一种人用狂犬病疫苗中残留DNA的去除方法与流程

一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法
技术领域
1.本技术涉及狂犬病疫苗的技术领域，具体涉及一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法。


背景技术：

2.冻干人用狂犬病疫苗以其在生产工艺、经济效益和质量等方面的综合优势，占据了我国的大部分狂犬病疫苗市场。目前，人用狂犬病疫苗的生产需要经过vero细胞培养、病毒增殖、病毒收获和浓缩、病毒灭活以及纯化等过程。然而，在细胞培养和病毒增殖的过程中，会产生游离的宿主dna及与病毒蛋白结合的宿主dna。这些残留dna会随疫苗一起被注入到人体内，使得人体由于异源物质的注入引起不良反应。
3.相关技术中最广泛的dna去除方式有离子交换层析、硫酸鱼精蛋白沉淀、酶解三类方法。其中，离子交换层析方法利用dna带有大量的负电荷，可以被阴离子交换剂吸附，从而实现对残留dna的去除。但是利用上述方法去除人用狂犬病疫苗中的残留dna时，疫苗中的病毒和残留dna会一起被吸附在介质上，然后通过控制洗脱条件实现病毒和残留dna的先后洗脱，故残留dna的去除率较低。
4.采用硫酸鱼精蛋白去除dna时，带有大量正电荷的硫酸鱼精蛋白可以与带有大量负电荷的dna结合，产生的结合物容易形成沉淀，通过离心便能实现对dna的去除。然而，上述方法在去除残留dna的同时，硫酸鱼精蛋白还会结合病毒，使得病毒损失严重，从而导致疫苗药效降低。
5.当使用dna限制性内切酶去除dna时，酶切后的dna变成了小片段，然后利用凝胶过滤色谱将dna和病毒分离开。但是，一方面，该方法只能将大部分残留dna和病毒分离开，残留dna的去除效率较低。另一方面，dna限制性内切酶的活性作用容易受ph、温度等外界环境条件限制，故残留dna的去除成本较高。
6.因此，残留dna的去除成为人用狂犬病疫苗生产纯化的难题。


技术实现要素：

7.为了有效降低人用狂犬病疫苗中dna的残留量，同时保证病毒的回收率较高，本技术提供一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法。
8.本技术提供的一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，采用如下的技术方案：
9.一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，具体包括以下步骤：
10.(1)在病毒灭活液中加入dna去除液，搅拌处理，获得处理液；
11.(2)采用柱色谱的方法对步骤(1)所述处理液进行纯化，获得病毒纯化液；
12.(3)对步骤(2)所述病毒纯化液进行冻干，获得所述人用狂犬病疫苗。
13.其中，所述dna去除液包括溶质和溶剂；所述溶质包括乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种。
14.本技术提供的人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法中，以病毒灭活液作为人用
38份、38-40份、40-43份、43-45份。
31.经过试验分析可知，在人用狂犬病疫苗中残留dna的去除过程中，当控制dna去除液中各溶质的添加量为上述范围内时，所得到的疫苗成品中dna残留量进一步降低，病毒含量进一步提高。因此，本技术将dna去除液中各溶质的添加量控制在上述范围内，能够进一步提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率，同时保证病毒的回收率较高。
32.进一步地，所述溶剂选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸钠缓冲液。
33.优选地，所述溶剂是ph为7.6的磷酸盐缓冲液。
34.进一步地，所述步骤(1)中的病毒灭活液来源于无血清培养系统。
35.进一步地，所述无血清培养系统中的无血清培养基选自含4mm谷氨酰胺的opti-pro培养基或含4mm谷氨酰胺的vp培养基。
36.本技术中所用的病毒在vero细胞驯化和病毒培养阶段，采用无血清培养系统代替传统的含血清培养系统，可以避免血清中动物源性物质的潜在病毒危害，同时也可以解决血清供应不稳定带来的疫苗产品质量上的影响，在疫苗产品安全性和稳定性方面都有着明显的优势。
