一种基于抗污染光热拭子用于有色食品基质中沙门氏菌的快速检测方法

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于抗污染光热拭子用于有色食品复杂基质中沙门氏菌的快速检测方法。


背景技术：

2.沙门氏菌是食源性传染病的主要原因之一，极易污染肉、蛋、奶等食品，通常当沙门氏菌只有一个菌落单位形成时，即可引起人类感染，其致病限度极低、传播力强、防控难度大，对公众健康构成严重威胁。由于平板计数法和实时聚合酶链反应的传统方法既费时又费力，因此迫切需要新的快速检测方法用于现场和在线应用。生物传感器作为一种简便、灵敏、低成本的分析手段,为食品安全快速检测特别是病原体、蛋白质、重金属及抗生素等，提供了有效的保障。
3.棉签拭子作为一种易获得、易改性、成本低的快速检测元件，已被广泛应用于样品采集、靶标富集和定量检测中。但是,在检测复杂样品过程中往往存在基质的干扰,导致生物传感器的检测灵敏度和结果科学性受到了影响。近年来,采用两性离子抗污染材料改性生物传感器的研究受到越来越多的关注。为了抵抗复杂样品中的基质干扰,提高传感器的检测灵敏度和特异性,保障最终检测结果的科学性和可靠性，抗污染生物传感器在快速检测领域的开发和应用显得尤为重要。迄今为止，两性离子改性的生物传感器已被用于快速检测领域，但尚未有关于两性离子改性棉签拭子检测沙门氏菌的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是开发一种基于抗污染光热拭子用于有色食品复杂基质中沙门氏菌的快速检测方法。
5.为了实现本发明目的，设计了抗污染棉签拭子，构建抗污染光热拭子检测平台，“金-钯纳米颗粒/适配体”为光热信号探针，配合激光发射器、热敏仪和智能手机的信号读取设备，实现对有色复杂食品基质中沙门氏菌的定性定量检测。
6.一方面，本发明提供一种基于抗污染光热拭子用于有色食品复杂基质中沙门氏菌的快速检测方法，包括：(1)抗污染棉签拭子制备体系，(2)抗污染光热拭子检测分析体系：
7.所述抗污染棉签拭子制备体系是指两性离子材料和沙门氏菌特异性适配体序列通过光引发聚合法和浸没法表面改性商用棉签；
8.优选地，抗污染材料聚甲基丙烯酸磺基甜菜碱(sbma)
9.所述sbma为强亲水性、强防污性的两性离子抗污染化学材料；
10.所述沙门氏菌特异性适配体序列用来特异性捕获沙门氏菌实现检测；
11.所述光引发聚合发为利用紫外辐照和光引发剂实现聚合反应；
12.所述浸没法为利用浸润孵育的方式实现聚合物间的物理吸附；
13.所述抗污染光热拭子检测分析体系包括抗污染棉签、金-钯纳米颗粒/适配体以及
激光发射器、热敏仪和智能手机；
14.所述金-钯纳米颗粒/适配体为检测体系中的信号探针；
15.所述信号探针为金-钯纳米颗粒与适配体共价偶联的聚合物。
16.另一方面，本发明提供沙门氏菌快速检测方法用到的抗污染棉签拭子制备材料，包括，sbma、适配体和商用棉签；
17.所述sbma与棉签拭子由紫外辐照和光引发剂实现光引发聚合；
18.优选地，紫外辐照波长365nm、紫外辐照时间20min；
19.优选地，光引发剂irgacure2595；
20.所述适配体与棉签拭子由浸没法实现物理吸附；
21.优选地，浸没孵育时间4h；
22.优选地，适配体浓度为10nm。
23.另一方面，本发明提供沙门氏菌快速检测方法用到的光热信号探针，包括，金-钯纳米颗粒纳米粒子和沙门氏菌特异性适配体；
24.所述金-钯纳米颗粒平均粒径约为35nm，呈爆米花状，用于沙门氏菌特异性适配体连接；
25.优选地，沙门氏菌特异性适配体序列为sat-sh；
26.优选地，适配体浓度为100nm；
27.优选地，冷冻法偶联金-钯纳米颗粒纳米颗粒和适配体。
28.另一方面，本发明提供上述沙门氏菌快速检测方法的检测条件：
29.抗污染棉签在鸡蛋、番茄中的孵育时间为10min，蒸馏水清洗两次；
30.抗污染棉签在金-钯纳米颗粒/适配体溶液中孵育10min，蒸馏水清洗两次；
