一种羽叶丁香倍半萜合酶及其应用

1.本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种羽叶丁香倍半萜合酶及应用。


背景技术：

2.羽叶丁香(syringa pinnatifolia hemsl.)为蒙药山沉香的基原植物，其去皮干燥后的根、茎及粗枝作为山沉香药材使用。由于羽叶丁香生长的缓慢性和生态资源的脆弱性，野生羽叶丁香于上世纪被列为珍稀保护物种，其资源短缺、药材供应明显不足。
3.羽叶丁香的化学研究表明，倍半萜类成分是山沉香药材的重要药效成分，对抗心肌缺血具有良好的活性。因此，采用生物合成的方法，对羽叶丁香倍半萜类成分进行体外合成，对羽叶丁香野生资源保护具有重要意义，同时对其羽叶丁香倍半萜生物合成的研究，也对丁香属植物挥发性成分合成的分子机制提供基础数据。然而，目前有关羽叶丁香倍半萜生物合成相关的研究尚未见报道。
4.反式橙花叔醇倍半萜具有柔和的花香气，天然存在于芳香植物(如羽叶丁香)的挥发油中，可以作为调味剂、香水，也可用于配制玫瑰型和紫丁香型香精，具有较好的定香作用。除此之外，反式橙花叔醇还可以用作洗涤剂和清洁剂的添加剂。同时，研究也发现，反式橙花叔醇具有丰富的药理活性，如抗氧化、抗真菌、抗癌和抗微生物的活性等。然而，关于羽叶丁香中反式橙花叔醇的生物合成研究尚未见报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何合成羽叶丁香开链倍半萜或如何在体外生产反式橙花叔醇。
6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的下述任一种应用：
7.p1、所述蛋白质在生产山沉香倍半萜中的应用，
8.p2、所述蛋白质在制备生产山沉香倍半萜产品中的应用；
9.所述蛋白质可为如下a1)、a2)、a3)或a4)的蛋白质：
10.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质，
11.a2)氨基酸序列是序列表中序列3的的蛋白质，
12.a3)在a1)或a2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
13.a4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
14.上述蛋白来自于羽叶丁香的新鲜茎段，由578个氨基酸残基组成，预测蛋白分子量约66.42kda。
15.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
16.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的
蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
17.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
18.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
19.为了解决上述技术问题，本发明还提供了蛋白质在作为山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶或在制备反式橙花叔醇中的应用。所述蛋白质可为上文所述的蛋白质。
20.与上文所述的蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
21.f1、所述生物材料在生产山沉香倍半萜中的应用，
22.f2、所述生物材料在制备生产山沉香倍半萜产品中的应用；
23.所述生物材料可为下述d1)至d6)中的任一种：
24.d1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；
25.d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；
26.d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；
27.d4)含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；
28.d5)促进或提高上文所述蛋白质表达的核酸分子；
29.d6)含有d5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
30.上述应用中，d1)所述核酸分子可为如下d1)、d2)或d3)所示的所述蛋白质的编码基因：
31.d1)编码序列是序列表中序列2的cdna分子或dna分子；
32.d2)核苷酸是序列表中序列4的cdna分子或dna分子，
33.d3)与d1)或d2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