37.经过试验分析可知，本技术提供的人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，对于无血清培养系统和含血清培养系统得到的人用狂犬病疫苗中残留dna均具有明显的去除效果，且病毒的回收率较高。同时，无血清培养系统与含血清培养系统得到的人用狂犬病疫苗的病毒含量相近，即有效性相同，而无血清培养系统有利于提高疫苗产品安全性和稳定性。因此，本技术采用无血清培养系统制备病毒灭活液。
38.进一步地，所述步骤(1)中所述搅拌处理条件为：转速450-550rpm；温度2-8℃；时间12-20h。
39.进一步地，所述步骤(2)中所述柱色谱的方法为：先用阳离子交换色谱柱，再用sepharose 6ff分子筛，洗脱平衡液是ph为7.6的pbs缓冲液。
40.综上所述，本技术的技术方案具体以下效果：
41.本技术提供的人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，采用乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种作为dna去除液中的溶质，通过对病毒灭活液进行搅拌处理，之后采用柱色谱的方法进行纯化，能够有效提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率，同时使得病毒的回收率较高。
附图说明
42.图1为制备例32提供的vero细胞形貌图。
43.图2为制备例33提供的vero细胞形貌图。
44.图3为制备例34提供的vero细胞形貌图。
45.图4为制备例35提供的vero细胞形貌图。
46.图5为制备例36提供的vero细胞形貌图。
具体实施方式
47.本技术提供了一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，具体包括以下步骤：
48.(1)取病毒灭活液，按照体积比1:100加入dna去除液，搅拌处理，获得处理液；
49.(2)采用柱色谱的方法对步骤(1)中的处理液进行纯化；
50.(3)对步骤(2)中的病毒纯化液进行冻干，获得人用狂犬病疫苗。
51.其中，上述dna去除液包括溶质和溶剂。具体地，溶质包括乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种；溶剂是ph为7.6的磷酸盐缓冲液。进一步地，溶质包括乳酸薄荷酯、茶氨酸和甘露醇。
52.其中，dna去除液中溶质的浓度为8-12g/l。进一步地，dna去除液中溶质的浓度为9-11g/l。
53.具体地，溶质包含以下重量份的组分：乳酸薄荷酯0.5-1.5份；茶氨酸1.5-5.5份；甘露醇35-45份。进一步地，溶质包含以下重量份的组分：乳酸薄荷酯0.8-1.3份；茶氨酸2.5-4.5份；甘露醇38-43份。
54.另外，步骤(1)中的病毒灭活液来源于无血清培养系统。具体地，无血清培养系统中的无血清培养基选自含4mm谷氨酰胺的opti-pro培养基或含4mm谷氨酰胺的vp培养基。
55.具体地，步骤(1)中搅拌处理条件为：转速450-550rpm；温度2-8℃；时间12-20h。
56.具体地，步骤(2)中柱色谱的方法为：先用阳离子交换色谱柱，再用sepharose 6ff分子筛，洗脱平衡液是ph为7.6的pbs缓冲液，收集纯化液的检测紫外光波长为280nm，收集范围从50mv开始收集，吸光值回到50mv时结束收集，获得病毒纯化液。
57.进一步地，步骤(3)中的具体步骤如下：
58.①
冻干稀释液的制备：将麦芽糖20g/l、海藻糖40g/l、山梨醇20g/l、精氨酸2g/l溶解于pbs溶液后，用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤；
59.②
人用狂犬病疫苗半成品配制：将步骤(2)中的病毒纯化液与冻干稀释液按1：4的体积比混合，人用狂犬病疫苗原液蛋白质含量为16μg/ml，抗原含量不低于1：8；
60.③
