一种工程化囊泡的制备方法及其应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种工程化囊泡的制备方法及其应用。


背景技术：

2.细胞外囊泡是细胞间交流的重要介质。近年来细胞外囊泡在心血管疾病、免疫疾病的治疗中发挥着重要作用，但其根本机制尚未完全阐明。研究表明，细胞外囊泡中含有大量的内容物，主要包括蛋白质、细胞因子、核酸等，其在被受体细胞内吞后通过对其功能调节来发挥作用。凋亡是一种生理性、程序性、主动性的死亡方式，会产生大量凋亡外囊泡(apototic extracellular vesicles,apoevs)。机体每天大约有500亿至700亿的细胞发生凋亡，产生大量apoevs参与整个机体的新陈代谢，物质和信息交流，维持机体的稳态和平衡。研究细胞凋亡和apoevs对于理解组织器官的损伤修复和稳态，理解死亡的意义和生命的循环均有重大意义。
3.随着纳米科技的快速发展，其在生物医药领域的作用也日渐凸显。目前，纳米医药在恶性肿瘤、感染性疾病、糖尿病等多种复杂疾病的诊断与治疗方面取得了较大发展。
4.纳米载药系统由于其独特的优势，例如epr效应、表面可偶联靶向分子、能实现药物共输送等，对疾病的靶向治疗十分有利。但目前的纳米载药系统往往合成工艺复杂，并且由于其“non-self”特点而具有潜在的毒性及副作用。
5.现有技术中公开的关于生物膜包裹外源物质形成工程化囊泡的方法通常需要用超声处理，或者电穿孔等方式，且通常是以生物膜作为起始原料。例如专利申请cn109750068a公开了一种外泌体包裹的外源microrna的方法，其是先从细胞培养液中提取出外泌体，然后再将mirna转染进入外泌体中，从而得到包裹microrna的外泌体。例如专利申请cn109966506a公开了从细胞上清液中提取出外泌体，然后通过电穿孔仪把mirna-140电转到外泌体中，使外泌体包裹上mirna，运载mirna-140。例如邹帅军等公开了用超声处理共孵育的纳米颗粒和生物膜如细胞膜，从而形成细胞膜包裹纳米颗粒的结构(邹帅军，等.细胞膜包裹纳米颗粒的研究进展.国际药学研究杂志,2018.)。


技术实现要素：

6.一些实施方案中，本发明提供了一种制备包裹有添加物的囊泡的制备方法，以细胞作为起始材料接触添加物，施加凋亡因素诱导细胞凋亡，添加物于施加凋亡因素前、或者施加凋亡因素过程中、或者施加凋亡因素后与所述的细胞直接接触，孵育形成包裹有添加物的囊泡。
7.一些实施方案中，所述的孵育过程不施加超声。
8.一些实施方案中，所述的添加物含有药物和纳米材料中的一种或几种。
9.一些实施方案中，所述药物包括化学药物、生物药物、天然药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物中的任意一种或几种。
10.一些实施方案中，所述生物药物包括rna、蛋白质和dna中的一种或多种。
11.一些实施方案中，所述生物药物为mirna。
12.一些实施方案中，所述纳米材料为载药纳米载体。
13.一些实施方案中，所述药物包括激素类药物，酶类药物，抗癌药物，抗炎药物，抗肝病的药物，但又不限于此，还可以包括其他的一些信号通路激活剂或抑制剂。
14.一些实施方案中，当所述的添加物为纳米材料时，在细胞凋亡后添加。
15.一些实施方案中，所述添加物在细胞凋亡后2-6小时添加。
16.一些实施方案中，所述添加物与细胞共孵育3-7小时。
17.一些实施方案中，当所述的添加物为mirna时，在细胞凋亡前添加。
18.一些实施方案中，所述mirna在细胞前18-24小时添加。
19.一些实施方案中，所述mirna与细胞共孵育6-9小时。
20.一些实施方案中，本发明提供了一种工程化囊泡的制备方法，所述方法包括先通过外加因素诱导细胞凋亡，再向细胞中添加纳米材料。
21.一些实施方案中，所述方法包括在细胞处于正常存活期间通过外力诱导细胞凋亡。
22.一些实施方案中，所述外加因素包括化学因素或物理因素。
23.一些实施方案中，所述外加因素包括添加凋亡诱导剂、紫外线照射、饥饿处理、热应力处理。
24.一些实施方案中，所述凋亡诱导剂包括星形孢菌素。
25.一些实施方案中，所述方法包括在细胞处于正常存活期间添加星形孢菌素诱导2-6小时，之后加入纳米载体共孵育3-7小时。
26.一些实施方案中，添加星形孢菌素诱导3-6小时。
27.一些实施方案中，添加星形孢菌素诱导5-6小时。
28.一些实施方案中，添加星形孢菌素诱导6-9小时。
29.一些实施方案中，共孵育2-7小时。
30.一些实施方案中，共孵育3-4小时。
31.一些实施方案中，所述纳米材料包括plga、pla、壳聚糖、明胶、二氧化硅无机纳米材料和金属纳米材料中的一种或几种。
32.一些实施方案中，所述纳米材料为纳米颗粒，所述纳米颗粒包括纳米球和纳米囊。前者是药物均匀分散于成核的实心基质中，或与纳米颗粒共价连接，而后者是药物被高分子膜包裹在空腔中。但又不限于此。
33.一些实施方案中，构建载药工具的常用纳米颗粒包括天然纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒等。
34.一些实施方案中，所述纳米材料包括有机纳米材料、有机纳米材料、金属纳米材料和磁性纳米材料中的一种或多种。
35.一些实施方案中，天然形成的纳米颗粒包括脂蛋白、病毒和铁蛋白等常见种类。
36.一些实施方案中，聚合物纳米颗粒种类较多，如聚乳酸乙醇酸〔poly(lactic-co-glycolic acid)，plga〕、聚乳酸(polylactic acid，pla)、壳聚糖、明胶、二氧化硅无机纳米材料和金属纳米材料等。
37.一些实施方案中，所述有机纳米材料包括plga、pla、聚碳酸酯(pc)、壳聚糖、明胶。
一些实施方案中，无机纳米颗粒主要有金、硅、铁、铜等及其化合物等。
38.一些实施方案中，所述无机纳米材料包括介孔二氧化硅。
39.一些实施方案中，所述金属纳米材料包括金、银。
40.一些实施方案中，所述磁性纳米材料包括fe3o4。