34.上述生物材料中，d2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上文所述蛋白质的dna。所述表达盒还可包括表达上述任意一种蛋白的核酸分子所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达上述任一种蛋白质。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与编码蛋白质的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白质表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包
括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内蛋白质的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白质的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mrna非翻译区。前导序列可操作连接于编码蛋白质的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白质氨基端的氨基酸序列，能引导编码蛋白质进入细胞分泌途径。能引导表达后的蛋白质进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节蛋白质表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码蛋白质的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
35.本发明还涉及包含本发明编码上述任一种蛋白质的核酸分子、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。制备表达载体时，可使编码上述任一种蛋白的核酸分子位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。重组表达载体可以是任何便于进行重组dna操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部dna的两个或多个载体或质粒，或转座子。所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fehrlich,1978，美国国家科学院学报75：1433)。可以向宿主细胞插入1个以上拷贝的本发明编码上述任一种蛋白质的核酸分子以提高该基因产物的产量。该核酸分子的拷贝数增加可以通过将该核酸分子的至少1个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸分子一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸分子的细胞。用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
36.术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对dna序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导蛋白质的表达。
37.上文所述的蛋白质和/或上文所述的生物材料也属于本发明的保护范围。
38.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备山沉香倍半萜反式橙花叔醇的
方法。所述方法可包括如下步骤：将上文所述蛋白质作为山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶tps2对底物法尼焦磷酸铵盐fpp进行催化，得到所述山沉香倍半萜反式橙花叔醇。
39.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶的方法。所述方法可包括如下步骤：将上文所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶。
40.上文所述方法中，所述将上文所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达，包括将上文所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶。
41.上文所述表达可为诱导表达。上文所述方法中，所述原核微生物可为大肠杆菌。
42.含有上文所述的蛋白质和/或上文所述的生物材料的下述任一种产品也属于本发明的保护范围：
43.h1、生产山沉香倍半萜的产品；
44.h2、生产山沉香倍半萜反式橙花叔醇的产品；
45.h3、制备生产山沉香倍半萜的产品；
46.h4、生产山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶的产品。
