一种六倍体丹参及培育方法与流程

本发明涉及六倍体丹参培育，具体为一种六倍体丹参及培育方法。

背景技术：

1、丹参(salvia miltiorrhiza bunge)属唇形科，别名红根、赤根，是一种主要以根及根茎入药的多年生草本植物。丹参有2种花色，它的原变种s.miltiorrhiza bungevar.miltiorrhiza和单叶丹参s.miltiorrhiza bunge var.charbonnelli均为紫花，只有s.miltiorrhiza f.alba为白花，紫花与白花丹参正、反交f1均为紫花，f2紫花与白花呈3:1分离，说明丹参紫花与白花受一对显、隐性基因控制，紫花为显性，白花为隐性。

2、丹参是我国传统中药材，是传统医药中应用最早、最广泛的药物之一，是著名的活血化瘀药，在临床上被广泛用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病。我国以丹参为原材料生产的中药有百种以上，其中天士力生产的复方丹参滴丸不仅畅销国内医药市场，而且远销世界。丹参滴丸作为中成药在1997年被批准进入美国市场，至今以药品身份进入16个国家的主流医药市场。

3、随着我国人口老龄化和心脑血管疾病的年轻化，心脑血管疾病已成为危害人类健康的主要疾病之一，发病率逐年上升，对治疗药物的需求量巨大，丹参在临床治疗和预防过程中发挥着其他药物不可替代的作用。目前国内涉及的企业逐年增多，丹参的需求量逐年上升，出口量也不断增加，使得丹参的身价倍增，用量翻番。因此，培育高产优质的丹参稳定品种就显得十分重要和紧迫，随着生物技术的快速发展和进步，人们对多倍体的认识和利用也不断深入，利用多倍体技术创造植物新品种(系)是植物遗传改良与种质创新的有效方法之一。

4、现在我国种植的丹参主要是三倍体丹参，植物多倍化是高等植物进化的重要途径，三倍体是多倍体中倍性最低的多倍体，但它具有唯一的多倍体和杂交种双重优势，其优势表现在巨大性和不可替代性。三倍体丹参其“染色体数目为2n＝3x＝24”不仅产量高品质好，药用成分含量也达到了药典规定的标准。但由于三倍体丹参高度不育，只开花不结实，靠根茎进行无性繁殖繁衍后代，长期无性繁殖和病毒感染，出现了严重的种质退化，引发抗性减弱，药材产量和商品质量下降等一系列现象，严重影响了三倍体丹参的进一步生产和发展，而且目前还没有一种多倍体丹参替代具有三倍体双重优势的丹参品种，所以创造一种六倍体丹参新品种及培育方法势在必行。

技术实现思路

1、解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种六倍体丹参及培育方法，通过六倍体丹参既固定了三倍体丹参的双重优势，又解决了由于三倍体丹参高度不育，只开花不结实，靠根茎进行无性繁殖繁衍后代，长期无性繁殖和病毒感染，出现了严重的种质退化，引发抗性减弱，药材产量和商品质量下降等一系列现象，严重影响了三倍体丹参的进一步生产和发展的问题。因此，六倍体丹参在保持和固定三倍体丹参双重优势的利用中具有重要价值。

3、技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种六倍体丹参及培育方法，所述六倍体丹参及培育方法包括以下部分：

5、sp1、收集二倍体丹参种质资源，分别从云南、四川、陕西、山东、河北、天津等地收集了6份材料，建立丹参种质资源材料种植圃；

6、sp2、对丹参种质资源进行形态观察、性状分析、染色体倍性鉴定与基因组分析，结果显示，白花丹参与紫花丹参体细胞均为二倍体，即：2n＝2x＝16；

7、sp3、依据鉴定结果，选取二倍体白花丹参，采用化学诱变剂进行四倍体丹参的人工诱导。取经过诱变处理的白花丹参种苗进行染色体倍性鉴定，筛选出纯合四倍体白花丹参；然后四倍体白花丹参与二倍体紫花丹参进行三倍体杂交转育，获得三倍体丹参种子，作为六倍体丹参诱变材料。

