鉴别草地贪夜蛾品系的方法和验证方法

1.本发明涉及农业生物技术领域，尤其是涉及一种鉴别草地贪夜蛾品系的方法和验证方法。


背景技术：

2.草地贪夜蛾主要分为水稻型(rice strain)和玉米型(corn strain)两种生物型，水稻型主要取食水稻、苜蓿、牧草等作物，玉米型主要取食玉米、高粱和棉花。它们两者在形态上无法区分，性信息素组分相同，甚至可以杂交产生可育后代。目前，线粒体的细胞色素c氧化酶亚基i基因(cytochrome c oxidase subunit i,coi)以及位于z染色体上的磷酸甘油醛异构酶基因(triose-phosphate isomerase,tpi)是鉴定草地贪夜蛾不同生物型最常用也是最成熟的分子标记基因。
3.传统的利用线粒体coi基因(mtcoi基因)鉴定草地贪夜蛾水稻型和玉米型的方法不仅费时费力，而且费用较高，不利于草地贪夜蛾大规模的快速鉴定。另外，针对室内草地贪夜蛾生物型种群的建立以及长期饲养过程中的种群纯度检测等问题，亟需一种快速直观的鉴别方法。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种鉴别草地贪夜蛾品系的方法，该方法简单方便，能够快速直观的实现对草地贪夜蛾品系的鉴别，以解决上述问题中的至少一种。
6.本发明的第二目的在于提供一种验证方法。
7.第一方面，本发明提供了一种鉴别草地贪夜蛾品系的方法，根据草地贪夜蛾卵块的颜色鉴别草地贪夜蛾品系；
8.所述草地贪夜蛾品系包括水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾；
9.水稻型草地贪夜蛾卵块的颜色为褐色，玉米型草地贪夜蛾卵块的颜色为绿色。
10.作为进一步技术方案，所述水稻型草地贪夜蛾卵块的颜色为灰褐色。
11.作为进一步技术方案，所述玉米型草地贪夜蛾卵块的颜色为青绿色。
12.作为进一步技术方案，所述卵块为产后2天以内的卵块。
13.作为进一步技术方案，所述水稻型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.1所示。
14.作为进一步技术方案，所述玉米型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.2所示。
15.第二方面，本发明提供了一种验证方法，所述验证方法用于验证鉴别草地贪夜蛾品系方法的准确性，包括以下步骤：
16.获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列，根据mtcoi基因的序列验证鉴别草地贪夜蛾品系方法的准确性；
17.所述水稻型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.1所示；
18.所述玉米型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.2所示。
19.作为进一步技术方案，所述获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列的方法包括基因测序。
20.作为进一步技术方案，所述获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列的步骤包括：提取待测草地贪夜蛾的dna，然后对mtcoi基因进行扩增，再对扩增产物进行测序，获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列。
21.作为进一步技术方案，用于扩增草地贪夜蛾mtcoi基因的引物的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.发明人通过mtcoi基因在室内成功筛选和建立水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾种群，经研究发现，以上两个品系的卵颜色具有非常大的差别，即水稻型卵块颜色为褐色，玉米型卵块颜色为绿色，根据卵块颜色能够快速直观的实现对水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾的鉴别。本发明提供的鉴别草地贪夜蛾品系的方法，简单方便，不仅省时省力，还能节约实验成本，大大提高种群建立的效率。
24.本发明提供的验证方法，能够有效验证本发明上述鉴别草地贪夜蛾品系方法的准确性。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为琼脂糖电泳结果；
27.图2为水稻型和玉米型草地贪夜蛾线粒体coi基因序列的差异图；
28.图3为水稻型和玉米型草地贪夜蛾卵块颜色图；
29.图4为实施例2提供的草地贪夜蛾卵块；
30.图5为实施例2提供的草地贪夜蛾卵块的序列差异；
31.图6为实施例3提供的草地贪夜蛾卵块；
32.图7为实施例3提供的草地贪夜蛾卵块的序列差异。
具体实施方式
33.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
34.第一方面，本发明提供了一种鉴别草地贪夜蛾品系的方法，根据草地贪夜蛾卵块
的颜色鉴别草地贪夜蛾品系；
35.所述草地贪夜蛾品系包括水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾；
36.水稻型草地贪夜蛾卵块的颜色为褐色，玉米型草地贪夜蛾卵块的颜色为绿色。
