号的优先权，其为了所用目的通过引用而结合，就像在本文中完全阐述了一样。
技术领域
2.本发明涉及一种利用大肠杆菌制备大豆豆血红蛋白的方法以及大豆豆血红蛋白用作肉类调味剂和铁补充剂的用途。


背景技术：

3.人类从打猎生活开始就开始吃肉，肉主要来自被猎杀动物的肉(肌肉组织)。人类在发展，各行业也在发展，但也有一些问题需要解决。其中，畜牧业的发展带来了各种问题，包括环境问题。例如，环境问题包括畜牧业，畜牧业占所有人类温室气体排放的15％左右，其中一半来自全球饲养的15亿头牛。动物肉还需要比相同数量的植物多4-25倍的水和6-17倍的土地。此外，随着近来对动物生命权的认识的提高，为了获得肉类而进行屠宰已成为动物伦理中的一个问题。更为严重的问题是，随着世界人口快速增长，肉的供应也会像今天一样存在一个限制。
4.人造肉作为解决动物肉背后的低效率、反环境和反健康的恶性循环的主要工具而备受关注。一般来说，人造肉是指由素食成分制成的食品，有时不含奶制品等动物产品。许多人造肉是基于大豆(例如豆腐、豆豉)或基于麸质的，但现在也可能由豌豆蛋白制成。人造肉的目标市场包括素食者、纯素食者、寻求减少肉类消费的非素食者，以及遵循印度教、犹太教、伊斯兰教和佛教的宗教饮食的人。根据一份最近的报告，2017年全球人造肉市场规模为41.75亿美元，预计到2025年将达到75.49亿美元。人造肉的重要性的根本原因通常始于喂养预计从现在的77亿增加到2050年的98亿和2100年的112亿的全球人口。这一增长的大部分将发生在非洲，其次是亚洲。
5.尽管人造肉的发展很重要，但今天市场上的无肉肉类产品在一个重要方面是不同的。人造肉由植物制成，以提供与肉类相同的食品质地。大多数生产人造肉的公司选择通过在人造肉中添加甜菜汁或其他植物色素来获得独特的肉色，但它们无法提供像肉类一样的风味。
6.因此，相比任何其他事情，更有必要开发一种能够提供和保持真正肉类的风味和颜色的食品添加剂。
7.同时，铁(fe)是一种微量元素，在体内对氧的运输起至关重要的作用，是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、铁/硫蛋白和生物分子结构的重要组成部分。体内铁的总平均量约为3至4克，其中60％至65％与循环红细胞中的血红蛋白结合，其余30％至35％作为储存铁(铁蛋白)而存在。铁也以组织铁和血清铁(转铁蛋白)的形式存在，此外，肌肉的肌红蛋白中也有少量铁。
8.铁在体内不能合成，因此必须完全通过摄入获得，以血红素铁和非血红素铁两种类型存在。血红素铁是一种铁络合物，其具有与体内的血红蛋白的血红素结构相同的部分，
非血红素铁是不具有与血红蛋白的血红素结构相同的部分的铁络合物。这两种类型的铁都可以用作铁补充剂(补铁化合物)，已知血红素铁的生物利用度远高于非血红素铁。此外，血红素铁在体内的吸收不受其他饮食因素的影响。此外，血红素铁具有不会引起已针对非血红素铁报道过的各种副作用(便秘、胃肠失调等)的优点。
9.通常，血红素铁是由屠宰动物的血液(例如猪血)制成的。通过以下方式从屠宰场的血液制备血红素铁：首先从屠宰场的血液中分离出血红蛋白，然后再从分离出的血红蛋白中分离出血红素铁。可以通过使用醇和咪唑衍生物的方法(lindroos，美国专利4,431,581)、向其中添加氨基酸的方法(ingberg等人，美国专利5,008,388)、使用高浓度有机酸在高温下进行分解的方法(liu等人,j.agric.food chem.,44,2957,1996)、使用蛋白酶的方法等从血红蛋白分离血红素铁。
10.这样通过常规方法制备的血红素铁有许多非血红素铁不存在的问题，例如被动物源性感染源感染的风险、家畜生长激素污染和残留抗生素。因此，有必要开发一种不来源于动物血液的血红素铁的制备方法。


技术实现要素：

11.因此，牢记相关技术中遇到的问题做出了本发明，本发明旨在解决这些问题。
12.一方面，制备大豆豆血红蛋白的方法包括：构建含有用于血红素生物合成途径酶的基因的第一质粒；构建含有用于大豆豆血红蛋白lgb2的基因的第二质粒；构建含有第一质粒和第二质粒的第一大肠杆菌生产宿主；以及通过培养第一大肠杆菌生产宿主来生产大豆豆血红蛋白。
13.在另一方面，血红素生物合成途径酶是ala合酶、nadp依赖的苹果酸酶、二羧酸转运体和亚铁螯合酶。
14.在另一方面，大豆豆血红蛋白由具有如seq id no:1所示的氨基酸序列的珠蛋白和具有分子式1的血红素组成。
[0015][0016]
在另一个方面，第一质粒具有seq id no:6所示的核苷酸序列。
[0017]
在另一个方面，第二质粒具有seq id no:8所示的核苷酸序列。
[0018]
