包含荧光团标记的uPAR靶向肽缀合物的组合物的制作方法

包含荧光团标记的upar靶向肽缀合物的组合物
技术领域
1.本发明涉及一种组合物，其包含荧光团标记的受体靶向组分，优选地荧光团标记的受体靶向肽缀合物，更优选地荧光团标记的upar(尿激酶型纤溶酶原激活剂受体)靶向肽缀合物。


背景技术：

2.现有的组合物包含一种或多种荧光团标记的受体靶向肽缀合物，其中受体为upar。例如，在wo2016/041558中公开了结合到细胞表面受体upa(upar)的缀合物。缀合物基于可用作表达upar的细胞表面的诊断探针的荧光标记肽。缀合物能够携带合适的可检测和可成像标记，该标记将允许定性检测并且还允许在体外和体内对upar水平进行定量。这更优化肿瘤的手术切除。此外，在wo2016/041558中描述了缀合物的不同替代方案，例如包含icg-glu-glu-ae105的缀合物，其中icg是吲哚菁绿，glu-glu是充当接头的两个谷氨酸，并且ae105是upar靶向肽。
3.本发明涉及提供一种制剂，其包含荧光团标记的upar靶向肽缀合物，例如icg-glu-glu-ae105或其他替代形式。根据本发明的制剂提供了荧光团标记的upar靶向肽缀合物的改善的溶解度，以及整个制剂和其中所包含的荧光团标记的upar靶向肽缀合物的增加的稳定性。


技术实现要素：

4.上文后者所述的目的通过一种组合物来实现，该组合物包含荧光团标记的受体靶向组分、缓冲液和表面活性剂，其中荧光团标记的受体靶向组分通过存在的表面活性剂在组合物中增溶，并且其中组合物包含最多10重量％的水，优选地最多5重量％的水。如从上文应当理解的，本发明具体地讲涉及一种组合物，其包含荧光团标记的受体靶向肽缀合物，更具体地讲，荧光团标记的upar靶向肽缀合物，诸如与以下文献的表4所示的肽具有80％的序列同一性的肽缀合物：
″
peptide-derived antagonists of the urokinase receptor.affinity maturation by combinatorial chemistry，identification of functional epitopes，and inhibitory effect on cancer cell intravasation
″
，in biochemstry 2001，40，12157-12168，michael ploug等人。然而，应当注意，在具有受体靶向组分的情况下，这可包括小分子、蛋白质、抗体、frab或当然肽，或其任何类型的组合。
5.根据本发明的组合物表现出若干优点。最重要的两点是对荧光团标记的受体靶向肽缀合物的完全增溶和整个组合物的高稳定性。稳定性主要由缺乏水的存在来驱动。例如，作为根据本发明的一种目标产物类型的冻干产物是其中存在低水含量的一个示例。然而，为了具有适当的制剂，还应具有良好的冻干饼外观的产物，该产物可容易地增溶，因此荧光团标记的受体靶向肽缀合物的增溶是非常重要的。此外，应注意，呈不同的制剂形式的根据本发明的组合物可具有远低于5重量％，例如在1重量％-3重量％的范围内的水含量。在这方面，还应注意，水含量也可在例如3年的架藏寿命期间增加。
6.如上所述，根据本发明的组合物还包含缓冲液和表面活性剂。表面活性剂是确保将荧光团标记的受体靶向肽缀合物增溶在组合物中的组分。不同类型的表面活性剂以及它们的组合可掺入根据本发明的组合物中。
7.此外，根据本发明，缓冲液组分也可具有不同类型。下面提供一些可能的示例。
具体实施方式
8.下面进一步解释和处理本发明的不同方面。此外，还进一步描述了本发明的一些具体实施方案。
9.可在根据本发明的组合物中以不同方式看到或指示在组合物中增溶的荧光团标记的受体靶向组分的特征。一种此类指示是在观察根据本发明的组合物的吸收光谱时。这在示例中进一步说明。此外，根据本发明的一个具体实施方案，荧光团标记的受体靶向组分以对应于当测量组合物在700nm-825nm的波长区域中吸收光谱时具有约800nm的最大吸收的单个峰的含量在组合物中增溶。应当注意，根据本发明的组合物的吸收光谱不排除多于一个峰的区域，诸如双峰，然而，这方面的重要特征是吸收最大值为约800nm的一个主要峰中的高水平面积。为了对这方面给予进一步澄清，可以说具有明显双峰的吸收光谱是在组合物中不存在完全或基本上完全增溶的荧光团标记的受体靶向组分的指示，并且此类组合物不是本发明范围的一部分。
10.此外，根据本发明的一个具体实施方案，荧光团标记的受体靶向组分以对应于具有最大约800nm的吸收光谱峰的含量在该组合物中增溶，并且其中在600nm-900nm的给定波长区域中，所述吸收光谱峰的面积为吸收光谱总面积的至少50％、优选地至少60％、甚至更优选地至少65％。
11.这种单峰和总面积的比较面积值可通过将面积分成多个正方形来计算，并且确定在600nm-900nm的波长范围内的auc(曲线下面积)。然后在中间绘制一条线，即在750nm处。然后分别计算在750nm处的线左侧和右侧的auc。然后，将指示约800nm的单峰的右侧auc除以根据上文所述计算的总auc。如上所述，根据一个实施方案，该约800nm的单峰占600nm-900nm波长范围内的总面积的至少50％、优选地至少60％、并且更优选地高于65％。