41.一些实施方案中，发明人研究发现，先诱导细胞凋亡后加入纳米颗粒，观察到大量纳米粒聚集在凋亡细胞内。同时，比较正常hbmscs与凋亡hbmscs胞内的纳米颗粒数量发现，凋亡细胞明显摄取更多的纳米颗粒，显现出更强的对纳米颗粒的主动摄取能力。在活细胞成像仪器下长期动态观察凋亡hbmscs的摄取，组装和释放的过程，可见凋亡状态的细胞可将摄取的纳米颗粒组装在ievs中进行释放，形成工程化ievs。这种释放出来的工程化ievs中，由于ievs的膜密度低于纳米粒，完全包裹于纳米颗粒的外周。本发明制备的这种囊泡不仅保留了完整的囊泡膜结构，且可以同时保留ievs的生物学功能，在发挥ievs本身疾病治疗效果的同时，还可以包裹一些特定疾病的药物，从而可以靶向地达到病灶，发挥组合物的药效，具体很好的现实意义。
42.一些实施方案中，所述纳米材料包括载药纳米载体。
43.在一些实施方案中，本发明利用星孢菌素(staurosporine,sts)在体外诱导间充质干细胞凋亡，可获得高效且产量稳定的ievs，且ievs在多种疾病治疗中均已体现出优秀的应用价值。以ievs在为载体构建的工程化ievs成为一种极具开发和研究价值的生物工具。
44.一些实施方案中，所述药物包括激素类药物，酶类药物，抗癌药物，抗炎药物，抗肝病的药物，但又不限于此，还可以包括其他的一些信号通路激活剂或抑制剂。
45.一些实施方案中，所述细胞包括体细胞和干细胞。
46.一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
47.一些实施方案中，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱。
48.一些实施方案中，所述工程化囊泡为纳米载药体系。
49.一些实施方案中，本发明提供了一种所述的工程化囊泡在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
50.一些实施方案中，所述肿瘤为多发性骨髓瘤。
51.一些实施方案中，所述肿瘤为人多发性骨髓瘤。
52.本发明利用细胞外排纳米载药系统，首次提出利用细胞凋亡的过程，将ievs包裹在纳米载体表面这一制备思路。现有的纳米载药系统膜包裹技术主要通过破碎生物膜后与纳米载药系统共同挤压穿过滤膜的方法得到，这种方法容易导致细胞膜结构的损伤，进而导致膜表面功能蛋白等的损失，这对于纳米载药系统的稳定性、靶向性能等是不利的。而本发明中的制备方法更加温和，能够最完整的保留囊泡膜的完整结构，从而发挥更佳的功能。
53.一些实施方案中，本发明提供了一种工程化囊泡，由以上所述的方法获得。
54.一些实施方案中，所述工程化囊泡为纳米载药体系。
55.一些实施方案中，本发明提供了所述的工程化囊泡在制备纳米载药系统中的应用。
56.一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，包括诱导性囊泡和纳米材料以及，纳
米材料或mirna中的一种或两种。
57.本发明中的ievs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(induced extracellular vesicles,ievs)或者凋亡外囊泡(apototic extracellular vesicles,apoevs)。
58.在一些实施例中，所述诱导性囊泡的制备方法包括步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)收集间充质干细胞的培养基上清；(3)从步骤(2)中的培养基上清中分离出囊泡。
59.在一些实施例中，所述步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。
60.在一些实施例中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
61.在一些实施例中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
62.在一些实施例中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟；或者所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟；或者所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟；或者所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟；或者所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。在一些实施例中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟；或者所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟。在一些实施例中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟，或者所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟；或者所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟。
63.在一些实施例中，所述间充质干细胞的代数可以为第2～5代，但又不限于此。
64.在一些实施例中，所述诱导性囊泡的直径可以为0.03-10μm。在一些实施例中，所述诱导性囊泡的直径可以为0.03-6μm；可以是0.03-4.5μm。
