一种灰毡毛忍冬组织培养方法与流程

本发明涉及植物组织培养，特别涉及一种灰毡毛忍冬组织培养方法。

背景技术：

1、灰毡毛忍冬(lonicera macranthoideshand.-mazz.)为忍冬科、忍冬属的植物，以花蕾或带初开的花供药，是一种具有悠久历史的常用中药，收入至《中国药典》，为山银花项下列为山银花药材的基源植物之一。灰毡毛忍冬药材具有清热解毒，抗炎、补虚疗风等功效，常用于温病发热、热毒血痢、痈疽疔毒、风热感冒等功能，其主治及用法用量与金银花相同。由于灰毡毛忍冬适应性强，产量高，抗病害能力较强，同时采摘方便，自身有机酸和皂苷含量较高等优点，提高灰毡毛忍冬的种植量日益加大。

2、灰毡毛忍冬的繁殖大多数是以无性繁殖为主，例如扦插繁殖，但不同品种植株的性状变异较大，且扦插的成活率较低，并不能够很好地满足市场的需求。目前，已逐渐建立了灰毡毛忍冬的组织培养技术，但灰毡毛忍冬在组培过程中容易出现褐化、苗弱等问题，同时还存在生根时间长，不能够快速、规模化地培育出优质种苗等问题。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提出一种灰毡毛忍冬组织培养方法，解决上述问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种灰毡毛忍冬组织培养方法，包括如下步骤：

4、s1外植体的清洁与消毒：选择含腋芽茎段为外植体，清洗，消毒，得消毒的外植体；

5、s2诱导培养：取消毒的外植体，剪去伤口处，接种至初代培养基中，进行诱导培养，所述初代培养基为ms+naa0.1～0.3mg/l+6-ba0.5～1.5mg/l+蔗糖20～40g/l+琼脂6～8g/l；

6、s3继代增殖培养：将诱导的丛生芽，剪去上部叶片，并无菌切成单芽，接种至继代增殖培养基中，进行继代增殖培养，所述继代增殖培养基为：1/2ms+6-ba0.5～1mg/l+生物素d0.3～0.7mg/l+蔗糖20～40g/l+琼脂6～8g/l；

7、s4过渡培养：将继代增殖的丛生芽，无菌切成单芽，接种至过渡培养基中，进行过渡培养，所述过渡培养基为：改良ms+苹果汁50～150mg/l+cppu 0.01～0.03mg/l+iba 0～0.1mg/l+蔗糖20～40g/l+琼脂6～8g/l；

8、s5生根培养：将过渡培养得到的组培苗，接种至生根培养基中，诱导培养至生根形成，所述生根培养基为：改良ms+苹果汁150～200mg/l+naa 1.0～2.0mg/l+蔗糖20～40g/l+活性炭0.1～0.4g/l+琼脂6～8g/l。

9、naa(1-naphthlcetic acid,a-萘乙酸,naa)；6-ba(6-benzylaminopurine,6-苄基腺嘌呤,6-ba)，cppu(forchlorfenuron,氯吡苯脲,cppu)；iba(3-indolebutyric acid,吲哚-3-丁酸,iba)。

10、进一步地，步骤s4中，所述过渡培养包括依次加入过渡培养基1和过渡培养基2进行培养，所述过渡培养基1为：改良ms+苹果汁50～80mg/l+cppu 0.01～0.02mg/l+蔗糖20～40g/l+琼脂6～8g/l，所述过渡培养基2为：改良ms+苹果汁100～150mg/l+cppu 0.01～0.03mg/l+iba0.05～0.1mg/l+蔗糖20～40g/l+琼脂6～8g/l。

11、更进一步地，过渡培养还包括采用液体培养，所述过渡培养基1为：改良ms+苹果汁50～80mg/l+cppu 0.01～0.02mg/l+蔗糖20～40g/l，所述过渡培养基2为：改良ms+苹果汁100～150mg/l+cppu 0.01～0.03mg/l+iba0.05～0.1mg/l+蔗糖20～40g/l。

12、更进一步地，加入过渡培养基1的培养条件为：温度23～26℃，光照培养10～15d，每天光照时间10～14h，光照强度1000～2000lx，加入过渡培养基2的培养条件为：温度23～26℃，光照培养10～15d，每天光照时间10～14h，光照强度1000～2000lx。

13、更进一步地，所述改良ms的组分如下：

14、硝酸钾：945～955mg/l、硝酸铵：820～830mg/l、磷酸二氢钾：80～90mg/l、硫酸镁：180～190mg/l、氯化钙：220～225mg/l、硫酸锰：22～25mg/l、硫酸锌：8～9mg/l、钼酸钠：0.25～0.28mg/l、硫酸铜：0.025～0.027mg/l、氯化钴：0.025～0.027mg/l、碘化钾：0.80～0.85mg/l、硼酸：6.0～6.5mg/l、乙二胺四乙酸二钠：18～19mg/l、硫酸亚铁：13～15mg/l、甘氨酸：1.5～2.5mg/l、盐酸硫胺素：0.1～0.15mg/l、盐酸吡哆醇：0.4～0.6mg/l、烟酸：0.4～0.6mg/l和肌醇：95～105mg/l。