12.本发明适当地还包含其他组分。例如，冻干保护剂是此类组分。冻干保护剂是可以与小分子、肽或蛋白质组合的分子，然后显著防止或减少在干燥时，具体地讲在冻干和后续储存期间小分子、肽或蛋白质的化学和/或物理不稳定性。冻干保护剂的一些示例包括糖，例如蔗糖或海藻糖、氨基酸，例如谷氨酸一钠、组氨酸或精氨酸；甲基胺，例如甜菜碱；溶致性盐，例如硫酸镁。其他示例包括多元醇，例如三元或高级糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。还有一些其他示例为乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；普郎尼克(pluronics)；或羟烷基淀粉，例如羟乙基淀粉(hes)。另外，组合当然也是完全可能的。根据本发明的一个具体实施方案，组合物包含冻干保护剂，优选地，选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸或它们的组合的冻干保护剂、更优选地甘露醇或甘露醇与一种或多种其他组分的组合、更优选地甘露醇和甘氨酸的组合或甘露醇和蔗糖的组合。在示例中进一步呈现了根据本发明的这些优选替代方案中的一些替代方案。
13.此外，在此上下文中，还可以说其通常适用于使用足够的糖来提供等渗制剂以避免注射位点反应(刺痛)。
14.如上所述，根据本发明的组合物包含表面活性剂。根据本发明，许多不同形式的表面活性剂都可能使用。在对根据本发明的可能替代方案没有任何限制的情况下，以下示例可被提及。根据本发明的一个实施方案，组合物包含非离子表面活性剂。一个示例为乙氧基化物，诸如脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物(ape)、脂肪酸乙氧基化物、乙氧基化脂肪酯和油，或乙氧基化胺或脂肪酸胺。另一种类型是脂肪酸酯，例如多羟基化合物的脂肪酸酯，诸如甘油、山梨糖醇、蔗糖或烷基多葡萄糖苷的脂肪酸酯。其他示例是不同类型的氧化胺、泊洛沙姆、亚砜或氧化膦。
15.此外，吐温(tween)表面活性剂的不同形式是根据本发明的感兴趣的一个具体示例。例如，可使用吐温20，其用于示例中呈现的替代方案。吐温80和其他聚山梨醇酯也可能完全代替使用。此外，羟基-β-环糊精是另一种可能的示例。当然还可以使用组合。
16.应注意，根据本发明，许多表面活性剂替代方案也是可能的，还可以为离子表面活性剂。此外，根据本发明，表面活性剂等的不同浓度水平也是完全可能的，并且当然不仅仅是示例中呈现的水平。
17.包含在根据本发明的组合物中的另一种组分是至少一种缓冲液/缓冲剂。在这种情况下，许多替代方案也是完全可能的。非限制性示例是不同形式的硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐，如pbs。此外，甘氨酸和tris和配制的tris溶液也是完全可能的替代方案。此外，又一些其他更具体的示例是咪唑、琥珀酸制剂。另外，二甘氨酸制剂是可能的，例如，bis-tris或n，n-双(2-羟乙基)甘氨酸。还有其他具体示例是磺酸制剂，诸如2-(n-吗啉基)乙磺酸或4-吗啉乙磺酸、n，n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸、4-(2-羟基-乙基)哌嗪-1-乙磺酸、n-(2-羟基乙基)哌嗪-n
′‑
(2-乙磺酸)。
18.根据本发明的一个通用实施方案，提供缓冲液，使得组合物具有生理ph或基本上生理ph。如示例中所示，根据本发明，可使用例如磷酸钠以设置约7.4的ph。
19.另外，根据本发明，荧光团也可变化。首先，根据一个实施方案，荧光团标记的受体靶向组分包括荧光团、与受体结合的肽和接头基团，其中荧光团、与受体结合的肽和接头基团通过共价键连接。例如，接头基团可包括低聚乙二醇或其他短低聚物，诸如低聚甘油、低聚乳酸或任选地通过共价键连接到至少一个氨基酸的碳水化合物。
20.参考荧光团替代方案，根据本发明，许多此类荧光团是可能的。根据本发明的一个实施方案，荧光团优选地选自吲哚菁绿(icg)、亚甲蓝、5-ala、原卟啉ix、irdye800cw、zw800-1、cy5、cy7、cy5.5、cy7.5、irdye700dx、alexa fluor 488、异硫氰酸荧光素、flav7、ch1055、q1、q4、h1、ir-fep、ir-bbep、ir-e1、ir-fgp或ir-ftap中的任一种，优选地其中所述荧光团为吲哚菁绿(icg)。
21.此外，所涉及的肽也可具有不同类型。根据一个具体实施方案，肽可选自以下中任一者：
[0022]-asp-cha-phe-(d)ser-(d)arg-tyr-leu-trp-ser(-)；
[0023]-asp-cha-phe-(d)ser-(d)arg-tyr-leu-trp-ser-oh；或
[0024]-asp-cha-phe-(d)ser-(d)arg-tyr-leu-trp-ser-nh2。
[0025]
此外，氨基酸可选自蛋白原氨基酸和非蛋白原氨基酸，其包括天然氨基酸和合成氨基酸。关于此，还可能提及天然氨基酸可包括：c-α烷基化氨基酸，诸如氨基异丁酸(aib)；n-烷基化氨基酸，诸如肌氨酸；以及天然存在的β-氨基酸，诸如β-丙氨酸。此外，合成氨基酸
可包括具有非蛋白原侧链的氨基酸，诸如环己基丙氨酸(cha)、γ氨基酸和二肽模拟物。术语
″
二肽模拟物
″