65.在一些实施例中，所述诱导性囊泡具有标志物syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物syntaxin 4。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物syntaxin 4的表达高于mscs或外泌体。在一些实施例中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的3-6倍。在一些实施例中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的3.5-5倍。在一些实施例中，所述标志物syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中syntaxin 4的表达量的4.45倍。在一些实施例中，所述标志物还包括annexin v、flotillin-1、cadherin 11和integrin alpha 5中的一种或多种。在一些实施例中，所述标志物为syntaxin 4、annexin v、flotillin-1、cadherin 11和integrin alpha 5的组合。在一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5。在一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量高于mscs或外泌体。在一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量相
对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。在一些实施例中，所述囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。
66.本发明中所述诱导性囊泡与外泌体有本质的不同，例如与外泌体相比，本发明所述的诱导性囊泡ievs高表达syntaxin 4，以及其annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5的表达量明显高于外泌体。除了具有的标志物有差别之外，所述诱导性囊泡ievs在功能上或治疗效果上也呈现出有别于干细胞和其他的细胞外囊泡(如外泌体)的特性。例如ievs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于外泌体。例如，间充质干细胞可以治疗损伤性肝纤维化，然而，诱导性囊泡对这些疾病并不能实现治疗效果。例如mscs能够治疗干燥综合征，而本发明所述的诱导性囊泡对干燥综合征无治疗效果。例如ievs治疗血友病小鼠的机制与ps和tf无关，而以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的ps和tf。
67.一些实施方案中，所述诱导性囊泡为在细胞处于正常存活时通过外加因素诱导凋亡而产生的囊泡。
68.一些实施方案中，所述外加因素包括添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法处理、或热应力法处理。
69.一些实施方案中，所述细胞包括包括体细胞和干细胞。
70.一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。
71.一些实施方案中，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜、肌腱。
72.一些实施方案中，所述纳米材料包括载药纳米载体。
73.一些实施方案中，所述纳米材料包括有机纳米材料、有机纳米材料、金属纳米材料和磁性纳米材料中的一种或多种。
74.一些实施方案中，所述有机纳米材料包括plga、pla、聚碳酸酯(pc)、壳聚糖、明胶。
75.一些实施方案中，所述无机纳米材料包括二氧化硅。
76.一些实施方案中，所述金属纳米材料包括金、银。
77.一些实施方案中，所述磁性纳米材料包括fe3o4。
78.一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，包括以上所述的工程化囊泡以及药学上可接受的辅料。
附图说明
79.图1为凋亡细胞主动摄取纳米颗粒的情况，使用pkh67膜染料标记ievs，plga纳米粒合成时已带有罗丹明b染料标签，观察ievs与plga纳米粒重合比例，初步判断嵌合ievs的合成效率。图1a为激光共聚焦显微镜观察到的实施例1获得的工程化囊泡的结果图。图1b为普通荧光显微镜下观察到的正常hbmscs与凋亡hbmscs胞内的纳米颗粒数量的比较的结果图。
80.图2为动态观察凋亡细胞形成工程化ievs的结果图。
81.图3为工程化ievs的合成效率及鉴定。图3a为流式检测工程化ievs的合成效率。图3b为通过荧光显微镜观察，可见较多嵌合了plga纳米粒的ievs，颜色重叠显示为黄色。图3c为透射电镜检测实施例1提取的ievs，可见高亮白色纳米粒包裹于密度稍低的膜结构中。
82.图4为工程化ievs的生物分布情况。
83.图5为凋亡细胞和正常细胞摄取mirna的情况。
84.图6为包裹mirna的ievs的荧光检测结果(左)以及流式检测包裹效率结果(右)。
85.图7为含有pc纳米粒的“嵌合ievs”的制备。图7a为凋亡u266主动摄取pc纳米粒。图7b为嵌合ievs”的合成效率。
86.图8为嵌合ievs诱导u266细胞凋亡的测试结果。图8a为各组u266细胞凋亡流式图。图8b为各组u266细胞凋亡比例。
87.图9为用流式细胞分析技术分析的mscs(106个mscs)产生的ievs数量统计结果。
88.图10a-图10f为ievs颗粒的直径检测：图10a为流式检测ievs的颗粒直径分布图；图10b为侧向散射光(ssc)分析ievs的散射光强，显示ievs颗粒直径分布；图10c为以bangs laboratories公司生产的标准化小颗粒微球分析ievs的散射光强，显示ievs的颗粒直径分布；图10d为透射电镜(tem)观察的ievs，显示ievs的颗粒直径分布；图10e为纳米粒子跟踪分析(nta)，显示ievs颗粒直径分布；图10f为纳米流式检测技术对ievs进行单囊泡水平的粒径检测，显示ievs的颗粒直径分布。
89.图11a-图11d为ievs的内容物分析：图11a为dia定量技术对mscs、mscs-exosomes、mscs-ievs蛋白组学定量分析结果；图11b为筛选ievs特异性高表达的蛋白绘制的热图；图11c为差异蛋白的go富集分析ievs表达annexin v，flotillin-1，cadherin 11，integrin alpha 5和syntaxin 4分子的结果；图11d为western blot验证mscs、mscs-exosomes、mscs-ievs表达annexin v,flotillin-1，cadherin 11，integrin alpha 5和syntaxin 4的结果。
