一种鉴定南阳黑猪品种的特异分子身份证及其应用

1.本发明属于猪品种鉴定领域，涉及南阳黑猪种质资源，特别是指一种鉴定南阳黑猪品种的特异分子身份证及其应用。


背景技术：

[0002][0003]
对地方品种的有效保护和合理开发，将有助于河南省养猪业的可持续发展和家畜资源多样性的丰富。特别是对地方猪品种的特异性遗传结构和表征的研究，将有助于根据品种遗传情况制定对每个品种的保护计划，促进对地方猪品种的具体保护。保存每个品种的独特变异、基因和特征对于维持生物多样性和适应未来环境变化极为重要。因此，利用生物信息技术鉴定河南地方猪品种独特的遗传特征是准确保护地方猪种质遗传资源的重要部分。
[0004]
南阳黑猪，主要分布于在南阳地区西部的内乡、淅川、镇平、邓州市一带曾普遍养殖，中心产区为内乡县的师岗、瓦亭，淅川县的厚坡、香花以及邓州市的张村等地。南阳黑猪特点浑身长满黑毛，大大的猪头，满脸褶皱，性格温顺，秕糠、麸皮、剩饭、烂菜等啥都吃，很好养，以肉质紧实，肉味鲜美著称。饲养范围波及整个南阳和商南、湖北等地，是河南省重要的生猪品种。2015年南阳黑猪入选“中国地理标志”，南阳黑猪具有了和南阳黄牛、信阳毛尖、涪陵榨菜等同样的身份，随着生物信息技术的逐渐完善，全基因组关联分析技术已广泛应用于解析畜禽基因组信息。在地方品种猪选择过程中，其基因组中留下了大量的选择印记，形成了独特的品种特征，使得在肉品质、抗病性和繁殖性能方面具有一定的优势，因此，保护地方猪品种可以极大地丰富河南省的遗传资源，保护地方猪的多样性，保留地方猪品种的优良基因。为了进一步准确鉴定南阳黑猪结合全基因组关联分析和选择信号作为一种鉴别地方猪品种特异性分子标记的研究策略，可以阐明地方猪种的遗传背景，同时定位受选择区域，促进畜禽中野阿德发展，为河南地方猪的鉴定和保护提供技术支撑。