在另一个方面，ala合酶是具有seq id no:2所示的核苷酸序列的球形红杆菌ala合酶，nadp依赖的苹果酸酶是具有seq id no:3所示的核苷酸序列的大肠杆菌nadp依赖的苹果酸酶，二羧酸转运体是具有seq id no:4所示的核苷酸序列的大肠杆菌二羧酸转运体，并且亚铁螯合酶是具有seq id no:5所示的核苷酸序列的大肠杆菌亚铁螯合酶。
[0019]
在另一个方面，该方法还包括使用琥珀酸将ph调节至7至9，以培养第一大肠杆菌生产宿主。
[0020]
在一个方面，制备大豆豆血红蛋白的方法包括：构建含有用于血红素生物合成途径酶的基因的第三质粒；构建含有第三质粒的第二大肠杆菌生产宿主；通过培养第二大肠杆菌生产宿主生产大豆豆血红蛋白。
[0021]
在另一方面，血红素生物合成途径酶是ala合酶、nadp依赖的苹果酸酶、二羧酸转运体和亚铁螯合酶。
[0022]
在另一个方面，大豆豆血红蛋白由具有如seq id no:1所示氨基酸序列的珠蛋白和具有分子式1的血红素组成。
[0023][0024]
在另一个方面，第三质粒具有seq id no:9所示的核苷酸序列。
[0025]
在另一个方面，ala合酶是具有seq id no:2所示核苷酸序列的球形红杆菌ala合酶，nadp依赖的苹果酸酶是具有seq id no:3所示核苷酸序列的大肠杆菌nadp依赖的苹果酸酶，二羧酸转运体是具有seq id no:4所示核苷酸序列的大肠杆菌二羧酸转运体，亚铁螯合酶是具有seq id no:5所示核苷酸序列的大肠杆菌亚铁螯合酶。
[0026]
在另一个方面，该方法还包括使用琥珀酸将ph调节至7至9，以培养第二大肠杆菌生产宿主。
[0027]
在一个方面，制备大豆豆血红蛋白的方法包括：构建含有用于大豆豆血红蛋白lgb2的基因的第二质粒；构建含有第二质粒的第三大肠杆菌生产宿主；通过培养第三大肠杆菌生产宿主制备珠蛋白；通过微生物发酵或化学合成制备血红素；以及将珠蛋白与血红素结合，从而得到大豆豆血红蛋白。
[0028]
在另一个方面，第二质粒具有seq id no:8所示的核苷酸序列。
[0029]
在另一方面，生产血红素包括：构建含有用于血红素生物合成途径酶的基因的第一质粒；构建含有第一质粒的第四大肠杆菌生产宿主；以及通过培养第四大肠杆菌生产宿主制备血红素。
[0030]
在另一个方面，第一质粒具有seq id no:6所示的核苷酸序列。
[0031]
在一个方面，可用作肉类调味剂和/或铁补充剂的组合物包括根据本发明的方法制备的大豆豆血红蛋白。
[0032]
应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都是示例性和解释性的，并且旨在提供对所要求保护的发明的进一步解释。
附图说明
[0033]
所包括的附图用于提供对本发明的进一步理解并且被并入并构成本说明书的一部分，这些附图说明了本发明的实施方式，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。
[0034]
在附图中，
[0035]
图1描绘了plex_hmdh的质粒图谱。
[0036]
图2描绘了pbad_legh的质粒图谱。
[0037]
图3描绘了plex_lhmdh的质粒图谱。
[0038]
图4是sds-page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析结果。泳道m：蛋白质标记，泳道1：珠蛋白，泳道2：实施例8，泳道3：实施例9，泳道4：实施例10-4，泳道5：实施例10-5。
[0039]
图5是非变性page分析的结果。泳道1：珠蛋白，泳道2：实施例8，泳道3：实施例9，泳道4：实施例10-4，泳道5：实施例10-5。红色箭头：血红素-珠蛋白络合物。
[0040]
图6是光谱分析的结果。
[0041]
图7是荧光光谱分析的结果。
具体实施方式
[0042]
现在将详细描述本发明的实施方式，其实施例在附图中示出。
[0043]
为了实现上述目的，本发明人经过深入研究，开发了制备大豆豆血红蛋白的方法，以及含有大豆豆血红蛋白的组合物。该组合物可以用作肉类调味剂和铁补充剂，最终得到本发明。
[0044]
如本文所用，术语“血红素铁”是指包含与体内血红蛋白的血红素具有相同结构的部分的铁络合物，并且术语“非血红素铁”是指不包含与血红蛋白的血红素具有相同结构的部分的铁络合物。
[0045]
本发明的珠蛋白包括与seq id no：1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的珠蛋白变体，但不限于此。氨基酸序列同一性在本文中定义为候选序列中与珠蛋白序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在同一阅读框中对准序列，必要时引入空隙，以达到最大百分比的序列同一性，并且不考虑将任何保守替换作为序列同一性的一部分。