人用狂犬病疫苗成品冻干制备：将半成品分装到西林瓶中后，用christ冻干机冻干。冻干方法为：将半成品快速降温至-40℃进行预冻，在此温度下维持5h后，在-10℃退火，退火时间为15min。退火后，再将温度降低至-40℃，在此温度下维持5h后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-25℃，16h之后升温至27℃维持7h，即得去除残留dna的人用狂犬病疫苗成品。
61.以下结合制备例1-41、实施例1-31、对比例1-10和性能检测试验对本技术作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本技术所要求保护的范围。
62.制备例
63.制备例1-7
64.制备例1-7分别提供了一种dna去除液。该dna去除液包括溶剂和溶质，溶剂是ph为7.6的磷酸盐缓冲液，溶质为乳酸薄荷酯、茶氨酸、甘露醇。
65.上述各制备例的不同之处在于：dna去除液中溶质的浓度，具体如表1所示。
66.上述各制备例的制备方法如下：
67.称取乳酸薄荷酯1.1g、茶氨酸3.5g、甘露醇40g充分混匀制成共混物，按照表1中共混物的添加量，将共混物充分溶解于100ml、ph为7.6的磷酸盐缓冲液，制得相应浓度的dna去除液。
68.表1制备例1-7中dna去除液中溶质的浓度
[0069][0070]
制备例8-13
[0071]
制备例8-13分别提供了一种dna去除液。
[0072]
上述各制备例与制备例4的不同之处在于：溶质中乳酸薄荷酯的添加量，具体如表2所示。
[0073]
表2制备例4、8-13中乳酸薄荷酯的添加量
[0074][0075]
制备例14-19
[0076]
制备例14-19分别提供了一种dna去除液。
[0077]
上述各制备例与制备例4的不同之处在于：溶质中茶氨酸的添加量，具体如表3所示。
[0078]
表3制备例4、14-19中溶质中茶氨酸的添加量
[0079][0080]
制备例20-25
[0081]
制备例20-25分别提供了一种dna去除液。
[0082]
上述各制备例与制备例4的不同之处在于：溶质中甘露醇的添加量，具体如表4所示。
[0083]
表4制备例4、20-25中溶质中甘露醇的添加量
[0084][0085]
制备例26-31
[0086]
制备例26-31分别提供了一种dna去除液。
[0087]
上述各制备例与制备例4的不同之处在于：dna去除液中溶质的种类，具体如表5所示。
[0088]
表5制备例4、26-31中dna去除液中溶质的种类
[0089][0090]
制备例32
[0091]
本制备例提供了一种无血清培养系统培养的vero细胞。
[0092]
本制备例培养的vero细胞是通过直接驯化得到的。具体包括以下步骤：
[0093]
(1)将冻存的vero细胞复苏，vero细胞复苏的具体步骤如下：
[0094]
①
取4ml含10％胎牛血清的mem培养基加入到无菌细胞培养瓶中，备用；
[0095]
②
将vero细胞冻存管从液氮保存罐中取出，放入pe手套中，迅速投入37℃水浴锅中，用力摇晃冻存管，使其在1min内融化，用75％酒精擦拭冻存管外部，获得融化后的vero细胞悬液；
[0096]
③
将融化后的vero细胞悬液移入步骤
①
中备用的无菌细胞培养瓶中，置于37℃的co2培养箱中培养4h，让细胞贴壁；
[0097]
④
细胞贴壁后，弃去含有冷冻保护剂的培养基，加入5ml含10％胎牛血清的mem培养基继续培养；
[0098]
⑤
细胞培养24h后，更换新鲜培养基，继续培养直到细胞形成单层，便获得复苏的vero细胞。
[0099]
(2)将复苏的vero细胞置于含10％胎牛血清的mem培养基中，待细胞长满单层后，用0.125％重组胰酶溶液(含0.04％edta-2na)消化细胞，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1：6进行消化传代培养。
[0100]
(3)将步骤(2)的vero细胞直接置于含4mm谷氨酰胺的opti-pro无血清培养基中，待细胞长满单层后，用0.125％重组胰酶溶液(含0.04％edta-2na)消化细胞，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1：6进行消化传代培养。
[0101]
(4)按照步骤(3)连续传代，如此经过5代可得到适应无血清培养系统的vero细胞。
[0102]
制备例33
[0103]
本制备例提供了一种无血清培养系统培养的vero细胞。