可被解释为通过显示两个氨基酸侧链来模拟二肽的有机分子，例如具有将两个残基连接在一起的还原酰胺键。具有非蛋白原侧链的氨基酸也可包括具有chi-空间中的受限运动的侧链的氨基酸。术语
″
chi空间中的受限运动
″
可被解释为侧链基团的旋转灵活性受限。低聚肽可由最多五十个氨基酸组成，并且可包括二肽、三肽、四肽和五肽，并且还可由蛋白原氨基酸和非蛋白原氨基酸构成。
[0026]
关于本发明，应注意，当包含肽时，不仅ae105是合适的。许多其他物质，例如以下文献表4中所公开的那些也是可能的：
″
peptide-derived antagonists of the urokinase receptor.affinity maturation by combinatorial chemistry，identification of functional epitopes，and inhibitory effect on cancer cell intravasation
″
，biochemstry 2001，40，12157-12168，michael ploug等人。因此，根据本发明的一个具体实施方案，肽选自：ae101、ae105、ae106、ae110、ae112、ae113、ae116、ae133、ae133*、ae134、ae135、ae136、ae137、ae138、ae139、ae145、ae140、ae141、ae142、ae143、ae144、ae164、ae164*、ae120、ae120*或ae151，其中适用以下内容：ae101为d-cha-f-s-r-y-l-w-s，ae105为d-cha-f-s-r-y-l-w-s，ae106为d-cha-f-s-r-y-l-w-s，ae110为d-cha-f-s-r-y-l-w-s，ae112为d-f-f-s-r-y-l-w-s，ae113为d-n-f-s-r-y-l-w-s，ae116为d-cha-f-s-r-g-y-l-w-s，ae 133为kgsgg-d-cha-f-s-r-y-l-w-s，ae133*为kgsgg-d-cha-f-s-r-y-l-w-s，ae134为kgsgg-d-cha-f-s-r-y-l-w-a，ae135为kgsgg-d-cha-f-s-r-y-l-a-s，ae136为kgsgg-d-cha-f-s-r-y-a-w-s，ae137为kgsgg-d-cha-f-s-r-a-l-w-s，ae138为kgsgg-d-cha-f-s-a-y-l-w-s，ae139为kgsgg-d-cha-f-a-r-y-l-w-s，ae145为kgsgg-d-cha-f-a-r-y-l-w-s，ae140为kgsgg-d-cha-a-s-r-y-l-w-s，ae141为kgsgg-d-a-f-s-r-y-l-w-s，ae142为kgsgg-a-cha-f-s-r-y-l-w-s，ae143为kgsgg-d-chp-f-s-r-y-l-w-sc，ae144为kgsgg-d-cpa-f-s-r-y-l-w-sc，ae164为kgsgg-d-f-f-s-r-y-l-w-s，ae164*为kgsgg-d-f-f-s-r-y-l-w-s，ae120为[d-cha-f-s-r-y-l-w-s]2-/3a-kc，ae120*为[d-cha-f-s-r-y-l-w-s]2-/3a-kc并且ael51为[r-w-d-cha-s-l-s-f-y]2-/3a-kc，或它们的组合，或与这些肽中任一者具有至少80％序列同一性的肽。根据一个优选的实施方案，所选的肽是ae105。
[0027]
此外，
″
接头基团
″
是连接两个部分以产生缀合物并且其中在较大程度上保持其各自功能的分子，例如其中肽与受体结合并且荧光团点亮。接头将两者(肽和荧光团)连接在一起，其中它们期望的特性完全或部分地保留。这意指例如肽仍然与受体结合，并且荧光团保留其特性。接头可至少部分地是所连接的两个分子中任一者的部分。根据一个实施方案，接头是glu-glu。
[0028]
根据本发明的一个优选的实施方案，受体为upar(尿激酶型纤溶酶原激活剂受体)。此外，根据又一优选实施方案，荧光团标记的受体靶向组分为icg-glu-glu-ae105：
[0029][0030]
或其药学上可接受的盐。
[0031]
根据一个实施方案，icg-glu-glu-ae105的浓度在0.1mg/ml-10.0mg/ml的范围内，例如在0.1mg/ml-8.0mg/ml的范围内，例如在0.1mg/ml-5.0mg/ml的范围内，诸如在0.2mg/ml-3.0mg/ml的范围内，优选地在0.5mg/ml-2.0mg/ml范围内。
[0032]
与上述一致，根据本发明的一个具体实施方案，荧光团标记的受体靶向组分是icg-glu-glu-ae105：
[0033][0034]
或其药学上可接受的盐，
[0035]
其中icg-glu-glu-ae105的浓度在0.1mg/ml-10.0mg/ml的范围内，
[0036]
其中组合物还包含浓度为5mm-50mm的呈磷酸钠形式的缓冲液，
[0037]
并且其中组合物包含浓度为10mg/ml-50mg/ml的甘露醇和浓度为1mg/ml-30mg/ml的甘氨酸的冷冻保护剂组合。
[0038]
此外，合适地，根据本发明的组合物包含至少一种聚山梨醇酯，优选地聚山梨醇酯20，更优选地，浓度＞0.01重量％的聚山梨醇酯20。
[0039]