[0046]
为了确定两个氨基酸序列的百分比同一性，为了最佳的比较目的，将序列对齐(例如，在第一序列的序列中可以引入间隙)。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸占据时，那么在该位置分子是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数(即，％同一性＝相同位置的数量/总位置数量
×
100)。
[0047]
本发明的含有大豆豆血红蛋白的组合物可以另外包含食品级成分，例如糖、盐、防腐剂和添加剂，但不限于此。除上述成分外，本发明的含有大豆豆血红蛋白的组合物还可包括乳化剂、悬浮剂和稳定剂，但不限于此。
[0048]
本发明的含有大豆豆血红蛋白的组合物可以作为肉类调味剂添加到人造肉中。人造肉例如为植物肉、培养肉(细胞培养肉)和合成肉，但不限于此。
[0049]
本发明的含有大豆豆血红蛋白的组合物可以作为铁补充剂添加到食物中。食物例如为薄脆饼干、曲奇饼干、休闲食品和饮料，但不限于此。
[0050]
本发明的大豆豆血红蛋白添加到人造肉或食品中的量因人造肉或食品的类型而异。通常，将大豆豆血红蛋白添加到人造肉或食品中，以运送不超过1％(w/w)的大豆豆血红蛋白。
[0051]
在通过大肠杆菌发酵工艺制备大豆豆血红蛋白的过程中，大肠杆菌hmdh_legh-d或大肠杆菌hmdh_legh-s被用作生产宿主。
[0052]
在使用生产宿主大肠杆菌hmdh_legh-d或大肠杆菌hmdh_legh-s生物制备大豆豆血红蛋白的过程中，培养过程的ph被保持在7-9的范围内，优选在8-9的范围内。这里，使用琥珀酸调节ph。当在该过程中使用琥珀酸调节ph时，琥珀酸是在大豆豆血红蛋白生物合成中用作底物的物质，有利于大豆豆血红蛋白的高效生产。
[0053]
在通过分别制备的珠蛋白和血红素的体外结合工艺制备大豆豆血红蛋白的过程中，以大肠杆菌legh作为珠蛋白的生产宿主。
[0054]
在通过分别制备的珠蛋白和血红素的体外结合工艺制备大豆豆血红蛋白的过程中，以大肠杆菌hmdh作为血红素的生产宿主。
[0055]
在通过分别制备的珠蛋白和血红素的体外结合工艺制备大豆豆血红蛋白的过程中，血红素可以通过化学工艺生产。
[0056]
本发明的实际和目前优选的实施方式是说明性的，如以下实施例所示。
[0057]
然而，应当理解，本领域技术人员在考虑到本公开内容后，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
[0058]
实施例1：质粒plex_hmdh的构建
[0059]
通过常规的亚克隆将球形红杆菌ala合酶(hema)、大肠杆菌nadp依赖的苹果酸酶(maeb)、大肠杆菌二羧酸转运体(dcta)和大肠杆菌亚铁螯合酶(hemh)编码到plex载体(invitrogen)中的基因，构建包含本发明血红素生物合成途径的四种核心酶的表达质粒。球形红杆菌ala合酶的核苷酸序列如seq id no:2所示；大肠杆菌nadp依赖的苹果酸酶的核苷酸序列如seq id no:3所示；大肠杆菌二羧酸转运体的核苷酸序列如seq id no:4所示；大肠杆菌亚铁螯合酶的核苷酸序列如seq id no:5所示。
[0060]
所得质粒命名为plex_hmdh。在质粒plex_hmdh中，每个插入的基因在每个基因前后都有单独的pl启动子和aspa转录终止子(图1)。
[0061]
plex_hmdh的核苷酸序列如seq id no:6所示。
[0062]
实施例2：质粒pbad_legh的构建
[0063]
大豆豆血红蛋白lgb2的编码序列经过密码子优化以在大肠杆菌中表达，化学合成并克隆到pbad载体(invitrogen)中，得到质粒pbad_legh(图2)。
[0064]
质粒pbad_legh含有用于大豆豆血红蛋白的珠蛋白的编码序列。
[0065]
大豆豆血红蛋白lgb2的密码子优化的核苷酸序列如seq id no:7所示，pbad_legh的核苷酸序列如seq id no:8所示。
[0066]
实施例3：质粒plex_lhmdh的构建
[0067]
通过常规的亚克隆将球形红杆菌ala合酶(hema)、大肠杆菌nadp依赖的苹果酸酶(maeb)、大肠杆菌二羧酸转运体(dcta)、大肠杆菌亚铁螯合酶(hemh)以及大豆豆血红蛋白lgb2的密码子优化的核苷酸序列编码到plex载体(invitrogen)中的基因，构建了包含本发明的血红素生物合成途径的四种核心酶和大豆豆血红蛋白lgb2的表达质粒。球形红杆菌