47.本发明在羽叶丁香山沉香中发现了tps2蛋白，并证明tps2蛋白为山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶(trans-nerolidol synthase)，能够对底物法尼焦磷酸铵盐fpp进行催化，得到山沉香反式橙花叔醇合酶型倍半萜。本发明填补了羽叶丁香开链倍半萜生物合成的研究空白，为体外生产山沉香倍半萜提供了基础，具有较好的研究开发潜能与应用前景。
附图说明
48.图1为羽叶丁香rna电泳图，其中m代表dna marker，1-2为羽叶丁香rna。
49.图2为羽叶丁香倍半萜合酶基因tps2的pcr扩增电泳图，其中m代表dna marker，1-2为tps2的pcr扩增电泳图。
50.图3为羽叶丁香重组表达质粒pmal-c2x-tps2诱导表达产物检测。图中数字代号分别表示不同表达条件，1和8：诱导空载全菌液，2和9：诱导空载上清，3和10：诱导空载沉淀，4和11：未诱导pmal-c2x-tps2全菌液，5和12：诱导pmal-c2x-tps2全菌液，6和13：诱导pmal-c2x-tps2上清，7和14：诱导pmal-c2x-tps2沉淀，其中1～7为16℃培养，8～14为30℃培养。箭头所标条带为tps2蛋白条带。
51.图4为羽叶丁香tps2蛋白催化fpp产物的提取峰后离子流图。红色箭头表示目的产物，黑色箭头表示底物。a代表pmal-c2x空载16℃诱导的对照图；b代表pmal-c2x空载30℃诱导的对照图；c代表pmal-c2x-tps2重组质粒16℃诱导tps2后的催化产物离子流图；d代表pmal-c2x-tps2重组质粒30℃诱导tps2后的催化产物离子流图。
52.图5为羽叶丁香tps2催化产物反式橙花叔醇(trans-nerolidol)的质谱图及标准品质谱图。a：tps2粗酶催化产物质谱图；b：标准品反式橙花叔醇质谱图。横坐标为离子的质荷比(m/z)值，纵坐标为离子流的强度。
具体实施方式
53.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
54.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
55.实施例1、羽叶丁香倍半萜合酶基因tps2的原核表达
56.羽叶丁香倍半萜反式橙花叔醇合酶tps2(eremophilene synthase)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，tps2的cdna的cds序列如序列表中序列2所示的核苷酸序列。
57.1.pmal-c2x-tps2表达载体构建
58.羽叶丁香倍半萜合酶基因tps2全长克隆见实施例3。以tps2基因的cds序列(序列表中序列2)的为模板，使用nebcutter 2.0在线软件分析并选择在目标表达载体中存在而插入基因中不存在的酶切位点，设计带酶切连接位点的引物，在基因全长两端增加接头。tps2设计酶切位点为ecori和sali，使用的引物如下。下划线标序列为酶切位点识别序列。
[0059][0060]
tps2带接头基因的反应体系如下：
[0061][0062]
tps2的pcr程序如下，经过pcr得到的pcr产物为带有ecori和sali的酶切识别位点的tps2的cds序列：
[0063]
[0064]
载体线性化使用限制性内切酶ecori和sali对空白pmal-c2x载体(本实验室保存，公众可从申请人处获得，以重复本实验。相关文献：su p,et al.identification and functional characterization of diterpene synthases for triptolide biosynthesis from tripterygium wilfordii.plant journal,2018,93:50-65.)进行双酶切，得到线性化的pmal-c2x载体。同时使用限制性内切酶ecori和sali对上述添加酶切识别位点的tps2基因的cds序列进行双酶切，得到双酶切后的目的基因片段，酶切体系如下。其中tps2所用到后续连接用载体所用内切酶为ecori和sali，酶切条件均为37℃酶切3h。
[0065][0066]
使用uni seameless assembly kit将双酶切后的目的基因片段和线性化pmal-c2x载体进行连接。在50℃下反应15min，反应结束后置于冰上冷却。最后得到重组表达载体pmal-c2x-tps2。重组表达载体pmal-c2x-tps2是用序列表中序列2的第1-1734位核苷酸替换pmal-c2x的ecori和sali识别位点间的片段(小片段)，保持pmal-c2x的其它序列不变，得到tps2基因重组表达载体。pmal-c2x-tps2重组载体含有带mbp标签序列的重组tps2基因tps2-mbp(序列表中序列4)，能表达序列表中序列3所示的带有mbp标签的重组tps2蛋白tps2-mbp。
[0067]
2.原核表达tps2蛋白
[0068]