90.图12为mscs来源ievs治疗硫代乙酸铵诱导的损伤性肝纤维化数据。a.肝病理组织学切片；b.脂肪性肝病评分。
91.图13为ievs治疗干燥综合症：a.ievs治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响；b.ievs治疗干燥综合症下颌下腺he染色结果；c.治疗干燥综合症对b细胞的影响。
92.图14为ievs在血友病a小鼠的体内促凝作用。
93.图15a-图15d为给血友病a小鼠注射ievs之后各种凝血因子水平的变化情况：图15a为凝血因子viii的变化情况；图15b为vwf因子的变化情况；图15c为组织因子(tf)的变化情况；图15d为凝血酶原的变化情况。
94.图16a-图16b为血友病a小鼠模型中，ievs分别进行ps和tf的封闭之后对ievs的体内治疗效果的影响情况。
95.图17为同种mscs来源的ievs和exosomes对血友病a小鼠治疗效果对比。
96.注：所述附图中，wt为野生型小鼠；ha组为血友病a小鼠模型；ha ievs为血友病a小鼠模型给予ievs治疗；ha ps-ievs为血友病a小鼠模型给予ps阴性ievs；ha tf-ievs为血友病a小鼠模型给予tf阴性ievs；ha exosomes为血友病a小鼠模型给予exosomes治疗。
具体实施方式
97.以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发
明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
98.在本文中，apoevs(或apoev)也可称为ievs或iev，又称诱导性囊泡。
99.本文中，“嵌合apoevs”或者“嵌合ievs”又称为工程化囊泡。
100.本发明实施例中的ievs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(induced extracellular vesicles,ievs)，iev同ievs。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞)正常存活时，被干预或诱导，使其凋亡产生的一类亚细胞产物。通常这一类亚细胞产物，具有膜结构，表达凋亡性标志物，部分包含有遗传物质dna。发明人发现诱导性细胞外囊泡是区分于细胞和常规细胞外囊泡(如外泌体等)的一类物质。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞，例如是非凋亡的细胞、非衰老的细胞、非老化而增殖停滞的细胞、非冻存后复苏的细胞、非发生恶变而异常增殖的细胞或非出现损伤的细胞等。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自细胞培养过程中，细胞接触融合80-100％的时候的细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自对数期细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自人或鼠组织来源的原代培养及其传代培养细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自已确立的细胞系或细胞株。在一些实施方式中，所述的前体细胞取自早期的细胞。
101.本文使用的“药物组合物”是指治疗有效量的药物以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅剂和/或载体。
[0102]“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由
……
组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。在本文中，所述纳米材料包括纳米脂质体、碳基纳米材料、硅基纳米材料、金属纳米材料、半导体量子点、上转换材料、以及聚合物纳米材料中的至少一种；所述碳基纳米材料包括氧化石墨烯、碳纳米管、纳米金刚石中的至少一种；所述硅基纳米材料包括多孔硅、介孔硅、硅点中的至少一种；所述金属纳米材料包括金纳米粒、银纳米粒、过渡金属纳米粒中的至少一种。
[0103]
在本发明的一些实施方案中，所述纳米材料为纳米颗粒材料，所述纳米颗粒材料的颗粒粒径在1-1000nm。
[0104]
本文中“纳米载体”也称“载药纳米载体”，在一些实施方案中，也为”纳米颗粒“，是指可负载药物活性成分形成尺寸在1～1000nm之间的微小粒子的有机或无机载体。在该尺度下，微粒会表现出一些独特的理化性质。合适粒径的纳米粒子在体内具有epr(高通透性和滞留)效应，可通过该效应被动靶向至肿瘤区域。因此，开发合适的纳米载药系统也是癌症治疗药物的一个热点。已开发出一系列纳米载体来向体内递送药物。纳米载体的粒径、亲疏水性、表面电荷、可变形性、靶向修饰等性质及负载药物可能会影响纳米粒子在体内传输过程中的命运及最终疗效。
[0105]
多种纳米载体可用于构成靶向递送组合物。如本领域技术人员所理解，纳米载体的特征，例如，尺寸，可取决于纳米载体的类型和/或用途以及本领域通常众所周知的其它
因素。合适的颗粒可为球体、椭圆体、扁平的、板形的、管状、立方体、长方体、卵形(oval)、椭圆形(ellipse)、圆柱体、锥体或角锥。合适的纳米载体的尺寸范围(例如，直径)可为约1nm至约1000nm，约10nm至约200nm，和约50nm至约150nm。
[0106]
合适的纳米载体可由多种本领域通常已知的材料制备。在一些实施方案中，纳米载体可包括一种物质或多种物质的任意组合，这些物质包括脂质、聚合物，或金属材料，如二氧化硅、金、氧化铁等。纳米载体的实例可包括但不限于脂质体、胶束、脂蛋白、脂质涂覆的泡囊、嵌段共聚物胶束、聚合物泡囊、囊泡、氧化铁颗粒、金颗粒、二氧化硅颗粒、树枝状大分子或量子点。