ala合酶的核苷酸序列如seq id no:2所示；大肠杆菌nadp依赖的苹果酸酶的核苷酸序列如seq id no:3所示；大肠杆菌二羧酸转运体的核苷酸序列如seq id no:4所示；大肠杆菌亚铁螯合酶的核苷酸序列如seq id no:5所示；大豆豆血红蛋白lgb2的密码子优化的核苷酸序列如seq id no:7所示。
[0068]
所得质粒命名为plex_lhmdh。在质粒plex_lhmdh中，每个插入的编码血红素合成酶的基因在每个基因前后都有单独的p
l
启动子和aspa转录终止子，并且插入的编码大豆豆血红蛋白lgb2的基因具有arabad启动子和rrnb t1终止子(图3)。plex_lhmdh的核苷酸序列如seq id no:9所示。
[0069]
实施例4：血红素生产宿主的构建
[0070]
用质粒plex_hmdh转化的大肠杆菌k-12dh10b细胞用作本发明的血红素的生产宿主。该构建的生产宿主被命名为大肠杆菌hmdh。
[0071]
作为生产血红素的源接种物，生产宿主大肠杆菌hmdh在25％甘油(v/v)中的冷冻细胞库保持在-80℃。
[0072]
实施例5：珠蛋白的生产宿主的构建
[0073]
用质粒pbad_legh转化的大肠杆菌k-12dh10b细胞用作本发明的珠蛋白的生产宿主。该构建的生产宿主命名为大肠杆菌legh。
[0074]
作为生产珠蛋白的源接种物，生产宿主大肠杆菌legh在25％甘油(v/v)中的冷冻细胞库保持在-80℃。
[0075]
实施例6：使用质粒plex_hmdh和pbad_legh构建大豆豆血红蛋白的生产宿主
[0076]
用两种表达构建体(plex_hmdh和pbad_legh)转化的大肠杆菌k-12dh10b细胞用作本发明的大豆豆血红蛋白的生产宿主。所构建的生产宿主命名为大肠杆菌hmdh_legh-d。
[0077]
作为生产大豆豆血红蛋白的源接种物，生产宿主大肠杆菌hmdh_legh-d在25％甘油(v/v)中的冷冻细胞库保持在-80℃。
[0078]
实施例7：使用质粒plex_lhmdh构建大豆豆血红蛋白的生产宿主
[0079]
用质粒plex_lhmdh转化的大肠杆菌k-12dh10b细胞用作本发明的大豆豆血红蛋白的生产宿主。所构建的生产宿主命名为大肠杆菌hmdh_legh-s。
[0080]
作为生产大豆豆血红蛋白的源接种物，生产宿主大肠杆菌hmdh_legh-s在25％甘油(v/v)中的冷冻细胞库保持在-80℃。
[0081]
实施例8：使用生产宿主大肠杆菌hmdh_legh-d生产大豆豆血红蛋白
[0082]
使用大肠杆菌hmdh_legh-d(生产宿主)通过微生物发酵生产大豆豆血红蛋白。
[0083]
将10ml含有50μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的lb(luria-bertani)培养基(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物和10g/l nacl)加入50ml锥形管中，并将生产宿主接种于其中，然后使用旋转摇动培养箱在37℃和200rpm下培养过夜。接下来，将1ml过夜培养后获得的培养肉汤接种在添加了60ml含有50μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的s培养基(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l kh2po4、10g/l琥珀酸盐、2g/l甘氨酸和10mg/l fecl2·
4h2o)的250ml锥形瓶中，然后在37℃和200rpm下培养4小时。培养4小时后，将所得培养液接种到含有3l含有50μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的s培养基的5l发酵器中。发酵器中的培养液在37℃、0.5vvm通气量和200rpm下培养，直到培养物达到od
600
为0.5。当培养物达到od
600
＝0.5时，在培养液中加入l-阿拉伯糖(终浓度＝0.2％)溶液，并将发酵器中的培养液再培
养72小时(37℃，0.5vvm，200rpm)。在发酵过程中，ph保持在8-9，ph调节通过使用琥珀酸进料来控制。使用琥珀酸控制ph的优势在于，琥珀酸是血红素生物合成中用作底物的物质，最终有利于组合物的高效生产。发酵后，在4℃以4500
×
g离心15分钟收回所得细胞。
[0084]