[0104]
本制备例与制备例32的不同之处在于：步骤(3)中的培养基为含4mm谷氨酰胺的vp无血清培养基。其余操作步骤均与制备例32相同。
[0105]
制备例34
[0106]
本制备例提供了一种含血清培养系统培养的vero细胞。
[0107]
本制备例与制备例32的不同之处在于：步骤(3)中的培养基为含10％胎牛血清的mem培养基。其余操作步骤均与制备例32相同。
[0108]
制备例35
[0109]
本制备例提供了一种无血清培养系统培养的vero细胞。
[0110]
本制备例培养的vero细胞是通过逐步驯化得到的。具体包括以下步骤：
[0111]
(1)将冻存的vero细胞复苏，vero细胞复苏的具体步骤如下：
[0112]
①
取4ml含10％胎牛血清的mem培养基加入到无菌细胞培养瓶中，备用；
[0113]
②
将vero细胞冻存管从液氮保存罐中取出，放入pe手套中，迅速投入37℃水浴锅中，用力摇晃冻存管，使其在1min内融化，用75％酒精擦拭冻存管外部，获得融化后的vero细胞悬液；
[0114]
③
将融化后的vero细胞悬液移入步骤
①
中备用的无菌细胞培养瓶中，置于37℃的co2培养箱中培养4h，让细胞贴壁；
[0115]
④
细胞贴壁后，弃去含有冷冻保护剂的培养基，加入5ml含10％胎牛血清的mem培养基继续培养；
[0116]
⑤
细胞培养24h后，更换新鲜培养基，继续培养直到细胞形成单层，便获得复苏的vero细胞。
[0117]
(2)将复苏的vero细胞置于含10％胎牛血清的mem培养基中，待细胞长满单层后，用0.125％重组胰酶溶液(含0.04％edta-2na)消化细胞，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1：6进行消化传代培养。
[0118]
(3)将步骤(2)得到的细胞置于混合液中培养，混合液为含10％胎牛血清的mem培养基与含4mm谷氨酰胺的opti-pro无血清培养基按3：1比例混合，待细胞长满单层后，用0.125％重组胰酶溶液(含0.04％edta-2na)消化细胞，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1：6进行消化传代培养。
[0119]
(4)将步骤(3)得到的细胞置于混合液中培养，混合液为含10％胎牛血清的mem培养基与含4mm谷氨酰胺的opti-pro无血清培养基按1：1比例混合，待细胞长满单层后，用0.125％重组胰酶溶液(含0.04％edta-2na)消化细胞，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1：6进行消化传代培养。
[0120]
(5)将步骤(4)得到的细胞置于混合液中培养，混合液为含10％胎牛血清的培养基与含4mm谷氨酰胺的opti-pro无血清培养基按1：3比例混合，待细胞长满单层后，用0.125％重组胰酶溶液(含0.04％edta-2na)消化细胞，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1：6进行消化传代培养。
[0121]
(6)步骤(5)得到的细胞置于含4mm谷氨酰胺的opti-pro无血清培养基中培养。
[0122]
(7)如上所述，经过5代可得到适应无血清培养系统的vero细胞。
[0123]
制备例36
[0124]
本制备例提供了一种无血清培养系统培养的vero细胞。
[0125]
本制备例与制备例35的不同之处在于：步骤(3)-(6)中无血清培养基为含4mm谷氨酰胺的vp无血清培养基。其余操作步骤均与制备例35相同。
[0126]
制备例37-41
[0127]
制备例37-41分别提供了一种人用狂犬病毒灭活液。
[0128]
上述各制备例的不同之处在于：vero细胞的类型，具体见表6。
[0129]
表6制备例37-41中vero细胞的来源
[0130][0131]
上述各制备例的制备方法如下：
[0132]
(1)细胞的反应器培养：将vero细胞于细胞工厂内扩增，传代比例为1：6。30l生物反应罐，按照20g/l接种微载体，上罐细胞密度为1.0
×
106/ml。调整参数，ph为7.4，温度为37
±
0.5℃，灌流培养7天。
[0133]
(2)病毒接种：当反应罐内细胞密度达到1.0
×
