北工商梅泽氏菌新菌种及其应用

1.本发明涉及酿酒微生物技术领域，具体涉及一种任清短杆菌新菌种及其应用。


背景技术：

2.白酒是世界三大蒸馏酒之一，“以麦制曲、用曲发酵”的传统酿造工艺造就了白酒独有的品质特征。酒曲是将小麦、大麦或掺入一定比例的豌豆经轧碎后加水拌匀踏成曲坯，经自然培养而成的含多种微生物和酶系的复合糖化发酵剂。酿造过程中，酒曲微生物不仅发挥了糖化发酵作用，而且具有重要的生香增味作用，酒曲微生物的种类和丰度对白酒的出酒率和风味有极大的影响。
3.清香型白酒是北方白酒的主流，其工艺特点是将高粱等谷物蒸熟，拌曲后地缸发酵，没有窖泥，其风味物质主要由谷物原料经过酒曲微生物和酒醅中酶系发酵转化生成，酒曲微生物的种类和丰度对酿造清香型白酒至关重要。酒曲微生物主要来源于制曲原料和制曲环境。自然界中的微生物多种多样，具有非常丰富的物种多样性，但是大多数微生物还处于难培养状态。微生物在不同环境中的可培养性虽有不同，但都很低，如海水中为0.1％以下，在土壤中约为0.3％。使用传统的细菌培养方法仅能培养自然生境中的一小部分细菌。应用传统方法培养出的微生物都是已知微生物，尚未发现新的微生物物种。