[0107]
在本发明中，“组合物”中的组分可以是混合的形式存在，也可以被分开包装。分开的包装的组分也可以含有其各自的佐剂。所述的佐剂是指在药学中，可辅助药物疗效的手段。对于组合物中的组分在分开包装的情况下，各个分开包装的组分可以是同时施用或者是以任意的前后顺序施用，其中患者先用一种药物治疗，然后再给以另一种药物。所述的患者是指哺乳动物受治疗者，尤其是人类。
[0108]
在本发明中，所述的“组合物”还可以是一种组分被另外一种组分包裹的形式存在。在一些实施方式中，在组合物中，所述的诱导性囊泡作为药物载体，将治疗或预防肝脏疾病的药物包裹在所述诱导性囊泡中，所述诱导性囊泡具有肝脏靶向性，从而将其所载的药物呈递至肝脏，从而达到治疗肝脏疾病的作用。
[0109]
本文使用的“药物组合物”是指治疗有效量的药物以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅剂和/或载体。本文中，“起始材料”是指用于与目标添加物进行直接接触的材料，以形成包裹有添加物的囊泡。
[0110]
本文中，pc指的是纳米材料聚碳酸酯(polycarbonate,pc)；人多发性骨髓瘤细胞(u266)。
[0111]
本文中的sts为星形孢菌素。本文中exosomes指的是外泌体。
[0112]
bmmscs(bone marrow mesenchymal stem cells)指的是骨髓间充质干细胞。
[0113]
本发明中，相应的试剂来源如下：青霉素/链霉素溶液(biosource；p303-100)；
[0114]
谷氨酰胺(biosource；p300-100)；地塞米松磷酸钠(sigma；d-8893)；α-mem(gibco；12571-063)；2-me(gibco；21985-023)。
[0115]
实施例1工程化囊泡的制备方法
[0116]
plga纳米颗粒按照本领域常规的方法合成，参考文献：nanoparticles coated with neutrophil membranes can effectively treat cancer metastasis(pmid:28075552)。
[0117]
装载有plga纳米粒的工程化囊泡具体制备步骤(实验组ievs)：
[0118]
准备1个10-cm dish，待人骨髓间充质干细胞(hbmscs)生长至90％时加入含1000nm sts的α-mem无血清培养基诱导6h：在诱导凋亡(加入sts)2h后加入50μg plga纳米粒继续共孵育4h，提取ievs，获得工程化囊泡(又称“嵌合ievs)。
[0119]
其中提取ievs的步骤如下：
[0120]
(1)诱导6h，吹打培养皿底细胞，收集所有脱落的细胞和细胞上清；
[0121]
(2)800g，4℃离心10min(去除死细胞)，留上清；
[0122]
(3)2000g，4℃离心10min(去除细胞碎片)，留上清；
[0123]
(4)上清16000g，4℃离心30min，弃上清，留囊泡沉淀；
[0124]
(5)加入1ml pbs吹打重悬沉淀，16000g，4℃离心30min，弃上清，留囊泡沉淀(此步骤目的洗掉可能残余的培养基和sts)；
[0125]
(6)囊泡沉淀可用适量pbs重悬，待用。
[0126]
对照组：为正常的人骨髓间充质干细胞，用α-mem无血清培养基培养6h，并与实验组同时在2h时加入50μg plga纳米粒继续共孵育4h。与实验组(下称“凋亡hbmscs”)的区别只在于不加入sts。
[0127]
实施例2包裹纳米粒的工程化囊泡的鉴定
[0128]
1、实验方法
[0129]
(1)免疫荧光检测合成效率
[0130]
使用pkh67膜染料标记ievs，plga纳米粒合成时已带有罗丹明b(rhb)染料标签，在激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜下观察ievs与plga纳米粒重合比例，初步判断嵌合ievs的合成效率。
[0131]
(2)流式分析检测合成效率
[0132]
使用pkh67膜染料标记ievs，plga纳米粒合成时已带有罗丹明b染料标签，在流式细胞仪中检测fitc与pe通道双阳性的囊泡比例，初步判断嵌合ievs的合成效率。
[0133]
(3)透射电镜观察嵌合ievs的结构
[0134]
使用负染法处理嵌合ievs，在透射电镜下观察嵌合ievs及plga纳米粒的粒径、结构与包裹情况，判断plga纳米粒表面ievs膜的包裹率。
[0135]
(4)工程化ievs肝靶向性检测：
[0136]
1)循环ievs的生物分布
[0137]
使用pkh67膜染料标记制成的嵌合ievs，将嵌合ievs经尾静脉输注到小鼠体内，24小时后处死小鼠，取肝、背部皮肤组织脏器，经固定、脱水、oct包埋后行冰冻切片。切片染核后封片拍照，观察pkh67标记的嵌合ievs在体内各组织脏器的分布情况。
[0138]
2、实验结果
[0139]
(1)凋亡细胞主动摄取纳米颗粒(plga)
[0140]
使用尼罗红染料标记plga纳米粒，显示为红色；mito tracker green染料标记线粒体，显示为绿色；
[0141]
hoechst 33342染料标记细胞核，显示为蓝色。先诱导细胞凋亡后加入纳米粒，观察到大量纳米粒聚集在凋亡细胞内(图1a)。同时，比较正常hbmscs(实施例1的对照组)与凋亡hbmscs胞内(实施例1的实验组)的纳米颗粒数量发现，凋亡细胞明显摄取更多的纳米颗粒，显现出更强的对纳米颗粒的主动摄取能力(图1b)。
[0142]
(2)凋亡细胞组装纳米颗粒的动态观察
[0143]
在活细胞成像仪器下长期动态观察凋亡hbmscs的摄取，组装和释放的过程，可见凋亡状态的细胞可将摄取的纳米颗粒组装释放，形成工程化ievs。如图2所示，绿色为mitotracker green染料标记的线粒体，红色为罗丹明b或尼罗红荧光染料标记的纳米颗粒，黄色是红色和绿色的叠加颜色，蓝色为hoechst 33342染料标记的细胞核。
[0144]
(3)合成效率及鉴定
[0145]
通过流式检测工程化ievs的合成效率(按照实施例1的方法提取出ievs，再进行测
