冷冻保存的昆虫及其生产方法与流程

技术特征：
1.一种冷冻保存黑水虻(hermetia illucens)胚胎的方法，包括：a.从至少一部分黑水虻(bsf)胚胎表面除去绒毛膜层，其中所述bsf胚胎处于bolwig器官样发育开始与中肠胃盲肠外翻结束之间的发育阶段，从而获得具有至少一部分暴露的蜡质层的bsf胚胎表面；b.通过将所述暴露的蜡质层与通透化组合物接触将所述层通透化，从而获得至少一部分蜡质层被通透化的胚胎，所述通透化组合物包含选自环萜烯和/或包含它们的精油；有机溶剂；表面活性剂及其任何组合的通透化化合物；c.向所述至少一部分蜡质层被通透化的胚胎装载至少一种冷冻保护剂(cpa)，从而获得装载有所述至少一种cpa的胚胎；和d.将所述装载有至少一种cpa的胚胎暴露于低温；从而获得冷冻保存的存活胚胎。2.权利要求1所述的方法，其中所述通透化组合物包含通透化化合物的组合。3.权利要求2所述的方法，其中所述通透化化合物的组合包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与至少一种有机溶剂。4.权利要求3所述的方法，其中所述有机溶剂选自基于生物质的有机溶剂和基于石油的有机溶剂。5.权利要求4所述的方法，其中所述基于生物质的有机溶剂选自2-甲基四氢呋喃(2-methf)、环戊基甲基醚(cpme)、二甲醚、碳酸二甲酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯及其任何组合。6.权利要求5所述的方法，其中所述基于生物质的有机溶剂是2-methf。7.权利要求6所述的方法，其中所述通透化组合物包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与2-methf的组合。8.权利要求7所述的方法，其中所述通透化组合物由至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与2-methf的组合组成。9.权利要求8所述的方法，其中在所述通透化组合物的总体积中，所述至少一种环萜烯或包含它们的精油的浓度为约70％至约95％v/v，并且所述2-methf的浓度为约5％至约30％v/v。10.权利要求4所述的方法，其中所述基于石油的有机溶剂是烷烃。11.权利要求10所述的方法，其中所述烷烃选自庚烷、己烷、辛烷及其任何组合。12.权利要求2所述的方法，其中所述通透化化合物的组合包含至少一种环萜烯和/或包含它们的精油与至少一种表面活性剂。13.权利要求12所述的方法，其中所述表面活性剂选自烷基聚(环氧乙烷)、椰油酰胺二乙醇胺(dea)、乙氧基化醇、乙氧基化椰子醇、醇乙氧基化物(c
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)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物、烷基多糖苷、脂肪醇、椰油酰胺单乙醇胺(mea)、聚山梨醇酯、乙氧基化脂肪醇醚和月桂基醚、乙氧基化烷基酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、改性的氧乙基化和/或氧丙基化直链醇、聚乙二醇单油酸酯化合物、聚山梨醇酯化合物、酚类脂肪醇醚及其任何组合。14.权利要求3-13中的任一项所述的方法，其中所述至少一种环萜烯选自柠檬烯、蒎烯、大麻衍生的环萜烯、桉油精、香芹酮、蒎烯、芳樟醇、石竹烯及其任何组合。
15.权利要求14所述的方法，其中所述至少一种环萜烯是柠檬烯。16.权利要求1所述的方法，其中所述通透化组合物包含单一通透化化合物。17.权利要求16所述的方法，其中所述单一通透化化合物选自有机溶剂与环萜烯和/或包含它们的精油。18.权利要求17所述的方法，其中所述有机溶剂是选自己烷、庚烷和辛烷的烷烃。19.权利要求17所述的方法，其中所述环萜烯选自柠檬烯、蒎烯、大麻衍生的环萜烯、桉油精、香芹酮、蒎烯、芳樟醇和石竹烯。20.权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括所述冷冻保存的胚胎的复活，所述复活包括下述步骤：a.将所述冷冻保存的胚胎转移到复活溶液；b.将所述胚胎在所述复活溶液中在约20℃至约35℃的温度下温育；任选地c.更换所述复活溶液至少一次；和d.将所述复活的胚胎在适合于获得幼虫的孵化条件下温育。21.权利要求20所述的方法，其中所述复活方法还包括在步骤(a)之前将所述冷冻保存的胚胎暴露于-70℃至-150℃范围内的温度。22.权利要求20-21中的任一项所述的方法，其中所述孵化条件包括在约25℃至约30℃和60-90％湿度下温育。