本发明还提供了对包含荧光团标记的受体靶向组分的组合物的感兴趣的其他方面。一个此类观点是药代动力学特征。与这一点一致，根据本发明的一个具体实施方案，荧光团标记的受体靶向组分包含：
[0040]-与受体结合的分子，优选地upar；以及
[0041]-接头基团，该接头基团将荧光团共价连接到与受体结合的分子，并且其中缀合物适于全身施用到人体或动物体中。
[0042]
此外，根据一个实施方案，荧光团标记的受体靶向组分具有药代动力学特征，其中在施用后3.5小时内达到至少2.5的tbr(肿瘤与背景比)，并且其中至少2.5的tbr水平被保持至少30分钟然后再次减小，并且其中所述荧光团标记的受体靶向组分为人upar靶向缀合
物。
[0043]
此外，根据又一实施方案，荧光团标记的受体靶向组分具有药代动力学特征，其中在施用后3.5小时内达到至少2.5的tbr(肿瘤与背景比)，并且其中至少2.5的tbr水平被保持至少30分钟然后再次减小，优选地其中所述荧光团标记的受体靶向组分为人upar靶向缀合物。
[0044]
此外，根据又一实施方案，荧光团标记的受体靶向组分具有药代动力学特征，其中血浆半衰期为最大75小时、优选地最大20小时、更优选地最大15小时、更优选地在6小时-15小时的范围内、最优选地在6小时-10小时的范围内。
[0045]
参考上文和下文的一些表达，可以提及的是，
″
血液
″
和
″
血浆
″
有时同义地使用，然而，严格来讲，血浆是血液中的淡黄色液体成分，其通常将全血中的血细胞保持在悬浮状态。血浆是血液的液体部分，其将细胞和蛋白质携带到全身。
[0046]
同样，在这方面，根据本发明，靶受体可具有不同类型。靶向受体可以为尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(upar)、组织因子(tf)、表皮生长因子受体(egfr)、前列腺特异性膜抗原(psma)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、叶酸受体、基质金属蛋白酶-2(mmp-2)、膜型-i型mmp、金属蛋白酶-2的跨膜抑制剂(timp2)、clc-3氯化物离子通道、二糖和其他聚糖或糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定的细胞膜受体。此外，受体类型可在细胞表面上具有蛋白水解活性或其他酶活性，例如尿激酶(upa)。此外，受体在人类癌症中如此表达，例如，与不良预后、局部侵袭性或转移相关。关于这一点，可进一步提及，根据本发明的缀合物产物主要/部分地锚定到表达特定受体的细胞的外部，即与缀合产物被内化到表达受体的细胞中相反。
[0047]
关于受体，还可以提及，当说到受体(upar)在癌细胞上表达时，这还可能意味着它们在
″
正常
″
基质细胞的主体上表达，该基质细胞受到它们所接触的或极其靠近的(例如，两者间2-5个细胞)癌细胞的影响。对于
″
正常
″
细胞帮助癌细胞入侵正常组织的情况也是如此。为了清楚起见，如此紧密靠近的
″
正常
″
基质细胞也作为癌细胞被包括。这在引用中是正常的，因为在癌细胞影响下并且表达upar的细胞可不再被称为正常。
[0048]
如上所述，根据本发明的受体靶向缀合物，合适地upar靶向缀合物，也可具有最佳受体结合特征和药代动力学特征。全身注射的upar靶向缀合物将通过循环系统分配到身体中的血液灌注的组织和器官中。对于具有血液灌注的组织，upar靶向缀合物将积累。当此类组织暴露于波长(颜色)被upar靶向缀合物中所含有的荧光团吸收的光时，荧光团将发射光。根据一阶动力学，upar靶向缀合物(下式中的
″
l
″
)与受体(下式中的
″r″
)结合：并且反应的特征在于结合速率(k
on
)、解离速率(koff)和所得的平衡结合常数kd(kd＝koff/kon)。优选地，k
on
＞1
×
103m-1
s-1
和/或k
off
＜1
×
10-1
s-1
，更优选地k
on
≥7.3
×
105m-1 s-1
，如下文进一步提及的。
[0049]
产物缀合物将经由血液来分配，从血液中其将经由通过肝脏和/或肾的排泄消除，或通过重新分配到除血液之外的隔室。其使得存在表达靶向受体的细胞的组织比背景更能点亮，从而产生所谓的
″
tbr
″
(肿瘤与背景比)，upar靶向缀合物与靶向受体结合。使用产生特定波长光的光源使缀合物产物点亮，然后使用用于特定发射光的特定滤光器检测从荧光团发射的光。在认为理想的情况下，癌细胞将在注射后立即点亮，具有足够高的相对光强度，但没有任何背景光，并且所产生的至少2.5的期望tbr将持续若干小时。在实际情况中，如果2.5的期望tbr在注射后3.5小时内达到并且持续至少30分钟，则其是可接受的。关于这
方面和其他方面的进一步解释在下文相对于本发明给出。
[0050]
与上述一致，根据本发明的一个实施方案，荧光团标记的受体靶向组分具有药代动力学特征，其中在施用后3.5小时内达到至少2.8的tbr(肿瘤与背景比)，并且其中至少2.8的tbr水平被保持至少30分钟然后再次减小。
[0051]
此外，根据又一实施方案，在施用后荧光团标记的受体靶向组分的峰值tbr为至少3。
[0052]
根据本发明的该实施方案的缀合物产物表现出若干特征，包括与其药代动力学和受体结合亲和力相关的一些特征。受体靶向的缀合物提供血浆半衰期和受体结合亲和力的特定组合。