37.发明人通过mtcoi基因在室内成功筛选和建立水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾种群，经研究发现，以上两个品系的卵颜色具有非常大的差别，即水稻型卵块颜色为褐色，玉米型卵块颜色为绿色，根据卵块颜色能够快速直观的实现对水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾的鉴别。本发明提供的鉴别草地贪夜蛾品系的方法，简单方便，不仅省时省力，还能节约实验成本，大大提高种群建立的效率。
38.在一些优选的实施方式中，所述水稻型草地贪夜蛾卵块的颜色为灰褐色。
39.经发明人研究发现，水稻型草地贪夜蛾卵块的颜色集中表现为灰褐色。
40.在一些优选的实施方式中，所述玉米型草地贪夜蛾卵块的颜色为青绿色。
41.经发明人研究发现，玉米型草地贪夜蛾卵块的颜色集中表现为青绿色。
42.在一些优选的实施方式中，所述卵块为产后2天以内的卵块。
43.草地贪夜蛾通常在产卵后第三天孵化为幼虫，因此，需要在孵化前进行鉴别。
44.在一些优选的实施方式中，所述水稻型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.1所示。
45.tttataatactattgtaacagcccatgcttttattataattttttttatagttataccaattataattggaggatttggaaattgacttgtacctttaatattaggagctcctgatatagctttcccacgtataaataatataagtttttgacttttacccccatctttaactttattaatttctagtagcattgtagaaaatggagcaggaactggatgaacagtttacccccccctctcctctaatattgctcatggtggtagttcagtagatttagctattttctcacttcatttagctggaatttcatctattttaggagctattaactttattaccactattattaatatacgattaaataatttatcatttgatcaaatacctttatttatttgagctgtaggtattaccgcatttttattattattatctttacctgttttagctggagctattactatattacttactgatcgaaatctaaatacatcatttttcgatcctgcaggaggaggtgatcctattctttatcaacatttattttgattttttggacatcctgaagtatatattttaattttaccgggatttggtataatttctcacattatttctcaagaaagaggtaaaaaggaaacatttggatgtttaggtataatttatgctatattagcaattggtttattaggatttattgtttgagctcatcatatatttactgtaggaatagatattgatacacgagca(seq id no.1)。
46.在一些优选的实施方式中，所述玉米型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.2所示。
47.tttataatactattgtaacagctcatgcttttattataattttttttatagttatacctattataattggaggatttggaaattgacttgtacctttaatattaggagcccctgatatagctttcccacgtataaataatataagtttttgacttttacccccatctttaactttattaatttctagtagcattgtagaaaatggagcaggaactggatgaacagtttacccccccctctcctctaatattgctcatggtggtagttcagtagatttagctattttctcacttcatttagctggaatttcatctattttaggagctattaactttattactactattattaatatacgattaaataatttatcatttgatcaaatacctttatttatttgagctgtaggtattactgcattcttattattattatctttacctgttttagccggagctattactatattacttactgatcgaaatttaaatacatcatttttcgatcctgcaggtggaggtgatcctattctttatcaacatttattttgattttttggacatcctgaagtatatattttaattttaccaggatttggtataatttctcatattatttcccaagaaagaggtaaaaaggaaacattcgggtgtttaggtataatttacgctatactagcaattggtttattaggatttattgtttgagctcatcatatatttactgtaggaatagatattgatacacgagca
(seq id no.2)。
48.发明人通过对水稻型和玉米型mtcoi序列(1-752bp)分析发现，水稻型在105-111bp处序列为gagctc，玉米型在对应位置中的序列为gagccc。经进一步研究发现，草地贪夜蛾水稻型和玉米型品系的卵块颜色具有非常大的差别，并且卵块的颜色具有可遗传性，与水稻型和玉米型一一对应。
49.第二方面，本发明提供了一种验证方法，所述验证方法用于验证鉴别草地贪夜蛾品系方法的准确性，包括以下步骤：