107/ml时，将反应罐温度降至33℃，取工作种子按0.002moi接种病毒，并吸附3h后进行灌流。
[0134]
(3)病毒收获：病毒接种后48h开始收获病毒液，连续收获12天。
[0135]
(4)病毒浓缩：经0.65μm滤膜澄清，并用截留分子量为300kd滤膜超滤浓缩25倍，制得病毒浓缩液。
[0136]
(5)病毒灭活：收获的病毒液按体积比为1：4000加入质量百分数为0.1％的β-丙内酯，在转速为500rpm、温度为6℃的条件下搅拌灭活24h，然后于37℃水解2h，获得病毒灭活液。
[0137]
实施例1-27
[0138]
实施例1-27分别提供了一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法。
[0139]
实施例1-27提供的去除方法中步骤(1)所用病毒灭活液为制备例37制备的病毒灭活液。
[0140]
上述各实施例的不同之处在于：dna去除液的类型。具体如表7所示。
[0141]
上述人用病狂犬疫苗中残留dna的去除方法，具体包括如下步骤：
[0142]
(1)取制备例37制备的病毒灭活液，按照体积比1：100加入dna去除液，在转速为500rpm、温度为6℃的条件下搅拌处理16h，获得处理液；
[0143]
(2)采用柱色谱的方法对步骤(1)的处理液进行纯化，具体方法为：先用阳离子交换色谱柱，再用sepharose 6ff分子筛，洗脱平衡液是ph为7.6的pbs缓冲液，收集纯化液的检测紫外光波长为280nm，收集范围从50mv开始收集，吸光值回到50mv时结束收集，获得病毒纯化液；
[0144]
(3)对步骤(2)中的病毒纯化液进行冻干，制备人用狂犬病疫苗，具体步骤如下：
[0145]
①
冻干稀释液的制备：将麦芽糖20g/l、海藻糖40g/l、山梨醇20g/l、精氨酸2g/l溶解于pbs溶液后，用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤；
[0146]
②
人用狂犬病疫苗半成品配制：将步骤(2)中的病毒纯化液与冻干稀释液按1：4的体积比混合，人用狂犬病疫苗原液蛋白质含量为16μg/ml，抗原含量不低于1：8；
[0147]
③
人用狂犬病疫苗成品冻干制备：将半成品分装到西林瓶中后，用christ冻干机
冻干。冻干方法为：将半成品快速降温至-40℃进行预冻，在此温度下维持5h后，在-10℃退火，退火时间为15min。退火后，再将温度降低至-40℃，在此温度下维持5h后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-25℃，16h之后升温至27℃维持7h，即得去除残留dna后的人用狂犬病疫苗成品。
[0148]
表7实施例1-27中dna去除液的类型
[0149][0150]
实施例28-31
[0151]
实施例28-31分别提供了一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法。
[0152]
上述各实施例与实施例4的不同之处在于：步骤(1)中病毒灭活液的类型。具体如表8所示。
[0153]
表8实施例28-31中病毒灭活液的类型
[0154][0155]
对比例
[0156]
对比例1-4
[0157]
对比例1-4分别提供了一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法。
[0158]
对比例1-4与实施例4的不同之处在于：dna去除液的类型。具体如表9所示。
[0159]
表9对比例1-4中dna去除液的类型
[0160]
对比例dna去除液的类型对比例dna去除液的类型1制备例283制备例302制备例294制备例31
[0161]
对比例5
[0162]
对比例5提供了一种人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法。
[0163]
本对比例与实施例4的不同之处在于：步骤(1)不同，其余步骤均相同。
[0164]
本对比例中步骤(1)具体为取制备例37制得的病毒灭活液，按体积比为1：100加入质量百分数为0.1％的β-丙内酯，在转速为500rpm、温度为6℃的条件下搅拌灭活24h，然后于37℃水解2h，获得处理液。
[0165]
对比例6-10
[0166]