把从发酵肉汤离心获得的细胞团块通过超声处理进行裂解，具体地，将细胞重新悬浮在50ml 20mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)中，该细胞悬液中的细胞通过如下超声处理而破碎：超声处理20秒以破碎细胞，然后停下来休息5秒，如此重复20分钟。将获得的全细胞裂解物再次离心(25000
×
g，10分钟)以分离沉淀物和上清。
[0085]
用上述所得上清进行硫酸铵沉淀，以浓缩制备的大豆豆血红蛋白。更确切地说，将所得上清用固体硫酸铵调节到40％的饱和度，并搅拌2小时，在4℃以25000
×
g离心15分钟去除沉淀材料，并用固体硫酸铵使上清达到70％饱和度。将该溶液搅拌2小时，然后在4℃以25000
×
g离心30分钟来收回沉淀物。将沉淀的大豆豆血红蛋白重新悬浮在5ml50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)中。为了去除过量的硫酸铵，使用sephadex g-25(ge healthcare)作为脱盐树脂。用sephadex g-25按照2.6
×
10cm填充柱子，此时总填充床体积约为50ml。上样前用50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)平衡柱子。然后，将含有大豆豆血红蛋白的样品装载到柱子上。然后用50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)冲洗柱子，收集具有蛋白峰的部分。
[0086]
用0.2μm过滤器过滤脱盐部分，然后进行阴离子交换色谱法。用qsepharose快速流动阴离子交换树脂(ge healthcare)填充hitrap q ff阴离子交换色谱柱，此时总填充床体积约为5ml。在上样前用吸附缓冲液(50mm tris-hcl,ph 8.0)平衡色谱柱。然后，将含有大豆豆血红蛋白的样品装载到色谱柱上，随后用25ml(5倍柱体积)的吸附缓冲液冲洗。使用含有0.1m氯化钠的50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)洗脱大豆豆血红蛋白。为了去除用于洗脱大豆豆血红蛋白的氯化钠，使用amicon ultra-15 3k离心过滤器(millipore)在4℃下通过离心(4500rpm，10分钟)将含有大豆豆血红蛋白的洗脱液针对50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)透析。同时，将透析的大豆豆血红蛋白浓缩并储存在-20℃直至使用。
[0087]
实施例9：使用生产宿主大肠杆菌hmdh_legh-s生产大豆豆血红蛋白
[0088]
使用大肠杆菌hmdh_legh-s(生产宿主)通过微生物发酵生产大豆豆血红蛋白。
[0089]
将含有50μg/ml氯霉素的10ml lb(luria-bertani)培养基(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物和10g/l nacl)加入50ml锥形管中，并将生产宿主接种于其中，然后使用旋转摇动培养箱在37℃和200rpm下培养过夜。接下来，将1ml过夜培养后获得的培养肉汤接种在250ml锥形瓶中，该锥形瓶中添加了60ml含有50μg/ml氯霉素的s培养基(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l kh2po4、10g/l琥珀酸盐、2g/l甘氨酸和10mg/lfecl2·
4h2o)，然后在37℃和200rpm下培养4小时。培养4小时后，将所得培养液接种到含有3l含有50μg/ml氯霉素的s培养基的5l发酵器中。发酵器中的培养液在37℃、0.5vvm通气量和200rpm下培养，直到培养物达到od
600
为0.5。当培养物达到od
600
＝0.5时，在培养液中加入l-阿拉伯糖(终浓度＝0.2％)溶液，并将发酵器中的培养液再培养72小时(37℃，0.5vvm，200rpm)。在发酵过程中，ph保持在8-9，ph调节通过使用琥珀酸进料来控制。使用琥珀酸控制ph的优势在于，琥珀酸是血红素生物合成中用作底物的物质，最终有利于组合物的高效制备。发酵后，通过在4℃以4500
×
g离心15分钟收回所得细胞。
[0090]
把从发酵肉汤离心获得的细胞团块通过超声处理进行裂解，具体地，将细胞重新悬浮在50ml 20mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)中。该细胞悬液中的细胞通过如下超声处理而