31.热敏仪检测分析过程包括：将激光发射器对准棉签拭子头部，利用808nm的激光激发金-钯纳米颗粒纳米颗粒60s，使棉签拭子产热，所产生的温度变化利用热敏仪以及智能手机读取数据。
32.另一方面，本发明提供了一种利用前述检测方法对沙门氏菌进行定量检测的方法，包括如下步骤：
33.si：制作标准曲线：
34.将沙门氏菌原液10倍梯度稀释，构建具有不同沙门氏菌浓度的沙门氏菌-信号探针结合体系，结合抗污染光热拭子检测分析体系与前述检测步骤相同；
35.以沙门氏菌浓度的对数为横坐标，阳性样品激光激发棉签拭子后的温度值减去激光激发前的温度值为纵坐标，绘制标准曲线；
36.sii：按照前述检测方法对待测样品进行检测，将获得的待测样品的温度变化值代入标准曲线，计算得到待测样品中沙门氏菌的含量，实现对沙门氏菌的定量检测。
37.siii：实验中用到的核酸序列为：
38.tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-/nh2/(sat-nh2)
39.tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-/sh/(sat-sh)
40.siiii：确定线性范围为102～107cfu/ml，y＝1.771x 10.251，r2＝0.99376，检测限为13.2cfu/ml，从而可实现对沙门氏菌的定量检测。
41.另一方面，本发明还提供与上述方法配套的检测拭子。
42.包括：(1)抗污染棉签拭子制备体系，(2)抗污染光热拭子检测分析体系
43.所述抗污染棉签拭子制备体系是指两性离子材料和沙门氏菌特异性适配体序列通过光引发聚合法和浸没法表面改性商用棉签；
44.优选地，抗污染材料聚甲基丙烯酸磺基甜菜碱(sbma)；
45.进一步优选的，抗污染材料能够抵御鸡蛋、番茄中的大分子蛋白污染物；
46.进一步优选的，光引发聚合法能简单快速地改性棉签拭子；
47.进一步优选的，抗污染检测棉签能够提升检测过程的光热信号；
48.优选地，抗污染光热拭子检测分析体系包括抗污染棉签、金-钯纳米颗粒/适配体以及激光发射器、热敏仪和智能手机；
49.进一步优选的，冷冻法能够有效连接金-钯纳米颗粒纳米颗粒与适配体；
50.进一步优选的，沙门氏菌特异性适配体序列如sat-nh2、sat-sh所示；
51.进一步优选的，热敏仪检测分析体系为，将激光发射器对准棉签拭子头部，利用808nm的激光激发金-钯纳米颗粒纳米颗粒60s，使棉签拭子产热，所产生的温度变化利用热敏仪以及智能手机读取数据。
52.本发明拭子的检测分析原理：首先，将抗污染棉签拭子浸没在鸡蛋、番茄样品中孵育10min，此时棉签上的适配体能特异性捕获样品中的沙门氏菌，而sbma能有效阻碍鸡蛋、牛奶中非特异性蛋白的靠近，从而起到抗污染的效果，接着蒸馏水清洗两次以除去未结合的细菌；然后，将棉签浸没在金-钯纳米颗粒/适配体溶液中孵育10min，此时金-钯纳米颗粒纳米颗粒上的适配体能特异性识别棉签上携带的沙门氏菌从而使棉签肉眼可见变为褐色，用蒸馏水清洗两次以除去未结合的金-钯纳米颗粒/适配体。最后，将棉签放入暗盒中，利用便携式激光发射器、热敏仪和智能手机读取光热棉签的温度变化值，最后通过标准曲线得到沙门氏菌定量检测结果。
53.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
54.本发明通过建立一种基于抗污染光热拭子的快速检测方法用于鸡蛋、番茄复杂基质中沙门氏菌的检测。首先，制备两性离子抗污染棉签拭子，识别元件为沙门氏菌特异性适配体，光热信号为“金-钯纳米颗粒/适配体”信号探针，抗污染材料为两性离子sbma，检测过程采用夹心法，通过肉眼可以定性测定鸡蛋、番茄样品中的沙门氏菌，借助激光发射器、热敏仪和智能手机作为终端定量设备，实现光热信号的快速读取和沙门氏菌的定量快速检测。其次，本发明中通过优化实验条件，使整个检测过程能在30min内完成，与传统检测方法长达3～5天相比，本方法大大缩短了检测时间。本发明运用抗污染改性棉签拭子，提升传感器的抗污染特性，避免鸡蛋、番茄中非特异性大分子物质干扰检测信号，实现高特异性高灵敏地快速检测，本发明为实现现场即时快速检测提供可能性。