15、进一步地，步骤s1中，所述消毒包括：将外植体采用体积浓度70～80％酒精震摇15～25s，无菌水冲洗2～3次后，再加入质量浓度0.1～0.2％升汞溶液浸没至外植体50～90s，最后无菌水涮洗3～5次。

16、进一步地，步骤s2中，诱导培养的条件为：温度23～26℃，光照培养10～15d，每天光照时间10～14h，光照强度2000～3000lx。

17、进一步地，步骤s3中，继代增殖培养的条件为：温度23～26℃，光照培养20～25d，每天光照时间10～14h，光照强度2000～3000lx。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

19、本发明在诱导培养阶段采用naa和6-ba结合，继代增殖培养阶段采用6-ba和生物素d搭配，同时增设了过渡培养阶段，选择苹果汁、cppu与iba进行组合，最后生根阶段再次采用苹果汁和naa，对灰毡毛忍冬的组织培养具有较好的生根效果，有效缩短组培苗生根时间，且组培苗诱导得到的生根粗壮且多，有助于后续移栽时为组培苗的吸水、吸肥能力奠定一定基础，提高移栽成活率。

20、本发明增设的过渡培养阶段，苹果汁、cppu和iba的科学组合，能够有效避免褐化情况，有助于促进芽的伸长生长，使茎和叶增粗，提高生长势，使苗更加健壮。

21、本发明增设的过渡培养阶段，可以结合液体培养的模式进行，可使灰毡毛忍冬组培苗生根多，不仅粗壮，同时根系健壮不易折，有助于快速恢复培养，也减轻褐化损伤程度。

技术特征：

1.一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，步骤s4中，所述过渡培养包括依次加入过渡培养基1和过渡培养基2进行培养，所述过渡培养基1为：改良ms+苹果汁50～80mg/l+cppu 0.01～0.02mg/l+蔗糖20～40g/l+琼脂6～8g/l，所述过渡培养基2为：改良ms+苹果汁100～150mg/l+cppu 0.01～0.03mg/l+iba 0.05～0.1mg/l+蔗糖20～40g/l+琼脂6～8g/l。

3.根据权利要求2所述的一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，过渡培养还包括采用液体培养，所述过渡培养基1为：改良ms+苹果汁50～80mg/l+cppu 0.01～0.02mg/l+蔗糖20～40g/l，所述过渡培养基2为：改良ms+苹果汁100～150mg/l+cppu 0.01～0.03mg/l+iba0.05～0.1mg/l+蔗糖20～40g/l。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，加入过渡培养基1的培养条件为：温度23～26℃，光照培养10～15d，每天光照时间10～14h，光照强度1000～2000lx，加入过渡培养基2的培养条件为：温度23～26℃，光照培养10～15d，每天光照时间10～14h，光照强度1000～2000lx。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，所述改良ms的组分如下：

6.根据权利要求1所述的一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，步骤s1中，所述消毒包括：将外植体采用体积浓度70～80％酒精震摇15～25s，无菌水冲洗2～3次后，再加入质量浓度0.1～0.2％升汞溶液浸没至外植体50～90s，最后无菌水涮洗3～5次。

7.根据权利要求1所述的一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，步骤s2中，诱导培养的条件为：温度23～26℃，光照培养10～15d，每天光照时间10～14h，光照强度2000～3000lx。

8.根据权利要求1所述的一种灰毡毛忍冬组织培养方法，其特征在于，步骤s3中，继代增殖培养的条件为：温度23～26℃，光照培养20～25d，每天光照时间10～14h，光照强度2000～3000lx。

技术总结本发明提出了一种灰毡毛忍冬组织培养方法，包括选择含腋芽茎段为外植体，依次经过诱导培养、继代增殖培养、过渡培养和生根培养，诱导培养至生根形成。本发明在诱导培养阶段采用NAA和6‑BA结合，继代增殖培养阶段采用6‑BA和生物素D搭配，同时增设了过渡培养阶段，选择苹果汁、CPPU与IBA进行组合，最后生根阶段再次采用苹果汁和NAA，对灰毡毛忍冬的组织培养具有较好的生根效果，有效缩短组培苗生根时间，且组培苗诱导得到的生根粗壮且多，有助于后续移栽时为组培苗的吸水、吸肥能力奠定一定基础，提高移栽成活率。本发明增设的过渡培养阶段，可以结合液体培养的模式进行，可使灰毡毛忍冬组培苗生根多，不仅粗壮，同时根系健壮不易折，有助于快速恢复培养。技术研发人员：舒清理,舒利受保护的技术使用者：湖南农夫哥农业开发有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/2