23.权利要求20-22中的任一项所述的方法，其中所述复活方法还包括将所述孵化的幼虫在适合于获得蛹化和随后成蝇的羽化的生长条件下温育。24.权利要求1-23中的任一项所述的方法，其中从至少一部分胚胎表面除去绒毛膜层包括将所述胚胎与次氯酸钠(naclo)溶液接触。25.权利要求1-24中的任一项所述的方法，其中向所述至少一部分蜡质层被通透化的胚胎装载至少一种冷冻保护剂(cpa)包括将所述胚胎在包含所述至少一种cpa的溶液中温育至少一个温育期。26.权利要求25所述的方法，其中将所述胚胎与包含所述至少一种cpa的溶液温育四个连续的温育期。27.权利要求1-26中的任一项所述的方法，其中所述cpa是能够穿透至少一部分胚胎细胞的膜的化合物。28.权利要求27所述的方法，其中所述cpa选自乙二醇、甘油、dmso(二甲基亚砜)、丙二醇、乙酰胺及其任何组合。29.权利要求27-28中的任一项所述的方法，其中所述包含至少一种cpa的溶液还包含至少一种不能穿透至少一部分胚胎细胞的膜的化合物，其选自海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇(peg)及其任何组合。30.权利要求1-29中的任一项所述的方法，其中将所述装载有至少一种cpa的胚胎暴露于低温包括将所述胚胎暴露于统一的低温。31.权利要求30所述的方法，其中将所述胚胎暴露于统一的温度包括将所述胚胎置于预冷的水平表面上。32.权利要求31所述的方法，其中将所述胚胎暴露于统一的温度包括将所述胚胎放置在具有适合的冻结温度的预冷液体中。
33.权利要求32所述的方法，其中所述预冷液体选自乙醇、异丙醇、硅油、乙烷及其任何组合。34.权利要求31-33所述的方法，其中将所述胚胎置于预冷的水平表面上的预冷液体中。35.权利要求31-34中的任一项所述的方法，其中所述预冷的水平表面和/或液体的温度在-70℃至-150℃的范围内。36.权利要求1-30中的任一项所述的方法，其中将所述装载有至少一种cpa的胚胎暴露于低温包括将所述胚胎暴露于-196℃的温度。37.权利要求36所述的方法，所述方法包括将所胚胎置于液氮中。38.权利要求36-37中的任一项所述的方法，所述方法还包括在将所述胚胎暴露于-196℃的温度之前，将所述胚胎放置在-110℃至-135℃范围内的温度下。39.权利要求20-38中的任一项所述的方法，所述方法包括冷冻保存和复活多个bsf胚胎。40.权利要求39所述的方法，其中达到成蝇形式的复活的胚胎的数目为从相应的多个未冷冻保存的bsf胚胎获得的成蝇形式的数目的至少1％。41.权利要求40的方法，其中所述达到成蝇形式的复活的胚胎的数目为从相应的多个未冷冻保存的bsf胚胎获得的成蝇形式的数目的至少10％。42.权利要求40-41中的任一项所述的方法，其中至少95％的成蝇是能生育的。43.权利要求39所述的方法，其中从所述复活的胚胎孵化的幼虫数目为从相应的未冷冻保存的bsf胚胎群体孵化的幼虫数目的至少50％。44.多个冷冻保存的bsf胚胎，其特征在于孵化的幼虫数目为从相应的未冷冻保存的bsf胚胎群体孵化的幼虫数目的至少50％。45.多个冷冻保存的bsf胚胎，其特征在于达到成蝇形式的孵化的幼虫的数目为从相应的多个未冷冻保存的bsf胚胎孵化的幼虫的成蝇形式的数目的至少1％。46.权利要求45所述的多个冷冻保存的bsf胚胎，其中达到成蝇形式的孵化的幼虫的数目为从相应的多个未冷冻保存的bsf胚胎孵化的幼虫的成蝇形式的数目的至少10％。47.权利要求45-46中的任一项所述的多个冷冻保存的bsf胚胎，其中至少95％的成蝇是能生育的。48.一种制备冷冻保存用bsf胚胎的试剂盒，所述试剂盒包含：包含次氯酸钠的组合物；通透化组合物；至少一种冷冻保护剂(cpa)；任选的复活组合物；和任选的使用所述试剂盒组分冷冻保存bsf胚胎的说明书。49.权利要求48所述的试剂盒，其中所述通透化组合物包含选自环萜烯和/或包含它们的精油、有机溶剂、表面活性剂及其任何组合的至少一种通透化化合物。50.权利要求48-50中的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含清洗溶液。

技术总结
本发明提供了用于冷冻保存包含绒毛膜层和蜡质层的昆虫胚胎的方法，特别是可用于大规模饲养有益蝇成虫的包括黑水虻(Hermetiaillucens，BSF)胚胎在内的蝇胚胎。本发明还提供了具有工业上适合的成虫恢复率和存活率的冷冻保存的胚胎。存活率的冷冻保存的胚胎。


技术研发人员：Y
受保护的技术使用者：耶达研究及发展有限公司
技术研发日：2020.12.10
技术公布日：2022/9/13