tris-hcl缓冲液(ph 8.0)平衡柱子。然后，将含有珠蛋白的样品装载到柱子上。然后用50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)冲洗柱子，收集具有蛋白质峰的部分。
[0099]
用0.2μm过滤器过滤脱盐部分，然后进行阴离子交换色谱法。用qsepharose快速流动阴离子交换树脂(ge healthcare)填充hitrap q ff阴离子交换色谱柱，此时总填充床体积约为5ml。在上样前用吸附缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.0)平衡色谱柱。然后，将含有珠蛋白的样品装载到色谱柱上，然后用25ml(5倍柱体积)的吸附缓冲液冲洗。使用含有0.1m氯化钠的50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)洗脱珠蛋白。为了去除用于洗脱珠蛋白的氯化钠，使用amicon ultra-15 3k离心过滤器(millipore)在4℃通过离心(4500rpm，10分钟)将含有珠蛋白的洗脱液针对50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)透析。同时，将透析后的珠蛋白浓缩并储存在-20℃直至使用。
[0100]
实施例10-2：通过生物工艺生产血红素
[0101]
使用大肠杆菌hmdh(生产宿主)通过微生物发酵生产血红素。
[0102]
将10ml含有50μg/ml氯霉素的lb(luria-bertani)培养基(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物和10g/l nacl)加入50ml锥形管中，并将生产宿主接种于其中，然后使用旋转摇动培养箱在37℃和200rpm下培养过夜。接下来，将1ml过夜培养后获得的培养肉汤接种在250ml锥形瓶中，该锥形瓶中添加了50ml含有50μg/ml氯霉素的s培养基(10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l kh2po4、10g/l琥珀酸盐、2g/l甘氨酸和10mg/lfecl2·
4h2o)，然后在37℃和200rpm下培养4小时。培养4小时后，将所得培养液接种到含有5l含有50μg/ml氯霉素的s培养基的10l发酵器中。将发酵器中的培养液培养72小时(37℃，0.5vvm通气量，200rpm)。在发酵过程中，ph保持在8-9，ph调节通过使用琥珀酸进料来控制。使用琥珀酸控制ph值的优势在于，琥珀酸是血红素生物合成中用作底物的物质，最终有利于血红素的高效制备。发酵后，通过在4℃以3000
×
g离心15分钟收回所得细胞。
[0103]
通过将收回的细胞悬浮在pbs(磷酸盐缓冲盐水)中然后进行离心，将收回的细胞清洗两次。将最终收回的细胞自然干燥约30分钟，然后称重。通常，可以从5l培养肉汤中收回40g至50g细胞。向收回的细胞中加入冷酸-丙酮，从而提取血红素。这里，使用的冷酸-丙酮是通过在-20℃将998ml丙酮与2ml盐酸(hcl)混合制备的。以这样的方式添加冷酸-丙酮，其中将1l冷酸-丙酮添加到从5l培养肉汤收回的细胞中。使用冷酸-丙酮提取血红素在4℃进行5天。将经过5天的血红素提取获得的溶液通过硅藻土填充柱，由此收回含有丙酮的血红素。将由此获得的含有丙酮的血红素用旋转蒸发仪进行浓缩。这里，进行浓缩直到体积从1l减少到30ml。在这样得到的溶液中加入10倍体积的二氯甲烷，充分混合，然后静置，直到分层。分层后，回收下层并使用旋转蒸发仪进行浓缩。这里，进行浓缩直到体积变成30毫升。浓缩后，根据浓缩物中含有的血红素当量，加入2.1当量的naoh水溶液，充分混合，然后静置直至分层。分层后，回收上层，在4℃储存，直至使用。或将上层冷冻干燥，使用时将其溶于水。
[0104]
实施例10-3：通过化学合成生产血红素
[0105]
血红素是通过化学合成过程产生的，该过程将铁离子(fe
2
)配位到原卟啉ix中。将原卟啉ix(ppix，10g，17.8mmol)溶解于四氢呋喃(150ml)中，缓慢加入fecl2·
4h2o(14.4g，53.3mmol)，并在85℃下回流4小时。反应结束后，通过真空蒸馏除去有机溶剂。然后，向反应混合物中加入naoh水溶液，使反应混合物溶解在其中，将所得溶液通过填充有545的
柱子过滤，并将由此获得的滤液中和，从而得到游离酸形式的化学合成血红素(10.8g，99％)。将溶解在蒸馏水(15ml)中的naoh(630mg，15.9mmol)溶液加入到上述获得的游离酸形式的血红素(5g，8.11mmol)中，并在室温下搅拌进行30分钟氯化。反应结束后，将反应混合物在-80℃冷冻，然后冷冻干燥并由此脱水，从而得到盐形式的化学合成血红素(5.25g，98％)。