技术实现要素：

[0005]
为实现上述目的，本发明提出一种鉴定南阳黑猪品种的特异分子身份证及其应用。
[0006]
本发明的技术方案是这样实现的：一种鉴定南阳黑猪品种的特异分子身份证，所述snp位点为南阳黑猪品种间等位基因频率较高的snp位点集合。
[0007]
进一步，所述snp位点位于猪参考基因组ensemblsscrofa 11.1版本。
[0008]
进一步，所述snp位点的集合包括cnc10010199、cnc10010544、cnc10010543、cnc10010542、cnc10010547、cnc10013108、cnc10013746、cnc10013844、cnc10013968、cnc10013970、cnc10014393、cnc10014425、cnc10020711、cnc10030907、cnc10030909、cnc10031532、cnc10031554、cnc10031731、cnc10031777、cnc10031778、cnc10032256、
cnc10032268、cnc10032663、cnc10040006、cnc10042293、cnc10042504、cnc10042521、cnc10051167、cnc10051960、cnc10052002、cnc10052067、cnc10060233、cnc10060234、cnc10060443、cnc10060560、cnc10063140、cnc10070127、cnc10070143、cnc10070170、cnc10071425、cnc10071434、cnc10071469、cnc10071481、cnc10071485、cnc10071484、cnc10071550、cnc10080294、cnc10080699、cnc10080999、cnc10081833、cnc10081992、cnc10082297、cnc10082394、cnc10090107、cnc10090690、cnc10100622、cnc10100950、cnc10101273、cnc10120872、cnc10130429、cnc10131081、cnc10131956、cnc10131957、cnc10131963、cnc10131996、cnc10132031、cnc10132077、cnc10132124、cnc10132139、cnc10140369、cnc10141484、cnc10150308、cnc10150397、cnc10151078、cnc10152528、cnc10170142和cnc10170555。
[0009]
进一步，所述cnc10010199位点的突变型为c/a、cnc10010544位点的突变型为a/g、cnc10010543位点的突变型为c/t、cnc10010542位点的突变型为c/t、cnc10010547位点的突变型为c/t、cnc10013108位点的突变型为a/c、cnc10013746位点的突变型为g/c、cnc10013844位点的突变型为c/a、cnc10013968位点的突变型为g/a、cnc10013970位点的突变型为a/g、cnc10014393位点的突变型为g/a、cnc10014425位点的突变型为g/a、cnc10020711位点的突变型为c/t、cnc10030907位点的突变型为c/t、cnc10030909位点的突变型为t/c、cnc10031532位点的突变型为c/t、cnc10031554位点的突变型为a/g、cnc10031731位点的突变型为g/c、cnc10031777位点的突变型为g/a、cnc10031778位点的突变型为t/a、cnc10032256位点的突变型为a/g、cnc10032268位点的突变型为t/c、cnc10032663位点的突变型为c/t、cnc10040006位点的突变型为t/c、cnc10042293位点的突变型为g/a、cnc10042504位点的突变型为c/t、cnc10042521位点的突变型为c/t、cnc10051167位点的突变型为g/a、cnc10051960位点的突变型为c/t、cnc10052002位点的突变型为a/g、cnc10052067位点的突变型为t/c、cnc10060233位点的突变型为g/a、cnc10060234位点的突变型为t/c、cnc10060443位点的突变型为c/t、cnc10060560位点的突变型为g/a、cnc10063140位点的突变型为c/t、cnc10070127位点的突变型为g/a、cnc10070143位点的突变型为g/a、cnc10070170位点的突变型为t/c、cnc10071425位点的突变型为a/c、cnc10071434位点的突变型为c/t、cnc10071469位点的突变型为a/g、cnc10071481位点的突变型为t/c、cnc10071485位点的突变型为c/a、cnc10071484位点的突变型为c/t、cnc10071550位点的突变型为t/c、cnc10080294位点的突变型为a/g、cnc10080699位点的突变型为g/t、cnc10080999位点的突变型为g/a、cnc10081833位点的突变型为c/t、cnc10081992位点的突变型为c/t、cnc10082297位点的突变型为t/c、cnc10082394位点的突变型为t/g、cnc10090107位点的突变型为g/a、cnc10090690位点的突变型为a/t、cnc10100622位点的突变型为g/t、cnc10100950位点的突变型为a/g、cnc10101273位点的突变型为a/c、cnc10120872位点的突变型为t/g、cnc10130429位点的突变型为t/c、cnc10131081位点的突变型为c/t、cnc10131956位点的突变型为a/g、cnc10131957位点的突变型为g/a、cnc10131963位点的突变型为g/t、cnc10131996位点的突变型为t/c、cnc10132031位点的突变型为t/g、cnc10132077位点的突变型为c/a、cnc10132124位点的突变型为t/c、cnc10132139位点的突变型为t/g、cnc10140369位点的突变型为t/c、cnc10141484位点的突变型为a/g、cnc10150308位点的突变型为t/c、
cnc10150397位点的突变型为a/g、cnc10151078位点的突变型为c/t、cnc10152528位点的突变型为g/a、cnc10152540位点的突变型为c/a、cnc10170142位点的突变型为a/c、cnc10170555位点的突变型为g/t。
[0010]
用于识别上述的特异分子身份证的基因芯片。
[0011]
上述的基因芯片在鉴定南阳黑猪品种中的应用。
[0012]
上述的应用，步骤为：（1）采集待测猪的组织样本，并提取基因组dna；（2）利用基因芯片对步骤（1）的基因组dna进行snp分型，获得待测猪的基因型数据；（3）利用plink软件将待检测猪的基因型数据与特异分子身份证上的snp位点的基因型进行合并，再进行主成分分析。
[0013]
所述步骤（1）中基因组dna在a260/280的光吸收比在1.8和2.0之间，浓度≥ 50纳克/微升。
[0014]
所述步骤（3）中snp分型的主成分分析的结果与南阳黑猪群体的遗传距离较近，且聚集为一簇时，即为南阳黑猪。
[0015]