55.(一)本方法通过合成具备高灵敏光热响应的金-钯纳米颗粒纳米颗粒，并运用冷冻法将适配体与纳米颗粒耦合，形成传感光热信号探针。提高了食品复杂基质中的传感信号和检测灵敏度，并解决有色食品基质检测局限性问题，扩大了抗污棉签拭子传感平台的检测范围。
56.(二)通过实验条件优化，验证了抗污染棉签拭子对光热传感信号影响最小的特点，并改进孵育方式，由静置孵育转变为加热振动孵育，极大提高了复杂基质中沙门氏菌与识别元件的接触概率，提升特异性识别效率，从而达到降低检测限的效果。
57.(三)建立的基于抗污染光热拭子传感平台，通过肉眼能得出沙门氏菌定性检测结果，配合激光发射器、热敏仪和智能手机实现了沙门氏菌的高特异识别和高灵敏的定量检测。对沙门氏菌的线性检测范围为102～107cfu/ml，检测限为13.20cfu/ml。本研究中的生物传感器仅对沙门氏菌活菌具有高特异性，能在检测中提供食品中致病菌活菌数的参考信息，且高灵敏度、低检测限、易现场操作等特点有望在其他致病菌检测中得以拓展应用。
58.(四)将光热拭子法与国标法和传统平板技术法进行对比，在检测范围内能够准确高效地对复杂的实际样品进行检测。光热拭子法的检测结果与国标法和平板计数法检测结果一致，回收率在98.16～104.23％。
附图说明
59.图1为抗污染光热拭子检测沙门氏菌原理。
60.图2为抗污染棉签拭子抗蛋白粘附能力验证。
61.图3为抗污染棉签拭子对光热信号的影响。
62.图4为不同浓度金-钯纳米颗粒棉签拭子随辐照时间的温度变化
63.图5为适配体浓度优化结果；图a为棉签适配体浓度优化；图b为金-钯纳米颗粒/适配体浓度优化。
64.图6为光热信号优化结果；图a为光热信号的稳定性验证结果；图b为光热信号重复性验证结果；图c为孵育方式优化结果。
65.图7为光热拭子传感器检测不同浓度沙门氏菌的灵敏度。
66.图8为光热拭子传感器检测沙门氏菌的特异性
具体实施方式
67.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
68.本文所提及的金-钯纳米颗粒纳米颗粒制备方法源自文献1(cheng n,song y,shi q,et al.au@pd nanopopcorn and aptamer nanoflower assisted lateral flow strip for thermal detection of exosomes[j].analytical chemistry,2019,91(21):13986-13993.)中。实施例1一种基于抗污染光热拭子用于有色食品复杂基质中沙门氏菌的快速检测方法的建立
[0069]
1、实验材料
[0070]
2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(sbma)、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(irgacure2595)、10
×
pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液、高碘酸钠、盐酸、氯金酸(haucl4·
4h2o)、牛血清白蛋白(bsa)、四氯钯酸钠(na2pdcl4)、抗坏血酸、brij
tm
c20聚氧乙烯醚等。
[0071]
实验中用到的核酸序列如下(从5’到3’)：
[0072]
sta-sh:tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-/sh/
[0073]
sta-nh2:tatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-/nh2/
[0074]
2、一种基于抗污染光热拭子用于有色食品复杂基质中沙门氏菌的快速检测方法的设计原理
[0075]
