一种马铃薯超低温冷冻脱毒的方法

本发明属于马铃薯脱毒，尤其涉及一种马铃薯超低温冷冻脱毒的方法。

背景技术：

1、马铃薯的产量以及品质与农业经济、食品工业经济的发展息息相关。马铃薯是一种块茎种植的无性繁殖的农作物，因此，在种植过程中，如果薯块受到病毒感染，便会致使种性退化，进而影响马铃薯抗病害能力，以致于其在生长过程中极易受病毒病、青枯病等多种病害侵袭。由此可见，虽然马铃薯是一种高产作物，但会因受多种因素影响，而不能实现高产，甚至不能稳定生产。同时，如果马铃薯发生病毒性退化，一般减产20-30％，严重者减产80％以上，病情逐年加重，最后失去种用价值。

2、因此，为了确保其产量满足市场需要，且品质符合大众需求，就需要对马铃薯进行脱毒处理。目前解决马铃薯种薯退化最常用最传统的两种方法是利用常规茎尖培养以及热处理+茎尖培养技术，但存在费时、褐化、植株再生偏难和脱毒效果较差等问题(高慧卿等，2010，山西农业大学学报，30(6)528-532)。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出了一种马铃薯超低温冷冻脱毒的方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，包括以下步骤：

3、(1)将马铃薯薯块进行热处理，期间喷水，保持所述马铃薯薯块的湿度为30％～40％；

4、(2)选取步骤(1)中马铃薯薯块萌发的3±0.5cm的嫩芽，剪取1.5±0.3cm上端茎端，清洗后剥离茎尖；

5、(3)将步骤(2)中的茎尖投入液氮中保存1～3d；本发明直接将茎尖投入液氮中，降温速度可达到(300～400)℃/min，超快的冷冻速度可以使细胞内的水还没来得及形成冰晶，就降到了-196℃的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险；

6、(4)将步骤(3)中的茎尖从液氮中取出，进行恢复处理后，置于培养基中进行培养，先在黑暗条件下培养1～3d，再在光照条件下进行培养。

7、进一步地，步骤(1)中所述热处理为先在28～30℃下将马铃薯薯块光照12h，再在22～25℃下黑暗处理6h。本发明的热处理过程不仅可以钝化病毒，而且在此过程中保证一定的湿度可以提高发芽率。热处理温度过高，会导致幼芽细弱，热处理温度过低，难以发芽，也无法起到钝化病毒的效果，因此为了兼顾发芽和脱毒效果，本发明采用变温热处理马铃薯薯块的方式。

8、进一步地，步骤(1)中保持所述马铃薯薯块的湿度为30％～35％。

9、进一步地，步骤(2)中所述清洗指的是先将茎尖用吐温20浸泡3～5min，再用流动水冲洗10～15min，然后用酒精消毒10s，naclo消毒5min，最后用无菌水清洗3～5遍。

10、进一步地，步骤(2)中剥离茎尖的方式为：在解剖镜下，用解剖刀切下茎尖最上端0.7±0.2mm，然后剥离多余2～3片小叶，仅保留1～2个叶原基的0.3～0.6mm茎尖。

11、进一步地，步骤(4)所述恢复处理是将从液氮中取出的茎尖置于25～30℃水浴中处理3～5min。

12、进一步地，步骤(4)中所述培养基是添加了vc的ms培养基。

13、进一步地，步骤(4)中所述培养基的成分是ms+0.4mg·l-1 6-ba+0.08mg·l-1naa+0.01～0.03mg·l-1kh2po4+0.01～0.03mg·l-1(nh4)2so4+0.003～0.005mg·l-1vc+25g·l-1蔗糖。

14、更进一步地，步骤(4)中所述培养基的成分是ms+0.4mg·l-16-ba+0.08mg·l-1naa+0.02mg·l-1kh2po4+0.02mg·l-1(nh4)2so4+0.003mg·l-1vc+25g·l-1蔗糖。

15、进一步地，步骤(4)中培养时的温度为20～25℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为每天14～16h，相对湿度为70％～80％。