对比例6-10分别提供了一种人用狂犬病疫苗。
[0167]
上述各对比例与实施例4的不同之处在于：人用狂犬病疫苗制备方法中病毒灭活液的类型。具体如表10所示。
[0168]
上述人用狂犬病疫苗的制备方法为将病毒灭活液进行冻干，制备人用狂犬病疫苗。具体包括如下步骤：
[0169]
(1)冻干稀释液的制备：将麦芽糖20g/l、海藻糖40g/l、山梨醇20g/l、精氨酸2g/l溶解于pbs溶液后，用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤。
[0170]
(2)人用狂犬病疫苗半成品配制：将病毒灭活液与冻干稀释液按1：4的体积比混合，人用狂犬病疫苗原液蛋白质含量为16μg/ml，抗原含量不低于1：8。
[0171]
(3)人用狂犬病疫苗成品冻干制备：将半成品分装到西林瓶中后，用christ冻干机冻干。冻干方法为：将半成品快速降温至-40℃进行预冻，在此温度下维持5h后，在-10℃退火，退火时间为15min。退火后，再将温度降低至-40℃，在此温度下维持5h后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-25℃，16h之后升温至27℃维持7h，即得去除残留dna后的人用狂犬病疫苗成品。
[0172]
表10对比例6-10中病毒灭活液的类型
[0173][0174]
性能检测试验
[0175]
一、vero细胞的形貌观察
[0176]
以制备例32-36提供的vero细胞为检测对象，将vero细胞置于显微镜下对细胞形貌进行观察。
[0177]
检测结果如下：
[0178]
图1为制备例32提供的vero细胞形貌图。
[0179]
图2为制备例33提供的vero细胞形貌图。
[0180]
图3为制备例34提供的vero细胞形貌图。
[0181]
图4为制备例35提供的vero细胞形貌图。
[0182]
图5为制备例36提供的vero细胞形貌图。
[0183]
通过对图1-5进行观察可知，制备例32-35提供的vero细胞均呈现梭形，且细胞的汇合率均大于90％，表明本技术使用无血清培养基与含血清培养基驯化得到的vero细胞的形态和汇合率均符合vero细胞驯化的生长状态，可以用于制备人用狂犬病疫苗。
[0184]
同时，由于无血清培养系统能够避免血清中动物源性物质的潜在病毒危害，同时也可以解决血清供应不稳定带来的产品质量上的影响，在疫苗产品安全性和稳定性方面都有着明显的优势，因此，本技术采用无血清培养基驯化的vero细胞用于研究人用狂犬病疫苗中残留dna的去除效果。
[0185]
二、人用狂犬病疫苗中dna残留量和病毒含量的检测
[0186]
以实施例1-31、对比例1-10中提供的去除残留dna后的人用狂犬病疫苗为检测对象，检测疫苗中的dna残留量和病毒含量。
[0187]
检测方法如下：
[0188]
根据《中华人民共和国药典》2020版三部附录规定的pcr法检测人用狂犬病疫苗中的dna残留量；根据《中华人民共和国药典》2020版三部附录规定的酶联elisa法检测人用狂犬病疫苗中的病毒含量。
[0189]
检测结果如表11所示。
[0190]
表11人用狂犬病疫苗中的dna残留量和病毒含量
[0191]
[0192]
[0193][0194]
结合表10，通过对比实施例1-31与对比例1-10的检测结果可知，本技术提供的人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，采用乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种作为溶质溶于磷酸盐缓冲溶液后作为dna去除液，之后采用柱色谱的方法进行纯化并冻干，制备得到的人用狂犬病疫苗中dna残留量较低，病毒含量较高。因此，本技术提供的人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，能够有效去除人用狂犬病疫苗中的残留dna，同时保证病毒的回收率较高。
[0195]
