一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷D2的方法

一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷d2的方法
技术领域
1.本发明涉及一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷d2的方法，属于生物催化合成技术领域。


背景技术：

2.甜菊糖苷是从甜叶菊叶子中提取和纯化的二萜糖苷，具有高甜度、低热量、对人体无副作用等优点。甜菊糖苷已被美国、巴西、韩国、日本和欧洲食品安全局批准为安全食品添加剂。到目前为止，已从甜菊叶中鉴定出64种甜菊醇糖苷，其中，甜菊糖含量最高，占干重的5-10％，其次是莱鲍迪苷a，占干重的2-4％。他们表现出比蔗糖高250-300倍的甜度，但即使是高纯度的甜菊糖苷也保留了苦味的属性，这在很大程度上限制了它们在天然食品添加剂市场中的应用。
3.近年来研究发现，c-13和c-19所连接的糖基单元的数量及种类对甜菊糖苷的性质有显著影响。例如，莱鲍迪苷a的c-13位置上有一个额外的葡萄糖，使其比甜菊糖更甜更可口。甜叶菊中进一步分离得到的莱鲍迪苷d和莱鲍迪苷m在c-19位置上连接有一个和两个额外的葡萄糖，使其表现出比莱鲍迪苷a更好的甜味品质。因此人们非常关注在这些位置上具有不同的糖基单元的新型甜菊糖苷以挖掘具有更好品质的甜味剂。
4.udp-葡萄糖基转移酶(ugts)是一种天然进化的催化糖基化反应的酶，它们将糖部分从活化的糖供体转移到受体分子上。ugts在甜菊糖苷的合成中已经有了许多的应用。2014年，prakash等人首次报道了一种新型甜菊糖苷衍生物-莱鲍迪苷d2，其是糖基转移酶ugtsl2催化莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的次要产物，最近，guohong mao报道了糖基转移酶eugt11催化莱鲍迪苷e转化为莱鲍迪苷d2。但是由于产率较低，产物混杂，分离纯化成本高或底物莱鲍迪苷e价格昂贵，限制了对莱鲍迪苷d2的进一步研究。因此，鉴定一种新的具有高催化活性和区域选择性的糖基转移酶，利用相对常见的起始底物(例如莱鲍迪苷a)合成莱鲍迪苷d2是非常有必要的。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明挖掘来自芝麻的糖苷转移酶ugt94d1催化莱鲍迪苷a合成莱鲍迪苷d2，在尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)存在的情况下具有催化莱鲍迪苷a合成莱鲍迪苷d2的活性。并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖udpg循环再生体系，利用大肠杆菌裂解液实现高效生物合成莱鲍迪苷d2，为莱鲍迪苷d2的进一步研究提供了可能性。
6.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一个目的是提供一种表达来源于芝麻的糖基转移酶的重组菌。
8.在一种实施方式中，所述糖基转移酶的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1，核苷酸序列的登录号为xm_011078605.1。
9.在一种实施方式中，所述重组菌还表达蔗糖合酶。
10.在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶
活性的氨基酸序列。
11.在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列的ncbi登录号为np_001031915。
12.在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。
13.在一种实施方式中，所述重组菌为将糖基转移酶构建至pet-21b( )载体，将蔗糖合酶构建至pacycduet-1载体。
14.本发明的第二个目的是提供一种组合物，所述组合物为糖基转移酶、所述重组菌或所述重组菌的细胞裂解液中的一种或多种；所述糖基转移酶的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1。
15.在一种实施方式中，所述细胞裂解液为所述重组菌诱导表达后进行细胞裂解获得的上清液。
16.本发明的第三个目的是提供一种催化合成莱鲍迪苷d2的方法，所述方法为以莱鲍迪苷a为底物，利用所述重组菌和/或上述组合物进行催化反应。
17.在一种实施方式中，所述催化反应的条件为：以1-50mmol/l莱鲍迪苷a、50-800mmol/l蔗糖、5-25％(v/v)dmso、100mmol/l k2hpo