定)，可见相比于先加纳米颗粒再诱导凋亡或诱导凋亡同期加入纳米颗粒这两种方式，先诱导细胞处于凋亡状态可产出更多的工程化ievs(图3a，表1)。通过荧光显微镜观察sts-pre2h plga
rhb
组的ievs，可见较多嵌合了plga纳米粒的ievs，颜色重叠显示为黄色(图3b)。透射电镜检测实施例1提取的ievs可见高亮白色纳米粒包裹于密度稍低的膜结构中(图3c)。
[0146]
注：同“(2)”，绿色为mitotracker green染料标记的线粒体，红色为罗丹明b或尼罗红荧光染料标记的纳米颗粒，黄色是红色和绿色的叠加颜色。
[0147]
表1工程化ievs的合成效率
[0148]
组别效率apoevs:sts1.83％plga
rhb-pre2h sts19.70％sts-pre2h plga
rhb
32.38％sts plga
rhb
20.87％
[0149]
效率＝含有plga的apoevs/总apoevs。
[0150]
其中图3a中，“apoevs:sts”组为：与实施例1实验组ievs相比，未添加纳米粒，仅sts诱导hbmscs凋亡6h产生的ievs；plga
rhb-pre2h sts组为:与实施例1实验组ievs相比，在诱导hbmscs凋亡(加入sts)前2h前加入纳米粒，随后诱导凋亡6h提取ievs；sts-pre2h plga
rhb
组为:与实施例1实验组ievs相比，在诱导hbmscs凋亡(加入sts)2h时加入纳米粒，6h时提取ievs；sts plga
rhb
组为:与实施例1实验组ievs相比，在诱导hbmscs凋亡(加入sts)同时加入纳米粒，6h时提取ievs。
[0151]
(4)工程化ievs的生物分布
[0152]
提取2个10cm培养皿hbmscs产生的工程化ievs(实施例1实验组提取的)，并标记染料pkh67后经尾静脉输注到小鼠(c57，8周，雄)体内后，24小时后颈椎脱臼法处死小鼠，取肝、脾、肾、皮肤等组织，经固定、包埋、脱水等处理后，进行组织的冰冻切片。冰冻切片经封闭和dapi核染色后于荧光显微镜下观察pkh67标记ievs的组织分布。结果如图4所示，工程化ievs膜为pkh67染料标记显示为绿色，内含罗丹明b标记的plga纳米颗粒(红色)，叠加显示为黄色，各组织的细胞核显示为蓝色。观察ievs的组织分布发现：相较于皮肤而言，工程化ievs依然在肝脏具有明显的富集性，仍具有肝脏靶向性的特性。结果如图4所示。
[0153]
实施例3包裹mirna的工程化囊泡的制备以及检测
[0154]
1、工程化囊泡的制备
[0155]
利用凋亡细胞包裹纳米粒产出“工程化ievs”的方法(同实施例1实验组的方法)制备含有mirna的工程化ievs，含有cy3荧光标记的mirna-29a-3p mimic由锐博生物公司制备。合成的mirna-29a-3p mimic带有cy3荧光标记，显示为红色；cell mask deep red染料标记膜结构，显示为紫色；mito tracker green染料标记线粒体，显示为绿色；hoechst 33342染料标记细胞核，显示为蓝色。
[0156]
2、工程化囊泡的检测
[0157]
经长期动态观察正常hbmscs与凋亡hbmscs对mirna-29a-3p的摄取情况发现：凋亡状态的细胞在整个凋亡过程中均未见主动摄取与组装mirna-29a-3p，而正常细胞内明显可见大量mirna-29a-3p的积累(图5)。
[0158]
注：图5中，(1)apoptotic hbmscs组：方法同实施例1实验组，区别是在sts诱导hbmscs凋亡2h后添加的是100nm mirna-29a-3p：(2)hbmscs组：提前24小时给正常细胞hbmscs转染100nm mirna-29a-3p 24h后，免疫荧光检测发现，胞内可见大量mirna聚集。
[0159]
在hbmscs正常生长时，转染mirna-29a-3p后再诱导凋亡，提取ievs，荧光显微镜下观察可见包裹mirna-29a-3p的ievs以及流式检测包裹效率(图6)，表明通过本发明的诱导细胞凋亡的方法可产生含有mirna-29a-3p的工程化ievs(工程化mirna-ievs)，进一步证实和丰富了本研究提出的新策略。
[0160]
注：图6中，包裹mirna-29a-3p的ievs的获得：提前24h给正常细胞hbmscs转染100nm mirna-29a-3p，再添加含1000nm sts的α-mem无血清培养基诱导6h，提取ievs，获得包裹有mirna-29a-3p的工程化囊泡。其余步骤同实施例1的实验组。
[0161]
实施例4工程化囊泡的制备和效果测试
[0162]
1、实验方法
[0163]
聚碳酸酯(polycarbonate,pc)纳米颗粒按照本领域常规的方法合成，参考文献：biodegradable cationic poly(carbonates):effect of varying side chain hydrophobicity on key aspects of gene transfection(pmid:28323177)。
[0164]
装载有pc纳米粒的工程化囊泡具体制备步骤：用10ml含500nm sts的1640无血清培养基刺激人多发性骨髓瘤细胞(u266)12h，细胞密度为1
×
106个/ml，诱导u266发生细胞凋亡：在诱导凋亡(加入sts)4h后加入50μg pc纳米粒继续共孵育8h，提取ievs，获得工程化囊泡(又称“嵌合ievs”)。
[0165]
其中提取ievs的步骤如下：
[0166]
(1)诱导12h，收集所有细胞和细胞上清；
[0167]
(2)800g，4℃离心10min(去除死细胞)，留上清；
[0168]
(3)2000g，4℃离心10min(去除细胞碎片)，留上清；
[0169]
(4)上清16000g，4℃离心30min，弃上清，留囊泡沉淀；
[0170]
(5)加入1ml pbs吹打重悬沉淀，16000g，4℃离心30min，弃上清，留囊泡沉淀(此步骤目的是洗掉可能残余的培养基和sts)；
[0171]
(6)囊泡沉淀可用适量pbs重悬，待用。
[0172]
2、实验结果：
[0173]