[0053]
与上述一致，根据本发明的一个具体实施方案，蛋白质(p)-配体(l)复合物发生的速度可被定义为：
[0054][0055]
其中k
on
是结合反应常数，并且其中k
off
为蛋白质-配体复合物的解离常数，并且其中
[0056]kon
＞1
×
103m-1
s-1
和/或k
off
＜1
×
10-1
s-1
，更优选地其中
[0057]kon
≥7.3
×
105m-1 s-1
。
[0058]
此外，根据又一实施方案，荧光团标记的受体靶向组分的k
on
等于或高于为天然配体的upa的k
on
，从而意味着k
on
≥4.6
×
106m-1 s-1
。
[0059]
此外，根据本发明的又一具体实施方案，定义为ic
50
的受体结合亲和力是配体/受体结合亲和力的量度。根据一个实施方案，荧光团标记的受体靶向组分置换结合到upar的天然配体(upa)，其中ic
50
值为最大1,000nm、优选地最大200nm、更优选地最大50nm、最优选地最大25nm。此外，根据本发明的又一实施方案，被定义为kd的荧光团标记的受体靶向组分与upar的受体结合亲和力为最大2,500nm、优选地最大2,000nm、更优选地最大500nm、最优选地在2,000nm-300nm的范围内。
[0060]
下面，进一步解释了与本发明的这一方面相关的若干重要方面和特征。缀合物组合物应以足够高的剂量全身施用，以允许在体内充分分布从而到达癌细胞上存在的靶向特异性受体。这确保缀合物与靶受体迅速结合是有用的，其使得tbr与短血浆半衰期的组合快速形成并持续足够长时间。简而言之，高受体结合亲和力与在短血浆半衰期的组合形成了快速、高且持久的tbr。
[0061]
可由来自肿瘤和背景的光的相对强度来计算tbr。光强度的测量可以例如使用具有物理滤光器的简单的可商购获得的相机来执行，例如但不限于临床批准的nir-相机系统800(fluoptics，grenoble，france)或elevision
tm
(medtronic，usa)。使用软件对图像进行的后图像记录优化可被应用于增强tbr。
[0062]
高浓度将推动平衡朝向更多缀合物与靶受体结合。然而，浓度不应太高，因为这增加了对患者的毒性效应的风险，并且增加了超出了实际上可接受的施用的成本。根据本发明，施用可以全身进行，优选地静脉内施用，使得血浆浓度快速达到其最高浓度。在缀合物产物被代谢、排泄(通过肝脏)、消除(通过肾脏)和/或分配到不同于血液的分配隔室时，血
浆浓度将降低。根据本发明，浓度应足够高并且保持足够长的时间段，以使缀合物产物在与靶向受体(例如血浆、组织、胃、脑脊液、尿液)相关的隔室内达到足够高且足够持久的浓度，以供缀合物产物结合到受体。根据本发明的一个具体实施方案，给药在每剂量单位0.1mg-2,000mg的范围内，优选地在每人类剂量单位1mg-1,000mg的范围内进行。
[0063]
此外，另一个重要特征是对靶受体的结合亲和力，包括开始和解离，如上文所论述。这将以可能最高的相对光强度、可能最高的对比度可能最快地标记靶肿瘤细胞并持续可能最长的时间。快速开始结合和缓慢解离是优选的。关于上述内容，可能提及，tbr是体内测量的特征，并且通过若干其他特征(如血浆半衰期)的组合产生，但是其中受体结合亲和力是一个重要的特征。
[0064]
此外，针对癌症组织的选择性也是与本发明相关的关注领域。根据本发明的一个具体实施方案，受体靶向缀合物对癌症组织具有至少60％、优选地高于70％、更优选地高于80％并且最优选地高于90％的选择性。因此，缀合物产物的特征在于对癌症组织具有优选至少60％或70％或80％或90％的选择性。选择性被理解为外科医生所去除的组织样本的相对数目，外科医生基于其光强度/对比度相信这些组织样本是癌症，并且此后确认确实是癌症。一个示例是外科医生去除了10个自己相信是癌症的组织样本，其中七个样本经组织学确认是癌症，从而得到7/10的选择性，即70％。如果外科医生相信所去除的组织样本全部是癌症并且经证明是癌症，则选择性为100％。如果外科医生所去除的组织样本中仅一半是癌症而另一半是正常组织，则选择性为50％。
[0065]
与上述方面相关的一个其他方面是排泄和消除的位置。根据本发明的不同缀合物类型在不同器官中排泄和/或消除，并且因此不适用于位于这些器官中的癌症类型。此外，根据本发明，指示和靶受体的类型也是重要的。在此优选受体需要在患者具有的癌症上表达以对操作者(例如，外科医生)具有最大有益效果。此外，特别感兴趣的是受体在癌症的右侧表达。这是感兴趣的，因为通常癌症的中期很容易被外科医生看到和去除。然而，癌症的边界和局部侵入性产物更难以被外科医生看见和从正常组织分离，因此对外科医生而言更难的是去除和/或保留正常组织。
[0066]
理想地，当外科医生进行去除癌症的外科规程时，包括当外科医生通过研究去除的癌症组织并通过研究在已经去除癌症组织之后是否在患者体内留下任何癌细胞来研究外科规程的完整性，研究去除的组织或计划术后治疗时，将缀合物产物施用于患者。这例如正好在外科手术之前或处于外科手术时，或正好在麻醉之后、期间或之前。与其他已知的替代方案相比，这是一种巨大的改善，其他已知的替代方案必须在外科手术之前6小时、12小时、18小时或甚至1-2天施用，以准备好在外科手术期间使用，并且甚至在每种情况下都不产生令人满意的tbr或具有对癌症的令人满意的特异性，这意指正常组织在其被认为是癌症组织的情况下不被去除。根据本发明的受体结合和血浆清除的特征的组合将允许此类改善的使用。换句话说，根据本发明的缀合物产物具有药代动力学特征，其允许在尽可能地在接近外科医生使用的时间之前(例如麻醉前后)施用。此外，还可以说，根据本发明的缀合物产物使得从施用到使用的第一可行时间能够在至少1200分钟内，诸如在600分钟内、例如在300分钟内、或120分钟内、诸如优选地在60分钟内、或甚至在30分钟内、例如自施用起15分钟内。