16、更进一步地，步骤(4)中培养时的温度为23±1℃，光照强度为2500lx，光照时间为每天15h，相对湿度为75％。

17、本发明的原理为：由于传统茎尖脱毒采用的是剥离茎尖生长点(0.1～0.3mm)，移入分生组织培养基培养3～5个月，待分生组织分化后，转入生长培养基培养15～20d成苗。传统茎尖脱毒从剥离下来的生长点到成苗需要转接两次，时间长达将近半年。而本发明首先采用变温热处理的方法对马铃薯薯块进行处理，不仅可以钝化病毒，而且在此过程中保证一定的湿度可以提高发芽率。而且经过变温处理后马铃薯薯块生成大芽，本发明直接剪取大芽1.5±0.3cm上端茎端清洗后分离茎尖，经过液氮冷冻后进行暗培养，大部分细胞处于有丝分裂状态，不需要经过分生组织培养，可直接在培养基中培养成苗，从切下芽尖到成苗只需要18～25d，大大缩短了成苗时间。不同类型的培养基对茎尖能否脱毒和成活有重要影响。本发明在ms培养基中添加了k+、nh4+和vc，不仅对茎尖的生长和发育具有重要作用，而且可以提高脱毒效果，提高成活率。在成苗培养时，本发明先进行暗培养再进行光照培养，暗培养的过程可以促进植物细胞有丝分裂，使大部分细胞处于有丝分裂状态，再进行光照培养可以大大缩短成苗时间。此外，马铃薯茎尖分生区的病毒在传播时其速度较慢，也间接提高了无毒苗的成活率。

18、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

19、(1)本发明培养得到的马铃薯脱毒植株生长状态良好，具有脱毒率高和成活率高的特点，且本发明的方法简单易行、培养周期短，能够批量生产。

20、(2)经过本发明超低温冷冻脱毒后的再生植株，经检测并未发现dna遗传序列发生突变，具有良好的遗传稳定性。

21、(3)本发明从切下芽尖到成苗只需要18～25d，大大缩短了成苗时间。

技术特征：

1.一种马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(1)中所述热处理为先在28～30℃下将马铃薯薯块光照12h，再在22～25℃下黑暗处理6h。

3.根据权利要求1所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(1)中保持所述马铃薯薯块的湿度为30％～35％。

4.根据权利要求1所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述清洗指的是先将茎尖用吐温20浸泡3～5min，再用流动水冲洗10～15min，然后用酒精消毒10s，naclo消毒5min，最后用无菌水清洗3～5遍。

5.根据权利要求1所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)所述恢复处理是将从液氮中取出的茎尖置于25～30℃水浴中处理3～5min。

6.根据权利要求1所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)中所述培养基是添加了vc的ms培养基。

7.根据权利要求6所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)中所述培养基的成分是ms+0.4mg·l-1 6-ba+0.08mg·l-1naa+0.01～0.03mg·l-1kh2po4+0.01～0.03mg·l-1(nh4)2so4+0.003～0.005mg·l-1vc+25g·l-1蔗糖。

8.根据权利要求7所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)中所述培养基的成分是ms+0.4mg·l-1 6-ba+0.08mg·l-1naa+0.02mg·l-1kh2po4+0.02mg·l-1(nh4)2so4+0.003mg·l-1vc+25g·l-1蔗糖。

9.根据权利要求1所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)中培养时的温度为20～25℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为每天14～16h，相对湿度为70％～80％。

10.根据权利要求9所述的马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)中培养时的温度为23±1℃，光照强度为2500lx，光照时间为每天15h，相对湿度为75％。

技术总结本发明提出了一种马铃薯超低温冷冻脱毒的方法，属于马铃薯脱毒技术领域，本发明先采用变温热处理马铃薯薯块，不仅可以钝化病毒，而且在此过程中保证一定的湿度可以提高发芽率，再配合成苗培养时先进行暗培养再进行光照培养，缩短成苗时间，提高脱毒率和成活率。技术研发人员：齐恩芳,贾小霞,黄伟,文国宏,马丽荣,刘石,燕汝楠受保护的技术使用者：甘肃省农业科学院马铃薯研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/2