利用抗污染光热拭子、金-钯纳米颗粒纳米颗粒、智能手机热敏仪、激光发射器，通过夹心法构建了简单、快速、抗污染、灵敏检测鸡蛋、番茄中沙门氏菌的快速检测方法。首先将抗污染棉签拭子浸没在食品样品中孵育10min，此时棉签上的适配体能特异性捕获样品中的沙门氏菌，而两性离子sbma水凝胶能有效阻碍食品中非特异性蛋白的靠近，从而起到抗污染的效果，接着蒸馏水清洗两次以除去未结合的细菌；然后将棉签浸没在金-钯纳米颗粒纳米颗粒/适配体溶液中孵育10min，此时金-钯纳米颗粒纳米颗粒上的适配体能特异性识别棉签上携带的沙门氏菌从而使棉签肉眼可见变褐色，用蒸馏水清洗两次以除去未结合的金-钯纳米颗粒纳米颗粒/适配体。将棉签放入暗盒中，利用激光发射808nm的激光以使棉签产生热信号，通过智能手机热敏仪读取光热棉签温度变化数据，热敏仪与智能手机直接连接，温度变化实时数据在手机上显示，最后通过计算激光激发前后棉签温度变化得到沙门氏菌定量检测结果。(图1)
[0076]
3、抗污染棉签拭子的制备
[0077]
将240mg高碘酸钠(naio4)和100μl浓硫酸(h2so4)加入10ml水中混合10min。然后将棉签浸泡在溶液中37℃避光孵育4h，以活化羟基生成醛基。然后用蒸馏水清洗活化后的棉签两次，以去除过量的活化剂。然后放入烘箱中烘干，4℃保存，得到活化棉签。将活化好的棉签浸没在558mg/ml的sbma和1％的irgacure2595的pbs缓冲液中，待棉签完全浸湿后放入uv365 nm下辐照20min，烘干，4℃保存，得到sbma棉签。将100μl 10nm适配体sat-nh2加入到1ml tris-hcl缓冲液(ph 8.5)中，sbma棉签浸没在溶液中37℃孵育4h，用tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次，除去未结合适配体，烘干，4℃保存，得到抗污染棉签拭子。
[0078]
4、对抗污染棉签拭子抗污染能力的验证
[0079]
将未改性棉签、活化棉签、sbma棉签和抗污染棉签拭子棉签分别在蛋液(蛋白含量约为120mg/ml)和番茄汁(蛋白含量约为5mg/ml)中浸泡10min，蒸馏水清洗三次后，用bca蛋白含量测定试剂盒测定残留在棉签上的蛋白质。(图2)
[0080]
将活化棉签与适配体孵育制备未改性棉签拭子，在活化之前先将棉签进行sbma改性得到sbma/活化棉签，在活化之后进行sbma改性得到活化/sbma棉签。将未改性棉签、sbma/活化棉签、活化/sbma棉签与适配体进行孵育，得到干燥的检测棉签后在相同浓度的标准菌液(103cfu/ml)中孵育10min，tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次后在金-钯纳米颗粒金-钯纳米颗粒纳米颗粒/适配体悬浮液中孵育10min，tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次，然后激光808nm的波长下照射棉签，得到不同棉签改性方式的温度变化，确定最优改性方式并分析不同改性方式对光热信号的影响。(图3)
[0081]
5、金-钯纳米颗粒纳米颗粒/适配体的合成
[0082]
先将40mg bij58溶解在2.5ml水中，然后将200μl haucl4(50mm)和600μl na2pdcl4(50mm)添加到制备的bij58溶液中。将所得溶液充分混合后，快速加入1.5ml抗坏血酸(250mm)，并将混合物在室温下剧烈搅拌6小时。最后，金-钯纳米颗粒纳米颗粒用tris-hcl缓冲液(ph 8.5)洗涤两次，并悬浮在1ml tris-hcl缓冲液(ph 8.5)中。将100μl 100nm适配体sat-sh加入到制备好的1ml金-钯纳米颗粒纳米颗粒悬浮液中，涡混均匀后放入-80℃环境中冷冻15min。室温静置解冻后离心(1000rmp，10min)，tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次去除未结合的适配体，并将金-钯纳米颗粒纳米颗粒/适配体悬浮于1ml tris-hcl缓冲液(ph 8.5)中，4℃保存备用。