[0067]
为了总结与本发明的药代动力学方面相关的一些不同的观点，可对以下内容进行
陈述。根据本发明的缀合物合适地表现出以下特征：
[0068]
tbr是快速生成的并且持续长时间(手术期间)，这达到以下组合：
[0069]-在血浆中达到足够高的浓度；
[0070]-在癌症组织中达到足够高的浓度；
[0071]-具有适当的结合动力学；
[0072]-具有适当的血浆消除半衰期；
[0073]-可以以安全的剂量水平给药，从而不导致严重的不良事件；
[0074]-对在感兴趣的癌症上(在感兴趣的癌症的一部分中)广泛表达的感兴趣的受体显示出高选择性，并且与接近癌症的正常组织相比，对癌症具有高选择性；以及
[0075]-能够利用可用/现有设备检测。
[0076]
上述给定特征可通过不同的手段和设备来测量和分析。
[0077]
除了最佳药代动力学特征之外，还存在根据本发明的某些感兴趣的其他方面。此类中的两者是溶解性和蛋白质结合能力。根据本发明的组合物提供有益特征的优选组合。根据一个具体实施方案，组合物能够在小于10分钟、优选地小于5分钟、更优选地小于2分钟、最优选地小于1分钟内溶解。此外，根据又一具体实施方案，组合物具有大于50％、优选地大于75％、更优选地大于85％、更优选地大于90％、更优选地大于95％、最优选地大于99％的体内蛋白质结合。
[0078]
如从上文显而易见的，根据本发明的缀合物和组合物旨在用于癌症外科手术、癌症治疗和/或癌症诊断。与这一点一致，根据本发明的一个实施方案，提供了根据本发明的受体靶向缀合物和组合物，其用于癌症外科手术、癌症治疗或诊断，诸如用于癌症的光学成像/荧光成像(fli)。应认为，根据本发明的缀合物和组合物可用于若干不同类型的适应症。一些示例是胶质母细胞瘤、胶质瘤、肺、结直肠、乳腺、前列腺、胃、胃部、肝、甲状腺、膀胱、食道、胰腺、肾脏、子宫体、子宫颈、黑素瘤、脑(包括中枢和周围神经系统)、卵巢、胆囊、头颈(例如，唇、口腔、喉、鼻咽、口咽、喉咽)、多发性骨髓瘤、睾丸、外阴、唾液腺、间皮瘤、阴茎、卡波西肉瘤、阴道、神经内分泌瘤、神经内分泌癌。
[0079]
在成像中，当然还存在设备。根据本发明的缀合物产物和组合物适当地含有可在光激发时重新发射光的荧光化学元素。激发和发射光对所用的荧光团具有特异性。激发光通常来自激光器，例如具有介于600nm(纳米)和900nm之间的波长。来自荧光团的发射光通常由相机使用机械滤光器或基于软件的滤光器检测到，例如检测介于750nm和950nm之间的光。所使用的设备可以是外科机器人、外科显微镜、内窥镜或手持式装置。光源(例如，激光器)和光检测器(例如，具有滤光器的相机)的规格取决于所选择的荧光团。
[0080]
根据本发明，可使用多种不同类型的规程。外科规程的非限制性示例是日托手术、开刀手术、微创手术和机器人辅助手术。
[0081]
其也可以是具有不同目的的外科手术。外科手术目的的非限制性示例是：治愈手术(旨在从身体去除所有癌性肿瘤一这被包括在标记的尺寸计算中)，预防手术(用于去除不含有癌细胞但可发展成恶性肿瘤的组织，例如结肠中的息肉)、诊断手术(有助于确定细胞是否是癌性的，例如，进行目的为诊断或筛查测试的活检，例如使用结肠直肠镜寻找结肠直肠恶性息肉)，分期手术(努力发现癌症的程度，例如腹腔镜检查(通过小切口插入将具有镜头或相机的观察管以检查身体的内部))，大块切除术(除去一部分，但不是全部的癌性肿
瘤。其用于在去除整个肿瘤可对器官或身体造成损害的某些情况)，姑息手术或支持性手术(用于治疗晚期癌症。它不对癌症进行治愈，而是为了减轻不适或矫正癌症或癌症治疗可能已经产生的其他问题。支持性手术的示例是插入导管以帮助化疗)，恢复性手术(有时用作治愈或其他手术的后续手术以改变或恢复人的外观或身体部位的功能。例如，跟随患有乳腺癌的女性)，或矫正手术(是在手术(或其他治疗)之后，例如出血或感染之后解决问题的再次手术)。
[0082]
与本发明有关的另一个感兴趣的领域是光动力疗法。光动力疗法(pdt)越来越多地用作浅表癌症的具有吸引力的、替代治疗方式。该治疗包括两个相对简单的规程：施用光敏性药物和照射肿瘤以激活或加热药物。根据本发明的组合物可用于pdt治疗。
[0083]
本发明还涉及一种用于癌症治疗、分期或诊断的方法，诸如用于癌症的光学成像/荧光成像(fli)的方法。
[0084]
该方法可以涉及一种涉及以下方面的方法：诊断解剖结构、引导外科医生/机器人、辅助外科医生/机器人、增加存活率、增加在外科手术下去除的癌症组织的量、提高生活质量、减少去除的正常组织的量、增加确定性、减少手术时间、改善外科手术质量、改善外科手术的质量保证、降低外科手术的成本、改善外科医生的表现、和/或以任何其他方式改善外科手术结果。
[0085]
此外，本发明还涉及一种涉及光学成像的方法。因此，根据本发明的一个具体实施方案，提供了一种光学成像方法，其包括以下步骤：