50.获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列，根据mtcoi基因的序列验证鉴别草地贪夜蛾品系方法的准确性；
51.所述水稻型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.1所示；
52.所述玉米型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列如seq id no.2所示。
53.本发明提供的验证方法根据水稻型草地贪夜蛾和玉米型草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列准确实现对二者的区分，将验证结果与鉴别结果相比较，进而验证本发明鉴别方法的准确性。
54.在一些优选的实施方式中，所述获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列的方法包括基因测序。
55.在一些优选的实施方式中，所述获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列的步骤包括：提取待测草地贪夜蛾的dna，然后对mtcoi基因进行扩增，再对扩增产物进行测序，获得待测草地贪夜蛾的mtcoi基因的序列。
56.在一些优选的实施方式中，用于扩增草地贪夜蛾mtcoi基因的引物的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
57.上游引物coi-f：5
’‑
ttcgagctgaattagggactc-3’(seq id no.3)；
58.下游引物hap-r：5
’‑
gatgtaaaatatgctcgtgt-3’(seq id no.4)。
59.该引物特异性强，能够特异性实现对mtcoi基因的扩增。
60.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
61.实施例1
62.首先，我们于海南省三亚市采集大量草地贪夜蛾3-5龄幼虫，带回实验室饲养，待其羽化成虫后，雌雄单对继续饲养于塑料杯中，共设置50个重复。待其产卵后，通过mtcoi基因检测亲本和后代(随机挑选几粒卵)的生物型，将检测为同一生物型的重复混合在一起，建立水稻型(rice)和玉米型(corn)品系种群。
63.具体鉴定草地贪夜蛾线粒体水稻型和玉米型的方法如下：
64.用于mtcoi基因扩增的引物，上游引物核酸序列如seq id no.3所示，下游引物核酸序列如seq id no.4所示。
65.上游引物coi-f：5
’‑
ttcgagctgaattagggactc-3’(seq id no.3)；
66.下游引物hap-r：5
’‑
gatgtaaaatatgctcgtgt-3’(seq id no.4)。
67.步骤如下：
68.(1)提取地贪夜蛾基因组dna，制得基因组dna溶液；
69.(2)以步骤(1)制得的基因组dna为模板，利用上述的引物对基因组dna中的线粒体
coi基因进行pcr扩增，制得pcr扩增产物；
70.(3)将pcr扩增产物直接双向测序。
71.其中，步骤(2)中pcr扩增的扩增体系为：
72.基因组dna溶液1μl，10μm正反向引物各1μl，金牌mix(北京擎科新业生物技术有限公司)22μl；
73.步骤(2)中pcr扩增的扩增条件如下：
74.94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸5分钟。pcr扩增结束后，使用1％琼脂糖电泳检测扩增结果(图1)，选取与目标片段长度一致的单一片段pcr产物送生工生物工程(上海)股份有限公司切胶测序。
75.(4)通过对水稻型和玉米型mtcoi序列(1-752bp)分析发现，水稻型在105-111bp处序列为gagctc，玉米型在对应位置中的序列为gagccc，如图2所示。
76.进一步研究发现，草地贪夜蛾水稻型和玉米型品系的卵块颜色具有非常大的差别，并且卵块的颜色具有可遗传性，与水稻型和玉米型一一对应(图3)。基于此提出了根据卵块颜色区分两个品型的技术方案。
77.实施例2
78.我们于广西省南宁市采集草地贪夜蛾，带回实验室饲养，待其产卵后(图4)，根据卵块颜色初步鉴定1-10号为水稻型，11-20号为玉米型品系。
79.对上述鉴定结果进行验证：参照实施例1中鉴定草地贪夜蛾线粒体水稻型和玉米型的方法和步骤，对两种生物型进行了验证，根据水稻型与玉米型105-111bp处的序列差异(图5)，获得1-20号草地贪夜蛾虫卵的品型。结果显示，采用本发明提供的鉴别方法的鉴定结果与线粒体coi基因的鉴定结果一致，表明本发明提供的鉴别方法能够用来进行鉴别草地贪夜蛾的两个生物型。
80.实施例3
81.我们于云南省江城县采集草地贪夜蛾，带回实验室饲养，待其产卵后(图6)，根据卵块颜色初步鉴定1-6号为水稻型，7-12为玉米型品系。
82.对上述鉴定结果进行验证：参照实施例1中鉴定草地贪夜蛾线粒体水稻型和玉米型的方法和步骤，对两种生物型进行了验证，根据水稻型与玉米型105-111bp处的序列差异，获得1-12号草地贪夜蛾虫卵的品型(图7)。结果显示，采用本发明提供的鉴别方法的鉴定结果与线粒体coi基因的鉴定结果一致，表明本发明提供的鉴别方法能够用来进行鉴别草地贪夜蛾的两个生物型。
83.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。