通过对比实施例1-27与对比例5的检测结果可知，相比于在病毒灭活液中加入β-丙内酯来去除人用狂犬病疫苗中的残留dna，选择使用乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种作为dna去除液中的溶质，用于去除人用狂犬病疫苗中的残留dna，能够有效提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率。因此，本技术采用乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种作为dna去除液中的溶质，用于人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法中。
[0196]
通过对比实施例4、26-27与对比例1-4的检测结果可知，相比于单独使用茶氨酸、单独使用甘露醇、单独使用乳酸薄荷酯或者使用茶氨酸和甘露醇作为dna去除液中的溶质，选择使用乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种作为dna去除液中的溶质，用于人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法中，能够有效提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率。因此，本技术采用乳酸薄荷酯以及茶氨酸和甘露醇中的一种或两种作为dna去除液中的溶质。
[0197]
通过对比实施例4、26-27的检测结果可知，相比于使用茶氨酸和乳酸薄荷酯或者使用甘露醇和乳酸薄荷酯作为dna去除液中的溶质，同时使用乳酸薄荷酯、茶氨酸、甘露醇作为dna去除液中的溶质，用于人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法中，能够进一步提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率。因此，本技术采用乳酸薄荷酯、茶氨酸、甘露醇一起作为dna去除液中的溶质。
[0198]
通过对比实施例1-7的检测结果可知，在人用狂犬病疫苗中残留dna的去除过程中，当dna去除液中溶质的浓度为8-12g/l时，能够有效提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率，同时提高病毒的回收率。因此，将dna去除液中溶质的浓度控制在上述范围内。进一步
地，将dna去除液中溶质的浓度控制在9-11g/l。
[0199]
通过对比实施例4、8-13的检测结果可知，在人用狂犬病疫苗中残留dna的去除过程中，当溶质中乳酸薄荷酯的添加量为0.5-1.5份时，能够有效提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率，同时提高病毒的回收率。因此，将溶质中乳酸薄荷酯的添加量控制在上述范围内。进一步地，将溶质中乳酸薄荷酯的添加量控制在0.8-1.3份。
[0200]
通过对比实施例4、14-19的检测结果可知，在人用狂犬病疫苗中残留dna的去除过程中，当溶质中茶氨酸的添加量为1.5-5.5份时，能够有效提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率，同时提高病毒的回收率。因此，将溶质中茶氨酸的添加量控制在上述范围内。进一步地，将溶质中茶氨酸的添加量控制在2.5-4.5份。
[0201]
通过对比实施例4、20-25的检测结果可知，在人用狂犬病疫苗中残留dna的去除过程中，当溶质中甘露醇的添加量为35-45份时，能够有效提高人用狂犬病疫苗中残留dna的去除率，同时提高病毒的回收率。因此，将溶质中甘露醇的添加量控制在上述范围内。进一步地，将溶质中甘露醇的添加量控制在38-43份。
[0202]
通过对比实施例4、实施例28-31与对比例6-10的检测结果可知，无血清培养系统与含血清培养系统得到的人用狂犬病疫苗的病毒含量相近，即有效性相同。在有效性相同的情况下，无血清培养系统能够避免血清中动物源性物质的潜在病毒危害，同时也可以解决血清供应不稳定带来的产品质量上的影响，在疫苗产品安全性和稳定性方面都有着明显的优势。同时，本技术提供的人用狂犬病疫苗中残留dna的去除方法，对于无血清培养系统和含血清培养系统得到的人用狂犬病疫苗中残留dna均具有明显的去除效果，且病毒的回收率较高。因此，本技术采用无血清培养系统制备病毒灭活液。
[0203]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。