[0086]
(a)施用根据本发明的组合物，从而在靶组织中累积，
[0087]
(b)用荧光能够吸收的波长的光照射靶组织；以及
[0088]
(c)检测由荧光团发射的荧光并形成靶组织的光学图像。
[0089]
此外，根据本发明的组合物可以以不同形式提供。根据本发明的一个具体实施方案，提供了一种冻干组合物，该冻干组合物包含根据本发明所述的组合物。在这种情况下，冻干保护剂适合产生能够容易重构的冻干饼。
[0090]
此外，包含根据本发明的组合物的干制剂也是感兴趣的。
[0091]
通常，并且如上所述，当获得根据本发明的最佳产物时，存在要考虑的若干方面。首先，药物制剂应成为溶液，并且在此表面活性剂是重要的。如上所述，应通过使用缓冲液来提供更多或更少的生理ph。稳定性特征是重要的，并且如果需要，这通过保持低水含量并且还通过使用某些赋形剂来提供。此外，冻干保护剂组分也是感兴趣的，例如一种或多种冻干保护剂。
[0092]
此外，制备方法是相关的。根据一个具体实施方案，本发明涉及一种用于制备根据上文所述的组合物的方法，其中所述方法包括将荧光团标记的受体靶向组分、缓冲液和表面活性剂混合以在组合物中增溶荧光团标记的受体靶向组分。如上所述，优选地，受体靶向的组分是upar靶向肽缀合物。此外，根据一个具体实施方案，将冻干保护剂与组合物混合，使得冻干饼被制备。优选地，冻干饼可容易地重构。根据本发明的冻干保护剂的一种合适组合是甘露醇和甘氨酸。
[0093]
此外，根据本发明的又一具体实施方案，制备方法包括：
[0094]-(i)将icg-glu-glu-ae105：
[0095][0096]
或其药学上可接受的盐，与磷酸钠、甘露醇和甘氨酸混合以产生组合物，该组合物包含：
[0097]-浓度为0.1mg/ml-10.0mg/ml的icg-glu-glu-ae105；
[0098]-浓度范围为5mm-50mm的磷酸钠；
[0099]-浓度范围为10mg/ml-50mg/ml的甘露醇；
[0100]-浓度范围为1mg/ml-30mg/ml的甘氨酸；
[0101]-浓度＞0.01重量％的聚山梨醇酯20。
[0102]-(ii)将步骤(i)的组合物的ph调节为在6.9-7.9的范围内的ph；
[0103]-(iii)将等于期望剂量的量的来自步骤(ii)的混合物转移到合适的容器中；
[0104]-(iv)干燥混合物；以及
[0105]-(v)密封容器。
[0106]
参考上文所述，荧光团标记的upar受体靶向组分的合适浓度在每剂量单位0.1mg-2,000mg的范围内，优选地在每人类剂量单位1mg-1,000mg的范围内。
[0107]
实施例
[0108]
实施例1开发根据本发明组合物的含水制剂
[0109]
包含荧光团标记的受体靶向肽缀合物icg-glu-glu-ae105的组合物(下文称为组合物1)可以高达20mg/ml的浓度溶于dmso中，其中峰值光谱吸收在800nm处，类似于当前用于临床以对血管、血流和相关组织灌注进行视觉评估的吲哚菁绿(icg)，图a。
[0110]
根据本发明，已经开发了1.0mg/ml的组合物1的含水制剂，其使用适于药物制剂开发的赋形剂。
[0111]
组合物1在1.0mg/ml的测试浓度下不可溶于磷酸盐缓冲液盐水，这可以从具有明显双峰的在700nm至825nm范围内的光谱吸收和在800nm处具有显著较低的荧光峰的对应发射光谱两者观察到，图a。激发在775nm处进行。
[0112]
在含有45mg/ml甘露醇、ph 7.4的10mm磷酸钠缓冲液中，峰吸收朝向800nm处的峰吸收移位，并且在含有10mm磷酸钠、45mg/ml甘露醇、1％聚山梨醇酯20、ph 7.4的制剂中，吸收光谱类似于在dmso中获得的光谱。向磷酸盐缓冲液盐水中添加0.2g/ml的2-羟丙基-β-环糊精(hbc)在以1.0mg/ml增溶组合物1方面也是非常有效的，图b。
[0113]
在图c和d中呈现了组合物1完全增溶的三种制剂(1.0mg/ml)的组合的吸光度和发射光谱。
[0114]
图a-d的进一步说明
[0115]
a.以1.0mg/ml溶于dmso和pbs中的fg001的吸光度和发射光谱。激发波长：775nm。将用于吸光度测量的分析样品进一步稀释200倍和400-1000倍以用于发射光谱。
[0116]
b.溶于1)10mm磷酸钠、45mg/ml甘露醇、ph 7.4、2)10mm磷酸钠、45mg/ml甘露醇、1％聚山梨醇酯20、ph 7.4和3)pbs、0.2g/ml hbc的fg001的吸收光谱。将用于吸光度测量的分析样品进一步稀释200倍和400-1000倍以用于发射光谱
[0117]
c.fg001完全增溶的三种制剂(1.0mg/ml)的吸收光谱的重叠：a)dmso、b)10mm磷酸钠、45mg/ml甘露醇、1％聚山梨醇酯20、ph 7.4和c)磷酸盐缓冲液盐水，0.2g/ml hbc。将用于吸光度测量的分析样品进一步稀释200倍和400-1000倍以用于发射光谱
[0118]
d.组合物1完全增溶的三种制剂(1.0mg/ml)的发射光谱的重叠：a)dmso、b)10mm磷酸钠、45mg/ml甘露醇、1％聚山梨醇酯20、ph 7.4和c)磷酸盐缓冲液盐水，0.2g/ml hbc。激发波长：775nm。将用于吸光度测量的分析样品进一步稀释200倍和400-1000倍以用于发射光谱
[0119]