[0106]
实施例10-4：单独制备的珠蛋白和生物血红素的体外结合
[0107]
对从实施例10-1获得的珠蛋白和从实施例10-2获得的血红素进行体外结合。更确切地，将10ml 100μm珠蛋白溶液和10ml 1mm血红素溶液(摩尔比＝1:10)加入到50ml锥形管中，然后轻轻涡旋，以在室温下反应30分钟。
[0108]
反应后，用0.2μm过滤器过滤血红素-珠蛋白络合物溶液，然后进行阴离子交换色谱法。用q sepharose快速流动阴离子交换树脂(ge healthcare)填充hitrap q ff阴离子交换色谱柱，此时总填充床体积约为5ml。在上样前用吸附缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.0)平衡色谱柱。然后，将含有血红素-珠蛋白络合物的样品装载到色谱柱上，随后用25ml(5倍柱体积)的吸附缓冲液冲洗。使用含有0.1m氯化钠的50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)洗脱血红素-珠蛋白络合物。为了去除用于洗脱血红素-珠蛋白络合物的氯化钠，使用amicon ultra-15 3k离心过滤器(millipore)在4℃通过离心(4,500rpm，10分钟)将含有血红素-珠蛋白络合物的洗脱液针对50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)进行透析。同时，将透析后的血红素-珠蛋白络合物浓缩并储存在-20℃直至使用。
[0109]
实施例10-5：单独制备的珠蛋白和化学合成的血红素的体外结合
[0110]
对从实施例10-1获得的珠蛋白和从实施例10-3获得的血红素进行体外结合。更确切地，将10ml 100μm珠蛋白溶液和10ml 1mm血红素溶液(摩尔比＝1:10)加入50ml锥形管中，然后轻轻涡旋，以在室温下反应30分钟。
[0111]
反应后，用0.2μm过滤器过滤血红素-珠蛋白络合物溶液，然后进行阴离子交换色谱法。用q sepharose快速流动阴离子交换树脂(ge healthcare)填充hitrap q ff阴离子交换色谱柱，此时总填充床体积约为5ml。在上样前用吸附缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.0)平衡色谱柱。然后，将含有血红素-珠蛋白络合物的样品装载到色谱柱上，随后用25ml(5倍柱体积)的吸附缓冲液冲洗。使用含有0.1m氯化钠的50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)洗脱血红素-珠蛋白络合物。为了去除用于洗脱血红素-珠蛋白络合物的氯化钠，使用amicon ultra-15 3k离心过滤器(millipore)在4℃通过离心(4500rpm，10分钟)将含有血红素-珠蛋白络合物的洗脱液针对50mm tris-hcl溶液(ph 8.0)进行透析。同时，将透析后的血红素-珠蛋白络合物浓缩并储存在-20℃直至使用。
[0112]
实施例11：含有大豆豆血红蛋白的组合物作为液体制剂的制备
[0113]
将通过实施例8-10中公开的过程获得的含有大豆豆血红蛋白的溶液用氯化钠和抗坏血酸钠缓冲液进行缓冲液交换，然后将最终浓度调节为1mg/ml或10mg/ml。浓度调节后的溶液使用0.2μm过滤器过滤并冷冻，以制备作为液体制剂的组合物。
[0114]
实施例12：含有大豆豆血红蛋白的组合物作为冻干制剂的制备
[0115]
众所周知，蛋白质在水态下相对不稳定，并且在加工和储存过程中会发生化学和物理降解，导致生物活性丧失。冷冻干燥(也称为冻干)是一种保存蛋白质以供储存的方法。
[0116]
将实施例11制备的浓度调节后的溶液冷冻干燥，以制备作为冷冻干燥制剂的组合
物。
[0117]
冷冻干燥过程的描述如下：
[0118]
(a)使用0.2μm过滤器过滤浓度调节后的溶液。
[0119]
(b)将装有过滤后的溶液的瓶子放在不锈钢托盘上。
[0120]
(c)将托盘装入冷冻干燥机并使用以下冷冻干燥循环冻干溶液：
[0121]
(c-1)在4℃平衡约20分钟。
[0122]
(c-2)使搁板温度在-40℃并维持12小时。
[0123]
(c-3)使冷凝器温度在-50℃。
[0124]
(c-4)对腔室施加真空。
[0125]
(c-5)当真空达到1500豪托时，将搁板温度升至-20℃并保持16小时。
[0126]