4-kh2po4缓冲液，100mmol/lnacl为反应体系，20-45℃反应0-48h。
18.在一种实施方式中，所述组合物的添加量至少为40mg/ml。
19.在一种实施方式中，所述缓冲液ph为5.5-11.0。
20.本发明还保护上述重组菌或上述组合物或上述方法在制备含有莱鲍迪苷d2的产品中的应用。
21.有益效果：
22.(1)本发明将编码糖基转移酶ugt94d1的核酸序列用于制备能够催化莱鲍迪苷a生成莱鲍迪苷d2的重组蛋白，制备出的重组蛋白能够以udpg为糖基供体，使莱鲍迪苷a为底物发生糖基化合成莱鲍迪苷d2。
23.(3)本发明将糖基转移酶ugt94d1与蔗糖合酶atsusy联用，构建udpg循环再生体系。通过偶联反应体系条件优化，实现利用9.67g/l(10mmol/l)莱鲍迪苷a以94.66％的产率合成10.69g/l的莱鲍迪苷d2。
24.(4)本发明构建的重组菌株共表达芝麻来源的糖基转移酶和拟南芥来源的蔗糖合酶，利用重组菌株诱导表达后制备得到的细胞裂解液催化莱鲍迪苷a合成莱鲍迪苷d2，无需添加糖基供体，也不需要额外使用细胞通透剂，显著降低成本且绿色环保。
附图说明
25.图1显示糖基转移酶ugt94d1催化莱鲍迪苷a产生莱鲍迪苷d2的生物合成途径。
26.图2为实施例2中糖基转移酶ugt94d1蛋白表达表达及纯化分析。
27.图3为实施例3中糖基转移酶ugt94d1催化莱鲍迪苷a合成莱鲍迪苷d2的uplc分析图。泳道1：marker；泳道2：无iptg诱导表达样品；泳道3：粗酶液；泳道4：粗酶液上清；泳道5：粗酶液沉淀；泳道6：纯化穿透液；泳道7：洗涤杂蛋白质样品；泳道8：目的蛋白质洗脱样品。
28.图4为实施例3中莱鲍迪苷a糖基化反应产物莱鲍迪苷d2质谱分析。
29.图5为实施例4中产物莱鲍迪苷d2的核磁共振波谱分析氢谱。
30.图6为实施例4中产物莱鲍迪苷d2的核磁共振波谱分析碳谱。
31.图7为实施例6中ugt94d1-atsusy糖基化偶联反应裂解液蛋白表达分析。泳道1：marker；泳道2：无iptg诱导表达样品；泳道3：粗酶液；泳道4：粗酶液上清；泳道5：粗酶液沉淀。
32.图8为实施例7中ph对糖基化偶联反应缓冲溶液的影响。
33.图9为实施例8中温度对糖基化偶联反应的影响。
34.图10为实施例9中dmso浓度对糖基化偶联反应的影响。
35.图11为实施例10中蔗糖浓度对糖基化偶联反应的影响。
36.图12为实施例11中底物浓度对糖基化偶联反应的影响。
37.图13为实施例12中反应时间对糖基化偶联反应的影响。
具体实施方式
38.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
39.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
40.下述实施例中涉及到的方法：
41.糖基转移酶酶学性质的测定：糖基转移酶ugt94d1对莱鲍迪苷a的动力学分析是在200μl反应体系中进行的，反应体系含有5mm udpg、10mm mncl2、50mm tris-hcl ph 8.0和5μg纯化蛋白样品，莱鲍迪苷a的浓度为0-5mm。反应温度为35℃，反应时间为20min，反应结束后立即95℃加热10min淬灭反应。用5倍体积甲醇稀释，20000
×
g离心5min,去除蛋白沉淀物。取上层液体用0.22μm滤膜过滤，然后利用uplc对样品进行分析。
42.莱鲍迪苷d2的产率的测定：配制不同浓度(0.4mm、0.8mm、1.2mm、1.6mm、2.0mm)的莱鲍迪苷d2标准溶液，利用uplc对标准溶液进行分析，获得莱鲍迪苷d2浓度标准曲线方程为y＝1140530.429x 13834.2381，r2＝0.99808。根据标准曲线换算得到莱鲍迪苷d2的产率。产率＝莱鲍迪苷d2实际产量/莱鲍迪苷d2理论产量。
43.实施例1糖基转移酶ugt94d1基因的获取和重组菌株的构建
44.从genbank中下载芽孢杆菌糖基转移酶氨基酸序列(登录号：xp_011076907.1)及核苷酸序列(登录号：xm_011078605.1)，由亦欣生物科技有限公司进行基因合成并连接至载体pet-21b( )的多克隆酶切位点，得到重组质粒pet-21b( )-ugt94d1。
45.将所得质粒pet-21b( )-ugt94d1进行测序鉴定并转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，采用含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板(10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/lnacl，20g/l琼脂粉)进行筛选，得到重组菌株e.coli bl2l(de3)pet-21b( )-ugt94d1。