[0083]
实施例2检测条件优化结果
[0084]
1、辐照检测时间优化
[0085]
将中制备好的金-钯纳米颗粒悬浮液分别浓缩1倍、2倍、3倍，稀释1倍、2倍，得到六个不同浓度的金-钯纳米颗粒悬浮液。用棉签蘸取对应浓度的溶液，在激光808nm的波长下照射棉签，使其发生光热效应，用可连接智能手机的热敏仪记录在激光照射10s、20s、40s、60s、90s、120s后棉签表面的温度变化，确定检测时激光辐照的时间和金-钯纳米颗粒的浓度。(图4)
[0086]
2、适配体浓度优化
[0087]
棉签适配体浓度：将中制备好的干燥sbma棉签分别放到5管1ml tris-hcl缓冲液(ph 8.5)中，每管分别加入100μl 1nm、10nm、100nm、1000nm、10000nm适配体sat-nh2，37℃下孵育4h，用缓冲液洗涤三次后烘干，在相同浓度的标准菌液(105cfu/ml)中孵育10min，tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次后在相同浓度的金-钯纳米颗粒/适配体悬浮液中孵育10min，tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次，然后激光808nm的波长下照射棉签，得到不同适配体浓度棉签的温度变化，确定制备适配体棉签所需的适配体浓度。(图5a)
[0088]
金-钯纳米颗粒/适配体浓度：将确定好适配体浓度的棉签在相同浓度的标准菌液(103cfu/ml)中孵育10min，tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次后，反别在1nm、10nm、100nm、1000nm、10000nm适配体结合的金-钯纳米颗粒悬浮液中孵育10min，tris-hcl缓冲液(ph 8.5)清洗两次，然后激光808nm的波长下照射棉签，得到不同浓度的金-钯纳米颗粒/适配体检测棉签的光热温度变化，确定制备金-钯纳米颗粒/适配体所需的适配体浓度。(图5b)
[0089]
3、光热信号优化
[0090]
稳定性优化：通过制冷和制热的方式改变检测环境温度为4℃、18℃和28℃，探究在不同环境温度下光热温度变化的稳定性。(图6a)
[0091]
重复性优化：使用同一棉签，每间隔5min使用激光辐照棉签，共检测五次，探究棉签光热信号的重复性。(图6b)
[0092]
孵育方式优化：将检测时的孵育条件设置为静置、振荡、加热、振荡加热四种，探究不同孵育方式对光热信号的影响。(图6c)
[0093]
实施例3检测方法的灵敏度测定
[0094]
根据上述优化体系，将沙门氏菌原液10倍浓度梯度稀释，将抗污染棉签拭子，于室温下孵育10min后，测试所制备棉签的最低检测限。由(图7)可知光热信号随沙门氏菌浓度的升高而升高，以沙门氏菌浓度的对数为横坐标，阳性样品的灰度值减去空白对照样品的灰度值为纵坐标，绘制标准曲线：y＝1.771x 10.251，r2＝0.99376，对沙门氏菌检测的线性范围为102～107cfu/ml，检测限为13.2cfu/ml，从而可实现对沙门氏菌的定量检测。
[0095]
实施例4检测方法的选择性验证
[0096]
根据上述优化体系，配制菌液浓度均为105cfu/ml的沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌以及高温高压灭菌后的沙门氏菌溶液，测试所制备棉签的特异性。传感器对沙门氏菌的响应信号远大于其他致病菌，具有良好的特异性，且本实验仅对沙门氏菌活菌起到特异性检测效果。(图8)
[0097]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因
此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。