8、sp4、采用升汞消毒方法对三倍体丹参种子进行无菌消毒。

9、优选的，所述利用升汞消毒方法对三倍体丹参种子进行无菌消毒。

10、优选的，所述升汞消毒方法为：用75％酒精消毒40～60秒，无菌水冲洗3次，0.1％升汞消毒12分钟，无菌水冲洗3次。

11、优选的，所述三倍体丹参需要进行六倍体丹人工诱导，将无菌的三倍体丹参种子转入附加(含)诱变剂的营养液中，在20℃±2℃，黑暗条件下，萌发与加倍诱导同步处理3～6天。

12、优选的，所述附加诱变剂营养液为：ca(no3)2·4h2o 59.04g+kno325.23g+mgso4·7h2o 24.65g+kh2po4 6.8g+na2-edta 3.73g+feso4·7h2o2.78g+蔗糖20g,加水至1000ml,然后配制成附加(含)秋水仙素的诱变剂营养液，此附含诱变剂营养液的终浓度为50ppm。

13、优选的，所述经处理的萌发种子转入1/2ms固体培养基中，在23℃±2℃条件下，光照1000lux,12小时/天，继续培养。

14、优选的，所述待种苗根系长至3公分以上，幼叶发育至4片以上时，逐株进行染色体倍性鉴定，筛选出六倍体株系，然后进行基因组分析。

15、优选的，所述染色体倍性鉴定与基因组分析步骤为：上午8:30～9:00取幼叶或新根，用对二氯苯饱和水溶液处理3小时→0.075m kc l低渗15分钟→去除细胞壁：使用1％混合酶(果胶酶+纤维素酶)处理40分钟→0.075m kcl低渗15分钟→固定：3:1(甲醇:冰醋酸)固定液固定30分钟→制片→giemsa染色→显微镜观察与分析。筛除三倍体、嵌合体和非整倍体，选取体细胞为2n＝6x＝48的六倍体株系进行繁殖。

16、优选的，所述进行六倍体丹参的克隆繁殖，剪切六倍体丹参叶片，接种到ms+6-ba2mg/l+蔗糖25g/l+活性炭0.5g/l+卡拉胶5g/l，ph5.6～5.8的培养基上，在23℃±2℃条件下暗培养至分化，待分化出丛生芽后转入光照培养，光照为1000lux,12小时/天。

17、优选的，所述对六倍体丹参克隆繁殖进行分瓶扩繁，待丛生芽分化成丛生苗后进行扩繁，将丛生苗分瓶接种到ms+6-ba 1mg/l+蔗糖20g/l+活性炭0.5g/l+卡拉胶6g/l，ph5.6～5.8的培养基上，在23℃±2℃条件下，光照1000lux,12小时/天，继续培养。

18、优选的，所述培养是对生根进行培养，待丛生苗长至2-4片叶时转入1/2ms+i ba0.4mg/l+蔗糖20g/l+活性炭1g/l+卡拉胶7g/l,ph5.8的生根培养基中进行生根培养。

19、优选的，所述生根培养好后进行瓶苗移栽，待瓶苗新根长至3-5公分时，进行瓶苗移栽。移栽前打开瓶盖炼苗3-5天，然后将苗逐棵栽入3:1(营养土：沙壤土)混合基质中。

20、优选的，所述移栽苗要防止阳光直射，注意通风，保持50％-70％的湿度，成活率在95％以上。

21、有益效果

22、本发明提供了一种六倍体丹参及培育方法。具备以下有益效果：

23、本发明目的是提供一种六倍体丹参的培育方法。该方法采用化学诱变剂，首先将二倍体白花丹参诱变成为四倍体，利用多倍体与杂交相结合，用二倍体紫花丹参与四倍体白花丹参进行三倍体杂交转育获得三倍体丹参种子，然后采用种子萌发与多倍体诱导同步进行的方法，强迫三倍体丹参种子在吸收诱变剂的过程中萌发，对经过诱变的丹参种苗逐一进行染色体倍性鉴定，排除三倍体，去除嵌合体和非整倍体，筛选出六倍体丹参株系。结果显示，六倍体丹参的诱变率达到60％以上，未检测出嵌合体与非整倍体，首次获得六倍体丹参新种质。下一步将进行六倍体丹参新种质的性状分析。为了缩短繁殖周期，采用丹参克隆繁殖进行六倍体丹参扩繁，提高了繁殖速度，为大规模种植与推广提供足够的材料。