46.实施例2重组菌株的诱导表达及目的蛋白纯化
47.将实施例1中构建的重组菌株e.coli bl2l(de3)pet-21b( )-ugt94d1接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的1l 2
×
yt液体培养基(16g/l蛋白胨，10g/l酵母粉，5g/lnacl)中，并在135rpm，37℃条件下培养至od
600
为0.6-0.8后，培养温度降至18℃，加入终浓度为0.1mmol/l的异丙基-β-硫代半乳糖苷(iptg)，诱导培养8h。
48.将诱导表达的菌液离心(7000rpm，7min，4℃)，弃上清，收集菌体。将菌体用裂解缓冲液(50mmol/ltris-hcl ph 8.0，300mmol/lnacl，10mmol/l咪唑，10％甘油)按照1g菌体每10ml裂解缓冲液进行重悬。利用高压匀浆机进行破碎，然后将破碎后的菌液离心(40000
×
g，30min)，取上清即获得粗酶液。
49.将粗酶液利用ni

柱进行亲和层析纯化，上样结束后，10倍体积裂解缓冲液冲洗杂蛋白，用洗脱缓冲液(50mmol/l tris-hcl ph 8.0，300mmol/lnacl，250mmol/l咪唑，10％甘油)进行目的蛋白洗脱。收集洗脱的目的蛋白，通过脱盐柱(histrptm 5mldesalting)进行脱盐，脱盐缓冲液(25mmol/l tris-hcl，150mmol/lnacl，10％甘油)。脱盐后浓缩至10mg/ml，进行后续反应。纯化的蛋白通过10％sds-page凝胶电泳进行检测，结果见图2，成功获得目的条带清晰蛋白大小准确的纯酶，测得ugt94d1对莱鲍迪苷a的km值为0.76
±
0.06mm，k
cat
值为15.01
±
0.31min-1
。
50.实施例3ugt94d1催化莱鲍迪苷a反应合成莱鲍迪苷d2的糖基化反应
51.将实施例2获得的纯化后的糖基转移酶ugt94d1用于糖基化反应(图1)。
52.糖基化反应在200μl反应体系中进行，反应体系如下：50mmol/l tris-hcl ph 8.0，5mmol/ludpg，10mmol/lmncl2，1mmol/l莱鲍迪苷a，实施例2中所获得纯酶ugt94d1浓度为10μm。在35℃下反应20min。反应结束后，用5倍体积甲醇稀释，20000
×
g离心5min，0.22μm滤膜进行抽滤后，对滤液进行超高效液相色谱(uplc)检测分析。uplc采用waters公司beh c181.7μm反向柱，进样量2μl，柱温40℃，流动相采用a管路：乙腈，b管路：1.38g/lnah2po4缓冲液(ph 2.6)，流速0.3ml/min，具体程序如表1所示：
53.表1uplc反应程序
[0054][0055]
通过液相分析可得知，结果如图3所示，与莱鲍迪苷a标准品对比可知，在反应体系中有明显的新产物生成，并对反应混合物进行质谱(ms)分析(图4)，lc-ms的负离子模式结果显示，在m/z 1127.4790处有一个[m-h]-离子的峰，式c
50h80o28
，表明产物是莱鲍迪苷a的单糖基衍生物，同时在m/z 803.3811处有一个[m-glc-h]-离子的峰。由于菊糖苷c-19位的酯键在esi-ms中更容易断裂产生碎片离子，由此推测新的葡萄糖基单元增加在莱鲍迪苷a的c-19-一糖部分。
[0056]
实施例4新型莱鲍迪苷a单糖基化衍生物的结构鉴定
[0057]
利用糖基转移酶ugt94d1进行大规模(200ml)糖基化反应制备新型衍生物，反应条件与实施例3中一致。使用半制备高效液相色谱系统进行纯化，系统采用shim-pack gist c18色谱柱(10
×
250mm，5μm，shimadzu，japan)，检测波长210nm，流动相为乙腈和水的混合物，溶剂流速为5ml/min,柱温为40℃，洗脱程序为0-35min:25％乙腈等度洗脱。从反应混合
物中获得50mg高纯度产物。接下来，通过核磁共振波谱分析，用brukeravance iii 400mhz spectrometer(bruker biospin,karlsruhe,germany)收集数据，1h谱检测频率为400mhz，
13
c谱为101mhz。生成的产物与文献所报道的莱鲍迪苷d2一致(图5，图6)。
[0058]
实施例5糖基转移酶和蔗糖合酶重组质粒及重组菌株的构建
[0059]