本发明具有以下有益效果：1. 通过分子生物学技术在基因组水平筛选的品种特异性分子标记，能够揭示品种间存在的标志性遗传差异。基因型填充作为全基因组关联分析的重要部分，目的是预测研究样本中没有被分型的snp，增加可用于检测关联的snp数量，从而提高gwas的检测能力，以及全基因组关联分析和选择信号分析的组合策略，进一步提高了鉴定分子标记的效率和准确性，以达到相互验证的作用。本发明利用生物技术开展地方猪珍贵遗传资源特性的挖掘，有利于促进河南省地方猪遗传资源保护及创新利用，推进种业的高质量发展。
[0016]
2. 使用plink软件将待检测猪的基因型数据和南阳黑猪的基因型数据合并，并提取数据中的以上78个位点，之后进行主成分分析，当待检测猪个体与南阳黑猪群体的主成分1和主成分2通过r语言进行结果可视化，其聚集程度高，表示待检测猪个体和南阳黑猪的遗传距离近，此时可判定待检测猪为南阳黑猪。
附图说明
[0017]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]
图1为本发明提供的南阳黑猪的gwas分析结果的曼哈顿图和qq图。
[0019]
图2为本发明提供的南阳黑猪的选择信号分析结果的曼哈顿图。
[0020]
图3为本发明提供的南阳黑猪品种特异性分子身份证的主成分分析验证图。
具体实施方式
[0021]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，
本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
[0022]
一种筛选南阳黑猪品种的特异分子身份证的方法，步骤为：（1）耳样采集试验群体为1117头猪，共10个猪品种，包括7个中国猪品种：南阳黑猪（n=10，ny），淮南猪（n=10，hn），豫农黑猪（n=1036，yn），确山黑猪（n=10，qs），莱芜猪（n=10，lwh），二花脸猪（n=10，ehl），民猪（n=6，min）；西方商品猪种3个：杜洛克猪（n=10，du），大白猪（n=10，lw），长白猪（n=5，lr）。使用75%的酒精清洁猪只的耳朵，使用耳样钳剪取少量耳组织，放置在装有75%酒精的2ml离心管中，保存在-20℃冰箱。
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（2）总dna提取、质量检测及基因分型采用动物组织基因组dna提取试剂盒提取总dna；采用dyy-6c型电泳仪，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测；采用nanodrop-2000紫外分光光度计检测dna的浓度，保留光吸收比（a260/280）在1.8和2.0之间，浓度≥ 50纳克/微升的基因组dna样本，用于illumina porcine snp50 beadchip（北京康普森生物技术有限公司，中芯一号）进行全基因组芯片分型，具体操作为：a、利用tn5转座酶对样品猪建立基因文库，并进行50 k基因芯片扫描。
[0024]
b、对步骤（1）中的50 k芯片和全基因组重测序结果使用beagle进行基因型填充。
[0025]
c、对所有个体通过步骤b获得的基因型填充数据进行全基因组关联分析和选择信号分析。
[0026]
d、对步骤c获得的显著位点，进行品种间的等位基因频率计算，保留南阳黑猪等位基因频率较高的snp位点，该snp位点的集合，作为南阳黑猪品种特异性分子身份证。
[0027]
（3）基因型数据填充及质量控制经芯片测序共获得1,117头，51,315个snps。使用 plink软件对芯片数据进行质量控制。通过以下参数对基因型数据进行过滤：个体基因型检出率（
‑‑
mind）》90%，标记基因型（
‑‑
geno）检出率》95%，最小等位基因频率（
‑‑
maf）》1%，最小哈代温伯格平衡（
‑‑
hwe）为10-6，位于常染色体。采用隐马尔科夫模型（hidden markov model，hmm）算法，在 beagle软件中执行对缺失基因型的填充。
[0028]
（4）全基因组关联分析筛选snp特异位点采用gemma软件进行全基因组关联分析，试验组为10头南阳黑猪（case），对照组为其余9个品种（control）。其中南阳黑猪的曼哈顿图见图1左和qq图见图1右，曼哈顿图中有两条阈值线，其中实线的阈值为0.05/n（n为所使用的芯片位点个数），在实线上方的位点为全基因组显著水平，虚线的阈值为1/n，在虚线上方的位点为染色体显著水平，qq图中的λ值越接近1，表明全基因组关联分析的结果越可信；使用班费罗尼矫正方法鉴定与品种显著相关的snps，该显著snps的集合为a组。
[0029]
（5）选择信号分析筛选snp特异位点采用vcftools软件进行遗传分化指数（genetic differentiation index,fst）的计算，使用滑动窗口取均值的计算方法，结果见图2，图2中的阈值线为fst值经排序后较大
的前1%，在该阈值线以上的位点为显著位点（红色标记）。具体参数如下：滑动窗口的大小（
‑‑
fst-window-size）为100,000 bp，滑动窗口的步长（
‑‑
fst-window-step）为40,000 bp。将窗口按fst值从大到小排序，定义前1%的窗口为显著窗口，再利用plink软件提取显著窗口内的snps，该显著snps的集合为b组。
[0030]
（6）等位基因频率筛选snp特异位点利用plink软件合并a组和b组的显著snps，并计算每个snp在10个品种中的等位基因频率，筛选等位基因频率在试验组的分布较其他9个品种高的snp集合作为南阳黑猪品种的特异性分子身份证。
[0031]
表1南阳黑猪品种的特异性分子标记集合
（7）利用plink软件对10个品种的上述78个snps进行提取，进行主成分分析验证。
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（8）该78个snp位点在鉴定南阳黑猪品种中的应用，其特征在于，所述snp位点位于基因组版本ensemblsscrofa 11.1。
[0033]
应用例一种待测猪品种的鉴定方法，具体包括以下步骤：1. 提取待检猪的耳组织样本，提取组织样本的基因组dna，通过芯片对以上78个位点进行分型。基因组dna送至北京康普森生物技术有限公司，进行针对地方猪的“中芯一号”（axiom）芯片，进行snp分型。芯片进行snp分型的试验原理是基于连接反应，其中有两种探针发挥作用。第一种是芯片上的捕获探针，起到把目标dna片段固定到芯片表面的作用。第二种是显色探针，负责对snp芯片进行着色（红色和绿色荧光）。试验共进行两轮杂交。第一轮杂交，是目标dna与芯片进行杂交，捕获探针会抓取匹配的目标dna片段；显色探针在第二轮杂交中，杂交到dna片段上。然后利用连接酶的识别作用，只有与目标dna片段互补的显色探针才会被连接到捕获探针上。通过荧光标记的染色，在激光扫描下进行snp分型，得到待测猪的基因型数据。
[0034]
2. 使用plink软件将待检测猪的基因型数据和南阳黑猪的基因型数据合并，并提取数据中的以上78个位点，之后进行主成分分析，当待检测猪个体与南阳黑猪群体的遗传
距离近，此时可判定待检测猪为南阳黑猪。
[0035]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。