将重组基因表达载体pmal-c2x-tps2扩大培养后提取质粒pmal-c2x-tps2，随后将重组质粒pmal-c2x-tps2转化进入表达感受态细胞，转化所用细胞为大肠杆菌transetta(de3)(北京全式金生物技术有限公司，cd801-02)感受态细胞，得到重组大肠杆菌de3/pmal-c2x-tps2。同时将pmal-c2x空载质粒转化transetta(de3)感受态细胞，得到重组空载大肠杆菌de3/pmal-c2x。
[0069]
使用含氨苄抗生素的lb培养液以1:50的比例扩大培养重组大肠杆菌de3/pmal-c2x-tps2菌液。在37℃，200rpm下培养约3h，测定600nm下od值在0.6至1.0之间，得到未诱导pmal-c2x-tps2全菌液和未诱导空载全菌液。分别向未诱导pmal-c2x-tps2全菌液和未诱导空载全菌液中加入iptg至终浓度为500μm，然后在相同温度下过夜培养(12h)，温度取16℃和30℃两种，转速均保持200rpm进行诱导表达，收集发酵液，将重组大肠杆菌de3/pmal-c2x-tps2诱导表达得到的发酵液命名为诱导pmal-c2x-tps2全菌液，将重组大肠杆菌de3/pmal-c2x诱导表达得到的发酵液命名为诱导空载全菌液。
[0070]
将诱导pmal-c2x-tps2全菌液和诱导空载全菌液4℃下以5000rpm转速离心10min，弃取上清后以灭菌水再次清洗并离心，确保培养基清除干净。随后加入500μl的pbs缓冲液，混匀后于冰上超声破碎，30％能量下超声3s，暂停7s，总共10min。超声破碎后保留一部分作
为全菌液，其余在4℃下以12000rpm离心20min，吸取上清液，分别得到诱导pmal-c2x-tps2上清和诱导空载上清；沉淀部分加入和上清相同体积的pbs缓冲液混匀分别得到诱导pmal-c2x-tps2沉淀和诱导空载沉淀，进行下述sds-page。
[0071]
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
[0072]
首先按照以下配方配制sds-page分离胶，在夹紧的玻璃板中加入适量的分离胶，加水封住避免干燥和使胶面平滑；在分离胶凝固后除去水并配制sds-page浓缩胶，加至已凝固的分离胶上方，插入梳子，凝固后备用。
[0073]
sds-page分离胶配方
[0074][0075]
sds-page浓缩胶配方
[0076][0077]
在步骤2所得重组菌液和空载菌液的沉淀混合液中各取一部分，分别加入sds-page buffer，混匀后沸水煮5min，随后取液上样。先在80v下运行30min，随后改为120v运行1h。取出胶后使用考马斯亮蓝r250染液进行染色2h，脱色约4h，照相保存分析(图3)。其中tps2蛋白预测大小为66kda，重组蛋白tps2-mbp预测大小为109kda，图3中结果显示，诱导pmal-c2x-tps2全菌液、诱导pmal-c2x-tps2上清和诱导pmal-c2x-tps2沉淀中均检测到重组蛋白tps2-mbp(条带大小约为100kda，与预测值接近)；而诱导空载全菌液、诱导空载上清和诱导空载沉淀中均未检测到重组蛋白tps2-mbp条带。
[0078]
实施例2、羽叶丁香倍半萜合酶基因tps2的功能验证
[0079]
1.酶促反应
[0080]
酶促反应体系共400μl，其中实施例1中获得的诱导pmal-c2x-tps2上清液(简称tps2粗酶)282μl，以法尼焦磷酸铵盐(farnesyl pyrophosphate ammonium salt，fpp)(美国sigma-aldrich公司，f6892-1vl)为底物(终浓度50μm)，加入hepes(美国sigma-aldrich公司，h7006)(ph7.2)至50mm，其余包括氯化镁至7.5mm，hepes(ph7.2)终浓度50mm，甘油
5％，以及5mm的dtt(dithiothreitol)(美国promega公司，v3151)。上述体系混匀后于上方加加500μl正己烷覆盖，防止挥发性的倍半萜产物逸失，于30℃下水浴反应1h，得到酶促反应催化产物(tps2粗酶催化产物)。反应完成后涡旋混匀，10000rpm离心5min，取上层正己烷有机相进行成分测定。同时使用加入实施例1中的诱导空载上清至其他物质和含量相同的酶促反应体系作为对照，得到酶促反应催化产物。
[0081]
2.产物检测
[0082]
酶促反应催化产物在使用0.22μm聚四氟乙烯有机滤膜过滤后使用gc-ms进行测定，条件为初始温度100℃，保持3.5min，以20℃/min的速度升至170℃，随后以0.5℃/min的速度缓慢升至180℃，再以25℃/min的速度上升至250℃，最后以5℃/min速度上升至300℃，保持5min。进样口温度为280℃，离子源为ei，电子能量70ev，离子源温度230℃，扫描范围为40～400m/z。空载体菌液与含有重组蛋白tps2-mbp的重组菌液分别催化fpp后的产物提取峰后离子流图见图4，与空载相对照(图4中a和b)，tps2酶在16℃和30℃下催化均成功获得目的产物(图4中c和d)，其催化产物在9.42min具有单峰，且产物较为单一。进一步根据质谱图可知，tps2-mbp催化生成的倍半萜产物(图5中a)与反式橙花叔醇(trans-nerolidol)的质谱图比对上(图5中b)，因此tps2编码酶tps2的功能为催化产生反式橙花叔醇，可命名为反式橙花叔醇合酶。