从genbank中下载来源于拟南芥的蔗糖合酶atsusy氨基酸序列(登录号:np_001031915)以及其核酸序列(登录号:nm_001036838.2)，由亦欣生物科技有限公司进行大肠杆菌偏好的密码子优化及基因合成。将编码蔗糖合酶基因atsusy连接至pacycduet-1的多克隆酶切位点，构建重组质粒pacycduet-1-atsusy，将所得质粒进行测序鉴定，并与pet-21b( )-ugt94d1共转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，采用含有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的lb固体平板(10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/lnacl，20g/l琼脂粉)进行筛选，得到重组菌株e.coli bl2l(de3)ugt94d1-atsusy。
[0060]
实施例6糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应细胞裂解液的制备
[0061]
将实施例5中构建的重组菌株e.coli bl2l(de3)ugt94d1-atsusy接种于添加含有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的的5l 2
×
yt培养基中，37℃、135rpm下振荡培养。待菌体生长至od
600
值为0.6-0.8时，降温至18℃，向其中添加终浓度为0.2mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，继续在18℃诱导蛋白质表达8h后，7000
×
g离心7min，收集菌体，菌体用裂解缓冲液(100mm k2hpo
4-kh2po4(kpi)ph 8.0，100mmnacl)洗涤三次然后重悬。细胞用高压匀浆机破碎。立即用40000
×
g离心30min，除去细胞碎片。取上清即获得偶联反应细胞裂解液。并进行蛋白胶检测。
[0062]
结果如图7所示，结果显示糖基转移酶和蔗糖合酶都能够良好表达。细胞裂解液中蛋白浓度利用nano-drop 2000uv-vis分光光度计进行测定。制备的细胞裂解液进行分装后-80℃保存，或直接用于偶联反应。
[0063]
实施例7 ph对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响
[0064]
将糖基化偶联反应体系置于不同ph值的缓冲液中进行反应，测定ph对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响，选择的缓冲液为100mmol/l kpi ph 5.5-8.0，100mmol/l nacl；100mmol/l tris-hcl ph 8.0-9.0，100mmol/l nacl和100mmol/l glycine-naoh ph9.0-11.0，100mmol/lnacl。
[0065]
将按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，糖基化偶联反应体系为1ml，其中含有40mg/ml偶联反应细胞裂解液、10mmol/l莱鲍迪苷a、200mmol/l蔗糖和5％dmso(v/v)，缓冲液；35℃条件下反应6h。反应结束后，加入5倍体积甲醇终止反应，然后再加入甲醇稀释6倍，20000
×
g离心5min，0.22μm滤膜进行抽滤后，uplc进行检测分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷d2的产率，结果显示当缓冲液为100mmol/lkpi ph 8.0，100mmol/lnacl时，莱鲍迪苷d2的产率可以达到50％以上(图8)。
[0066]
实施例8温度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响
[0067]
将糖基化偶联反应体系置于不同温度(20～45℃)中进行反应，测定温度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
[0068]
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为1ml，其中含有40mg/ml蛋白裂解液、10mmol/l莱鲍迪苷a、200mmol/l蔗糖、10％dmso(v/v)和100mmol/lkpi ph 8.0，100mmol/lnacl，反应6h。反应结束后，加入5倍体积甲醇终止反应，然后再加入甲醇稀
释6倍，20000
×
g离心5min，0.22μm滤膜进行抽滤，uplc进行检测分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷d2的产率，结果显示当温度在35℃时，莱鲍迪苷d2的产率可以达到50％以上(图9)。
[0069]
实施例9 dmso浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响
[0070]