合成的pc纳米粒带有尼罗红(nr)荧光标记，显示为红色；cell mask deep red染料标记膜结构，显示为紫色；hoechst 33342染料标记细胞核，显示为蓝色。由图7可见凋亡的u266细胞主动摄取pc纳米粒(图7a)并且组装成含有pc纳米粒的“嵌合ievs”，荧光显微镜下观察及流式检测“嵌合ievs”的合成效率大约为51.42％(图7b)。
[0174]
实施例5工程化囊泡的制备和效果测试
[0175]
1、实验方法
[0176]
btz(硼替佐米)/pc载药纳米颗粒(包裹btz的pc载药纳米颗粒，即btz/pc)按照本领域常规的方法合成，参考文献：dual ph-responsive shell-cleavable polycarbonate micellar nanoparticles for in vivo anticancer drug delivery(pmid:29757607)。载药量(w/w)为17.21％。
[0177]
测试不同方式(超声法和细胞凋亡法)合成的“嵌合ievs”的作用效果：使用超声法
和细胞凋亡法合成含有btz/pc载药纳米颗粒的“嵌合ievs”(au-btz/pc-apoevs,ul-btz/pc-apoevs)，分别与u266共培养12h，比较两种方法的ievs诱导u266细胞凋亡的比例。
[0178]
细胞凋亡法：准备1个10-cm dish，待人骨髓间充质干细胞(hbmscs)生长至90％时加入含500nm sts的α-mem无血清培养基诱导9h，在诱导凋亡(加入sts)6h后加入50μg btz/pc纳米粒继续共孵育3h，提取ievs(提取方法同实施例1)，用100μl pbs重悬，获得细胞凋亡法“嵌合ievs”(au-btz/pc-apoevs)。
[0179]
超声法：准备1个10-cm dish，待人骨髓间充质干细胞(hbmscs)生长至90％时加入含500nm sts的α-mem无血清培养基诱导9h，提取ievs。用100μl pbs重悬ievs，加入50μg btz/pc纳米粒，超声18min(超声条件：功率60w，每次超声30s后停止30s，总共持续18min)，超声结束后室温静置30min，使ievs膜与btz/pc纳米粒充分结合与包裹。随后，16000g，4℃，离心30min获得超声法“嵌合ievs”(ul-btz/pc-apoevs)。
[0180]
分组如下：
①
u266(control)；
②
u266 pc；
③
u266 btz；
④
u266 btz/pc；
⑤
u266 apoevs；
⑥
u266 au-btz/pc-apoevs；
⑦
u266 ul-btz/pc-apoevs。
[0181]
嵌合ievs应用效果测试：将u266细胞按照每孔1
×
106个/ml接种于96孔板中，每孔100μl。其中，上述的
①‑⑦
的说明如下：
[0182]
①
组：对照组为正常的培养基；
②
组：每孔补充1.6558μg单纯pc纳米粒；
③
组：每孔补充0.3442μg硼替佐米(btz)；
④
组：每组补充2μg btz/pc纳米粒；
⑤⑥⑦
组：每孔补充4μl相应的ievs(3组中ievs均为100μl pbs重悬，每孔加入1/25量，即4μl，即加入的都是2μg的ievs或者嵌合ievs)。共培养12h后通过流式检测细胞凋亡比例。
[0183]
2、实验结果：
[0184]
从各组u266细胞凋亡流式图(图8a)和各组u266细胞凋亡比例柱状图(图8b)可以看出，超声法和细胞细胞凋亡法合成的含有btz/pc纳米粒“嵌合ievs”比单纯btz/pc纳米粒或者btz药物具有更好的诱导人多发性骨髓瘤细胞(u266)凋亡的效果，且细胞凋亡法效果优于超声法(图8)。
[0185]
实施例6诱导性囊泡的获得
[0186]
如中国专利申请202110077486.9和202110077923.7中记载的内容。
[0187]
将培养至第2代的mscs(小鼠骨髓来源的mscs,bmmscs)，用培养基(dex( )培养液)继续培养至细胞汇合80％-90％时，用pbs冲洗2遍，加入含500nm sts的无血清培养基(α-mem培养基)诱导凋亡，37℃孵育24h，收集细胞上清液，用于分离和提取ievs。
[0188]
从收集的培养上清中进行ievs的分离与提取，具体步骤包括：800g离心10分钟后，收集上清液；接着2000g离心10分钟，再收集上清液；然后16000g离心30分钟，移除上清液，无菌pbs重悬ievs；接着16000g离心30分钟后，移除上清液，300-500μl无菌pbs重悬ievs，备用。
[0189]
表2 dex( )培养液配方表
[0190][0191]
实施7ievs的分析(实施例6获得的)
[0192]
如中国专利申请202110077923.7中记载的内容。
[0193]
1、ievs的定量和膜蛋白的分析
[0194]
利用流式细胞技术对实施例6获得的ievs进行定量分析，测量时间点为第1h、第4h、第8h、第16h和第24h，结果显示106个mscs在诱导至第1h、第4h、第8h、第16h和第24h后分别可以产出0.76
×
108个、1.29
×
108个、1.95
×
108个、2.48
×
108个、3.14
×
108个ievs，从中可以看出，诱导至24h后，单个msc可以产出300个ievs(图9)。
[0195]
此外，流式检测发现ievs的颗粒直径分布都集中在1μm以下，占94.97％(图10a)，侧向散射光(ssc)分析结果同样显示ievs散射光强集中在1μm以下范围(图10b)。进一步的，通过bangs laboratories公司生产的标准化小颗粒微球(0.2μm，0.5μm，1μm)分析ievs的散射光强，结果显示ievs的颗粒直径都在0.2μm以下(图10c)。透射电镜(tem)观察的结果与流式检测结果相似，大部分囊泡的直径都在200nm及200nm以下(图10d)。纳米粒子跟踪分析(nta)结果与透射电镜观察结果相符，ievs颗粒直径平均为169nm(图10e)。利用最先进的纳米流式检测技术进行单囊泡水平的粒径检测，结果也显示ievs的平均颗粒直径在100.63nm(图10f)。
[0196]