技术实现要素：

4.为此，本发明提供北工商梅泽氏菌新菌种及其应用。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供一种新菌株，所述菌株为北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.19205。
7.本发明还提供一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的菌株。
8.上述所述的菌剂在如下(a1)或(a2)中的应用：
9.(a1)产生风味物质；
10.(a2)制备具有风味物质的产品。
11.上述所述的菌剂在如下(b1)或(b2)中的应用：
12.(b1)酿酒；
13.(b2)制备酿酒产品。
14.上述所述的菌种在所述菌剂中的应用。
15.本发明还提供菌株，所述菌株为北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)中菌株，所述北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)中菌株的16s rdna序列与seq id no.1相比至少具有98.7％以上的相似性。
16.本发明还提供所述菌株的筛选方法，将酒曲稀释后涂布于r2a培养基上，28℃好氧培养36h，三区划线纯化培养3次，得到纯培养细菌，将所述纯培养细菌pcr技术扩增
16srdna，对序列对比分析，得到所述北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)。
17.本发明的一个实施例中，所述r2a培养基包括以下质量份数的原料：葡酵母浸出粉0.2-1份、丙酮酸钠0.1-0.5份、蛋白胨0.1-1份、无水硫酸镁0.01-0.05份、葡萄糖0.1-1份、磷酸氢二钾0.1-0.5份、可溶性淀粉0.1-1份、酪蛋白水解物0.1-1份、琼脂10-20份。
18.本发明具有如下优点：
19.试验证明，本发明提供一株新菌种北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)，该菌株分离自酒曲，其能够产生清香风味物质，可用于发酵酿酒。
20.本发明分离菌种，先采用r2a培养基，常见的细菌繁殖较慢，同一培养皿上，难培养新的梅泽氏属属细菌生长较快，受常规微生物影响小；同时，延长培养时间36h后挑取单菌落，难培养新的微生物经过长时间充分的生长，直至可见的菌落。
21.菌种保藏说明：本发明的北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)，于2019年12月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为cgmcc no.19205。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
23.图1为本为本发明提供的北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)16s rdna序列及进化树图；
24.图2为本发明提供的北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)的甲基萘醌mk-8(h2)的检测结果图；
25.图3为本发明提供的北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)极性酯检测结果图。
具体实施方式
26.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1、北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)的分离与鉴定
28.一、北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)新菌种的分离
29.步骤一、配置r2a培养基：葡酵母浸出粉0.5g、丙酮酸钠0.3g、蛋白胨0.5g、无水硫酸镁0.024g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.3g、可溶性淀粉0.5g、酪蛋白水解物0.5g、琼脂15g。
30.步骤二、取酒曲10g，用无菌蒸馏水稀释至10-5
，涂布于配置的r2a培养基培养皿上37℃好氧培养；
31.步骤三、28℃好氧培养36h后挑取单菌落，三区划线纯化3次，得到纯培养细菌；
32.步骤四、提取细菌dna，利用pcr技术扩增16srdna序列，通过序列比对，初步确定北
工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)新菌种。
33.二、北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)的鉴定
34.从酒曲中分离筛选的新菌为革兰氏阳性菌，梅泽氏菌属，命名为：北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)
35.1、北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)对菌种的进行形态学、生理生化、细胞化学及基因水平研究。北工商梅泽氏菌ren6(umezawaea beigongshangensis)生理生化特性
36.北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)菌落形态为圆形，凸起，橘色，产生孢子；革兰氏反应阳性，为革兰氏阳性菌，最适温度为28℃，可以水解淀粉，过氧化氢酶阳性。
37.2、北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)细胞化学特征检测通过gc气相色谱、hplc液相色谱和tlc薄层色谱检测任清短杆菌(brevibacterium renqingensis)的脂肪酸、醌类型、极性脂等细胞化学组分(sasser m.identification of bacteria by gas ghromatography of cellular fatty acids，midi technical note 101.newark,de:midiinc；1990.minnikin de,o’donnell ag,goodfellow m,alderson g,athalye m et al.anintegrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones andpolar lipids.j microbiol methods1984；2:233
–
241)。
38.北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)细胞脂肪酸成分：饱和脂肪酸：c16:0，c17:0，iso-c16:0(异式十六碳饱和脂肪酸)；不饱和脂肪酸：iso-c16:1h，c17:1ω6c，c17:1ω8c，细胞脂肪酸成分如表1所示表1
[0039][0040]
如图2所示，在菌株北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)细胞呼吸醌组份检测，该菌株的主要优势醌mk-9(h4)，醌类化合物是一类广泛存在于自然产物、抗肿瘤药物、体内生化代谢物、环境污染物或多环芳烃代谢产生的氧化活性物质。每种细菌都有一个主要的醌类组分，一个微生物群体中的醌类种类和数量的不同反映了群体组成的多样
性，醌类谱已经作为细菌群体组成多样性的一个指标，在环境微生物中广泛使用。
[0041]
北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)极性酯的检测，具体步骤为：极性脂提取：取100mg北工商梅泽氏菌冻干菌体，悬浮于9.5ml氯仿：甲醇：0.3％nacl(2.5:5:2)溶液中。将上述菌体溶液放置80℃水浴，15min。冷却后，滤纸过滤至50ml离心管中，加入2.5ml氯仿和2.5ml 0.3％nacl，4000rpm离心5min。小心分取下层氯仿相至干净的旋转蒸发仪专用烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发除去氯仿，水浴温度不超过40℃。加入250μl氯防-甲醇(2:1，v/v)转至棕色螺口样品瓶中，放置4℃冰箱中保存待测。
[0042]
极性脂的tlc分析：将10cm
×
10cm的硅胶板(merck公司25tlc aluminiumn sheets 20cm
×
20cm silica gel 60f254)在110℃烘箱中活化1小时,取出冷却。吸取2μl总脂样品点样于tlc板上，复点样3次。
[0043]
将tlc薄板置于第一个层析缸内展层，第一向展层剂为氯仿:甲醇:水(65:25:4，v/v)，溶媒展至顶部后取出薄板吹干、将薄板放入第二个层析缸，第二向展层剂为氯仿：甲醇：乙酸：水(80：12：15：4，v/v)，按与第一向垂直的方向上行，溶媒展至顶部取出薄板吹干，将磷钼酸显色剂喷洒至tlc板至完全湿润，100℃加热5-8min，将清晰斑点显出，立即在扫措仪上扫描tlc板，记录结果。如图3所示，北工商梅泽氏菌中，含有4种极性酯，dpg：双磷脂酰甘油，diphosphatidylglycerol；pg：磷脂酰甘油，phosphatidylglycerol，
[0044]
glycophospholipid；pe磷脂酰乙醇胺，phosphatidyl ethanolamine，pe；pi：磷脂酰肌醇，phosphatidylinositol。磷酸类脂(phospholipioides)属极性脂(polar lipid)，与蛋白质、糖等构成细胞膜，对于物质运输、代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。不同属菌的磷酸类脂组分是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可缺少的分类指征。
[0045]
3、北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)16s rdna序列及进化树
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北工商梅泽氏菌(umezawaea beigongshangensis)，菌株由上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序，得到全基因组序列。系统进化树如图1所示。
[0047]
将测得的ren6t 16s rrna序列在ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中与模式菌株进行比对，根据相似度选取21个模式菌株16s rrna序列进行系统进化树的构建，如图1所示ren6
t
与梅泽氏菌属的亲缘距离相近，且在系统进化树中为独立分支，确定其为梅泽氏菌属，同时根据相似度(98.91％)得知其相似株为umezawaea_tangerina_dsm_44720。接着将ren6t菌株送往上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序，得到全基因组序列。同时从ncbi中下载相似株全基因组，将ren6
t
全基因组与相似株umezawaea_tangerina_dsm_44720在dsmz(http://ggdc.dsmz.de/home.php)进行全基因组比对，基因组dna-dna同源性杂交(ddh)：dna同源性(ddh)为22.10％，ddh小于70％，因此初步确定为新种。
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虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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