(c-6)以每1小时升高10℃的方式将搁板温度升高至20℃并保持4小时。
[0127]
(c-7)打破真空。
[0128]
(d)用适当的flip-off盖塞住小瓶并密封塞住的小萍。
[0129]
冻干制剂在4℃储存。
[0130]
实施例13：大豆豆血红蛋白的鉴定
[0131]
为了鉴定从实施例8、实施例9、实施例10-4和实施例10-5获得的大豆豆血红蛋白，进行了电泳分析(sds-page分析和非变性page分析)、光谱分析和荧光光谱分析。对于冻干的组合物，在分析之前，使用蒸馏水使冻干的组合物复原。在电泳中，使用15％凝胶进行sds-page电泳以确认珠蛋白大小，并且使用10％凝胶在非变性和非还原条件下进行非变性page用于血红素-珠蛋白络合物的迁移位移。使用酶标仪(tecan，infinite m200 pro)进行光谱分析，使用荧光猝灭法进行荧光光谱分析。简要描述用于光谱分析的吸光度测量，透明的96孔板的孔中加入100μl的每个样品，然后使用酶标仪测量从280nm到500nm的吸光度。荧光猝灭是一种用于研究分子相互作用的技术，是一种观察配体-蛋白质结合(如血红素-珠蛋白络合物)的简便方法(principles of fluorescence spectroscopy，277-330)。激发波长为280nm，发射波长在300nm和500nm之间测量。
[0132]
通过sds-page估计珠蛋白和血红素-珠蛋白络合物的mr约为13kda(图4)。另一方面，通过非变性条件下的非变性page分析，由于蛋白质的荷质比、物理形状和大小的差异，珠蛋白和血红素-珠蛋白络合物之间显示了带迁移位移(图5)。此外，在凝胶染色之前，该带被检测为棕色带(图5)。光谱分析表明，血红素-珠蛋白络合物有约350nm至400nm的很宽的峰，而珠蛋白的最大吸收波长为280nm(图6)。荧光光谱分析表明，珠蛋白的最大发射波长为320nm，而所有血红素-珠蛋白络合物样品都发生荧光猝灭，这是大豆豆血红蛋白的特征(图7)。
[0133]
基于以上结果，我们得出结论，成功制备了大豆豆血红蛋白。
[0134]
实施例14：大豆豆血红蛋白在人造肉中作为调味剂的应用
[0135]
人造肉如下制备。通过料斗将植物蛋白的干燥混合物添加到挤出机料筒中，并在室温下分别注入水。将挤出机料筒加热到80-150℃之间的温度。前板上的压力在10到20巴之间。此外，在该温度范围内注入油。冷却模将产品冷却到70℃的出口温度。产品是在双螺杆挤出机上由以下材料制成的：
[0136]
表1
[0137][0138]
表2
[0139][0140][0141]
所得人造肉1和人造肉2具有肉的外观和质地。同时，随机选择的100名消费者比较了两种人造肉的味道(风味)。结果，我们发现人造肉1的味道比人造肉2好(78/100＝78％)。
[0142]
实施例15：大豆豆血红蛋白作为铁补充剂的应用
[0143]
将根据本发明制备的含有大豆豆血红蛋白的组合物施用于引起缺铁性贫血的动物，由此评价含有大豆豆血红蛋白的组合物缓解贫血的效果。
[0144]
具体地，经过2周的适应期后，将30只9周龄的sprague-dawley大鼠(雌性)分成3组，每组10只大鼠，其中1组以每天10％体重的量的正常饲料喂养1个月(第1组；对照组)，其余两组以每天10％体重的量的缺铁饲料喂养6周，以诱发缺铁性贫血(第2组和第3组)。喂养6周后，确认在属于第2组和第3组的个体大鼠中诱发缺铁性贫血。然后，一个贫血诱导组每天口服一次生理盐水(第2组)，而另一个贫血诱导组每天口服一次含有大豆豆血红蛋白的溶液(0.1mg fe/500μl溶液，第3组)，给药持续5周。在对第2组和第3组给药的5周期间，第1组持续喂食正常饲料，第2组和第3组喂食缺铁饲料。在给药期间监测异常症状的发生，在5周的给药期间任何动物均未出现异常症状。给药5周后采血，评估贫血是否得到缓解。血样采集的分析结果如下所示。
[0145]
表3血样采集的分析结果
[0146][0147][0148]
如上述结果所示，可以得出结论，本发明的含有大豆豆血红蛋白的组合物可以有效缓解缺铁性贫血，因此是作为补铁来源的有效材料。
[0149]
本领域的技术人员将理解，前述描述中公开的概念和具体实施方式可以容易地用作修改或设计用于实现本发明相同目的的其他实施方式的基础。本领域技术人员还将理解，这样的等同实施方式并不脱离如所附权利要求中规定的本发明的精神和范围。
[0150]
对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以在本发明中进行各种修改和变化。因此，本发明旨在涵盖本发明的修改和变化，只要它们在所附权利要求书及其等同物的范围内。