[0083]
实施例3、羽叶丁香倍半萜合酶基因tps2全长克隆
[0084]
1.羽叶丁香rna的提取
[0085]
在2ml离心管中加入1ml的trizol试剂，随后在液氮下将羽叶丁香新鲜的茎段样品磨为细粉末，并迅速加至已加trizol试剂的离心管中，涡旋混匀。在12000rpm转速下离心10min，取上清液至另一离心管中。在离心管中加入约上清液体积1/5的氯仿，剧烈振荡15s，在室温下放置2～3min，随后于12000rpm下离心15min。吸取上层水相至另一离心管中，在该离心管中加入水相体积一半的异丙醇，颠倒混匀并室温放置10min，之后以12000rpm转速离心10min。离心完成后弃去上清液，可见管底有少量白色沉淀。使用75％乙醇洗涤离心管内管盖、管壁和沉淀，并于12000rpm离心5min，弃去上清，之后将前一步中的75％浓度乙醇改为无水乙醇，重复一遍。最后吹干无水乙醇以防止下一步反应受到影响，并用1％浓度琼脂糖凝胶电泳检测rna完整度(图1)。
[0086]
2.羽叶丁香cdna反转录
[0087]
使用移液枪吸取10μl提取所得的rna，并加入2μl的oligo(dt)
18
，离心混匀后于70℃反应10min，之后冰浴2min。随后在上一步所得溶液中加入4μl的5
×
reverse transcriptase m-mlv buffer，1μl的recombinant rnase inhibitor，2μl的dntp，1μl的reverse transcriptase m-mlv(rnase h-)，于42℃反应60min，70℃保持15min，最后所得cdna于-20℃冰箱保存。
[0088]
3.羽叶丁香tps2全长序列的克隆
[0089]
(1)tps2全长克隆所用引物为：
[0090]
上游引物：5
’‑
acgtcttctaattaataagcatagttctttatctca-3’下游引物：5
’‑
acagatttcgctgcatctagtca-3’[0091]
(2)tps2全长克隆所用的反应体系为：
[0092][0093]
(3)tps2全长克隆所用的pcr反应程序为：
[0094][0095][0096]
将pcr产物使用琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测，将约1600～1700bp的目的pcr产物条带采用试剂盒thermo scientific genejet gel extraction kit进行胶回收得到纯化产物，即纯化后的tps2基因的全长序列(cds)(序列表中序列2)，其翻译后的蛋白序列为(序列表中序列1)。
[0097]
(4)载体连接与转化
[0098]
使用peasy-blunt zero cloning kit(北京全式金生物技术有限公司，cu101)进行载体连接。取用4μl步骤(3)纯化得到的tps2基因的cds，加1μl的peasy-blunt zero cloning vector，轻轻混匀后再室温下反应30min得到tps2与克隆载体的连接产物，随后将离心管置于冰上。事先将大肠杆菌trans1-t1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，cd501)在冰上化冻，所用离心管也放于冰上降温，待感受态细胞刚化冻时迅速按50μl每管的量分装，并将上一步的tps2与克隆载体的连接产物加入感受态细胞中，混匀后冰浴30min，随后42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min。之后在转化进细胞后的产物中加入450μl的无氨苄的液体lb培养基，200rpm、37℃于摇床培养1h。取出后2000rpm离心4min，将上清培养基吸去300μl，剩余则混匀后涂布在含氨苄的lb固体培养基上，37℃过夜培养。
[0099]
(5)单克隆培养与验证
[0100]
将步骤(4)过夜培养的培养基上长出的单克隆菌落挑取后在1ml含氨苄的lb培养基中培养，200rpm，37℃培养6h，取1μl菌液进行pcr验证，体系如下：
[0101][0102]
菌液pcr反应程序：
[0103][0104][0105]
确定菌液的pcr产物为目标大小条带后进行sanger一代测序，最终得到含有tps2基因载体的阳性单克隆菌落，阳性单克隆菌落的pcr产物琼脂糖凝胶电泳图见图2。测序结果显示，阳性单克隆菌液含有序列表中序列2的序列全长，即山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶tps2(eremophilene synthase)编码基因的cds序列，其对应的山沉香倍半萜反式橙花叔醇合酶tps2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1。tps2蛋白预测大小为66kda。
[0106]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。