2、ievs的内容物分析
[0197]
利用蛋白dia定量技术完成bmmscs，mscs-exosomes，mscs-ievs(实施例6获得的)的蛋白组学定量分析。结果显示，mscs-exosomes和mscs-ievs的蛋白内容物表达与母细胞具有较高的重叠性，170种蛋白在ievs中特异性高表达(图11a)。
[0198]
通过生物信息学分析，筛选ievs特异性高表达的蛋白，绘制热图(图11b)，进一步结合差异蛋白的go富集分析结果，明确ievs能特异性高表达annexin v，flotillin-1，cadherin 11，integrin alpha 5和syntaxin 4分子，与同种mscs来源的exosomes相比，ievs的5种特征性分子的表达量均显著上调，具体为：ievs中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4相对于exosomes中相应标记物的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍和4.45倍(图11c)。最后利用western blot技术再次进行验证，结果与dia定量分析结果相符(图11d)。
[0199]
mscs-exosomes：指的是来源于bmmscs的外泌体。
[0200]
mscs-ievs：指的是来源于bmmscs的ievs。
[0201]
其中所述的内容物分析中的mscs和与提取exosomes和ievs的mscs为同一bmmscs细胞株。
[0202]
其中，mscs-exosomes的获得方法包括：将培养至第2代的mscs(与实施例6同样的
骨髓来源的mscs,bmmscs)，用实施例6中的dex( )培养基继续培养至细胞汇合80％-90％时，用pbs冲洗2遍，加入无血清培养基，37℃孵育48h，收集细胞上清液，用于分离和提取exosomes。提取步骤包括：800g离心10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心30分钟—收集上清液—120000g离心90分钟—移除上清液，无菌pbs重悬沉淀—120000g再次离心90分钟，移除上清，收集底部的exosomes，无菌pbs重悬。
[0203]
试验例1
[0204]
如中国专利申请202110077923.7中记载的内容。
[0205]
mscs和外泌体能够治疗四氯化碳或硫代乙酰胺(thioacetamide,taa)诱导的损伤性肝纤维化(mehrabani et al.,arch razi inst,2019；sabry et al.,int j stem cells,2019；rong et al.,stem cell res ther,2019)。
[0206]
(1)检测步骤或方法：取8周龄c57小鼠，腹腔注射100mg/kg的taa，每周3次，持续8周，造损伤性肝纤维化模型。taa造模期间每2周经尾静脉输注ievs，8周后取材，肝组织石蜡切片、he染色。
[0207]
(2)结果：如图12所示，taa注射诱导肝脏损伤、肝血窦周围组织破坏、玻璃样变纤维化形成，ievs注射未有明显治疗效应。
[0208]
试验例2
[0209]
如中国专利申请202110077923.7中记载的内容。
[0210]
(1)检测步骤或方法：取8周龄舍格伦综合征(ss)模型小鼠，经尾静脉系统注射mscs和ievs，注射后4周取材，检测唾液流速，收集唾液腺样本行石蜡切片he染色和b细胞标志物b220染色。
[0211]
(2)结果：如图13a-图13c，结果显示，对比小鼠骨髓间充质干细胞及其来源的ievs(实施例6的方法获得的)治疗干燥综合症(舍格伦综合征)唾液流率的影响，间充质干细胞治疗后唾液流率稍有恢复，ievs治疗后唾液流率未见改善(*p《0.05相较于wt组，###p《0.001相较于mscs组)。ievs注射未改变唾液腺的炎症浸润和b细胞堆积情况。
[0212]
试验例3
[0213]
如中国专利申请202110077923.7中记载的内容。
[0214]
利用体外凝血实验检测获得的ievs(同实施例6的ievs)和exosomes(实施例7获得的exosomes)的体外促凝效果。结果如表3显示，ievs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于exosomes。
[0215]
但对于因子ii，v，x缺乏的血浆，ievs无法发挥体外促凝作用，说明ievs的体外促凝作用更多集中于凝血共同途径的上游。
[0216]
表3
[0217]
[0218]
利用血友病a小鼠(凝血因子viii缺乏)为模型，通过尾静脉注射9
×
108个ievs，观察ievs的体内促凝作用。结果如图14显示，ievs治疗后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳定地维持14天。
[0219]
实验结果表明，ievs能够在体外发挥显著的促凝作用。且体内注射后能够显著改善出血倾向，可用于改善血友病a导致的出血倾向。同时检测小鼠血浆中各种凝血因子的水平，发现凝血因子viii、vwf因子、组织因子(tissue factor，tf)和凝血酶原(prothrombin)均没有发生显著变化(图15a，图15b，图15c，图15d)。
[0220]
在血友病a小鼠模型中，分别注射正常ievs，ps阴性ievs和tf阴性ievs，7天后进行剪尾实验，结果如图16a和图16b显示，ps和tf的封闭并没有影响ievs的体内治疗效果，初步说明ievs治疗血友病小鼠的机制与ps和tf无关。以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的ps和tf，而ievs的体内实验结果与以往研究不一致，这提示在体内环境下，ievs可能有新的作用机制发挥促凝作用。
[0221]
对血友病a小鼠模型，分别进行同种mscs来源的ievs(实施例6获得的)和exosomes(实施例7获得的)的注射治疗(9
×
108个)，结果显示，ievs能够显著纠正小鼠的出血倾向，而exosomes没有明显的治疗效果(图17)。