实施例2确定用于增溶组合物1的聚山梨醇酯20的最佳浓度范围-参见图e
[0120]
通过测量含有0至1.0％聚山梨醇酯20的制剂的吸收光谱来评估用于在10mm磷酸钠、45mg/ml甘露醇、ph 7.4中以浓度1.0mg/ml增溶组合物1的聚山梨醇酯20的最佳浓度范围。
[0121]
吸收光谱示出，含有＞0.01％聚山梨醇酯20的所有制剂，组合物1完全增溶，其中在800nm处具有主峰光谱吸收。
[0122]
实施例3确定组合物1在具有聚山梨醇酯20的三种制剂中的稳定性
[0123]
在适用于研发冻干产物的三种不同制剂中评估浓度为1.0mg/ml的组合物1的稳定性。
[0124]
a(甘露醇)：
[0125]
10mm磷酸钠，45mg/ml甘露醇，0.025％聚山梨醇酯20，ph 7.4
[0126]
b(甘露醇/甘氨酸)：
[0127]
10mm磷酸钠，26mg/ml甘露醇，8.7mg/ml甘氨酸，0.025％聚山梨醇酯20，ph 7.4
[0128]
c(甘露醇/蔗糖)：
[0129]
10mm磷酸钠，26mg/ml甘露醇，40mg/ml蔗糖，0.025％聚山梨醇酯20，ph 7.4
[0130]
将组合物1称重到制剂缓冲液中，并且使用氢氧化钠或盐酸将ph调节至7.4。通过合适的无菌过滤器将整体制剂无菌过滤并填充到6r小瓶中。将小瓶与塞子一起置于冻干器中，并使用标准程序冻干。冻干后，将所有小瓶封盖。
[0131]
在使用rp-hplc测量渗透度和纯度之前，用水重构一个小瓶的每种制剂以供进样，如实施例4中所述。
[0132]
重构之后组合物1制剂的渗透度和纯度
[0133]
[0134]
所有三种制剂均具有待用于向人类静脉内施用的药物制剂的期望渗透度。
[0135]
在室温和日光(rtl)下两周评估组合物1的重构的液体制剂的稳定性。
[0136][0137]
众所周知，荧光团如icg是光敏的并且应该避免光。然而，为了选择最稳定的制剂，将三种液体制剂在室温下暴露于日光两周。
[0138]
从上表中呈现的数据显而易见的是，制剂b：甘露醇/甘氨酸是最稳定的。
[0139]
还评估了三种制剂的冻干产物在三种不同的储存条件下两周的稳定性：
[0140]
i：室温，日光(rtl)
[0141]
ii：室温，暗(rtd)
[0142]
iii：40℃，暗(40d)
[0143][0144][0145]
*na：不充分冻干的制剂a的小瓶
[0146]
与液体制剂相比，冻干小瓶的稳定性显著增加，并且观察到更小的变化。研究证实制剂b：甘露醇/甘氨酸作为冻干物在升高的温度(40℃)下和在室温下暴露于光时均具有优异的稳定性。
[0147]
将储存在室温、暗(rtd)和40℃、暗(40d)两周的冻干样品重构并在室温、日光(rtl)下储存另外24小时。
[0148][0149]
*na：不充分冻干的制剂a小瓶
[0150]
作为冻干产物保持两周，并且之后重构，在室温、日光下储存24小时的样品稳定性也支持选择制剂b：甘露醇/甘氨酸作为优选的制剂。
[0151]
应当注意，用于研究特征性单吸收光谱峰的另一种可能的方法是计算定位在约800nm的单峰面积，并且将该峰面积与在600nm-900nm的给定波长区域中的吸收光谱的总面积进行比较。这将在说明书中如上所述进一步说明。
[0152]
实施例4确定组合物1在具有聚山梨醇酯20的一种制剂中的长期储存稳定性
[0153]
在一种包含10mm磷酸钠、26mg/ml甘露醇、9.0mg/ml甘氨酸、0.025％聚山梨醇酯20、ph 7.4的制剂中，对浓度为1.0mg/ml的组合物1作为冻干物的长期稳定性进行评估。
[0154]
将组合物1称重到制剂缓冲液中，并且使用氢氧化钠或盐酸将ph调节至7.4。通过合适的无菌过滤器将整体制剂无菌过滤并填充到6r小瓶中。将小瓶与塞子一起置于冻干器中，并使用标准程序冻干。冻干后，将所有小瓶封盖，目视检查并避光储存在5℃、25℃/60％rh或40℃/75％rh下至多9个月。
[0155]
在选定的时间点，从稳定室中取出小瓶，以用于目视检查冻干物并进行水含量测定。在分析相应的液体制剂的纯度、ph和视觉外观之前，将另一小瓶用水重构以用于进样。
[0156]
在5℃、25℃/60％rh或40℃/75％rh下储存至多9个月后的重构组合物1制剂的纯
度
[0157][0158]
在5℃或25℃/60％rh下储存至多9个月后，残余水、重构之前/之后的目视检查以及组合物1制剂的ph。
[0159][0160]
组合物1的选定的制剂示为在储存条件(5℃和25℃/60％rh)下稳定至多9个月，其通过纯度测定来判断。制剂的ph以及冻干物的外观以及重构的液体制剂的透明度在至多9个月储存之后仍然未变化。此外，在25℃/60％rh下储存9个月后，残余水含量为约2％。
[0161]
分析方法：
[0162]
rp-hplc检测重构组合物1的纯度：流动相a由纯化水/乙腈(80/20体积/体积)与5mm乙酸铵构成，并且流动相b由纯化水/乙腈(10/90体积/体积)与5mm乙酸铵构成。使用waters xbridge beh peptide，3.5μm，4.6x150mm柱。流速设置为1.0ml/min，检测在780nm的波长下进行，柱运行温度为45℃。样品冷却器温度设置为5℃，并且样品进样负载为10μg。
[0163]
根据ph.eur.2.5.32.，通过karl fisher滴定测定冻干物的水含量。