将糖基化偶联反应体系中添加不同浓度的dmso(5％-25％(v/v))中进行反应，测定dmso浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
[0071]
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为1ml，其中含有40mg/ml蛋白裂解液、10mmol/l莱鲍迪苷a、200mmol/l蔗糖、dmso(5％-25％(v/v))和100mmol/l kpi ph 8.0，100mmol/lnacl，35℃条件下反应6h。反应结束后，加入5倍体积甲醇终止反应，然后再稀释6倍，20000
×
g离心5min，0.22μm滤膜进行抽滤，uplc进行检测分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷d2的产率，结果显示当dmso浓度在10％(v/v)时，莱鲍迪苷d2的产率可以达到50％以上(图10)。
[0072]
实施例10蔗糖浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应的影响
[0073]
将糖基化偶联反应体系中添加不同浓度的蔗糖(50-800mmol/l)中进行反应，测定蔗糖浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
[0074]
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为1ml，其中含有40mg/ml蛋白裂解液、10mmol/l莱鲍迪苷a、蔗糖(50-800mmol/l)、10％(v/v)dmso和100mmol/l kpi ph 8.0，100mmol/lnacl，35℃条件下反应6h。反应结束后，加入5倍体积甲醇终止反应，然后再稀释5倍，20000
×
g离心5min，0.22μm滤膜进行抽滤，uplc进行检测分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷d2的产率，结果显示当蔗糖浓度为200mmol/l时，莱鲍迪苷d2的产率可以达到50％以上(图11)。
[0075]
实施例11莱鲍迪苷a浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应底物的影响
[0076]
将糖基化偶联反应体系中添加不同浓度的莱鲍迪苷a(1-50mmol/l)中进行反应，测定蔗糖浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
[0077]
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为1ml，其中含有40mg/ml蛋白裂解液、莱鲍迪苷a(1-50mmol/l)、200mmol/l蔗糖、10％(v/v)dmso和100mmol/l kpi ph 8.0，100mmol/lnacl，35℃条件下反应6h。反应结束后，加入5倍体积甲醇终止反应，然后再稀释5倍，20000
×
g离心5min，利用0.22μm滤膜进行抽滤，uplc进行检测分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷d2的产率，结果显示在底物浓度为10mmol/l时，以50.66％的产率获得5.67g/l的莱鲍迪苷d2(图12)。
[0078]
实施例12反应时间对糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应的影响
[0079]
将糖基化偶联反应体系反应不同的时间(0-24h)，测定蔗糖浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
[0080]
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为20ml，其中含有40mg/ml蛋白裂解液、10mmol/l莱鲍迪苷a、400mmol/l蔗糖、10％(v/v)dmso、100mmol/lkpi ph8.0、100mmol/lnacl，35℃条件下反应，反应时间优化范围为0-24h。反应结束后，加入5倍体积甲醇终止反应，然后再稀释5倍，20000
×
g离心5min，0.22μm滤膜进行抽滤后进行超高效液相色谱(uplc)进行检测分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷d2的产率，结果显示最终在反应24h时，以10mmol/l莱鲍迪苷a浓度时，以94.66％的产率获
得10.69g/l的莱鲍迪苷d2(图13)。
[0081]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。