一种诱导三七幼芽形成三七愈伤组织的方法

本发明涉及一种快速形成三七愈伤组织的方法，特别是涉及一种三七幼芽诱导形成三七愈伤的方法。

背景技术：

1、三七(panax notoginseng(burk.)f.h.chen)为五加科人参属多年生药用植物，又名山漆、金不换。主产于云南，性味苦、微寒，其根、根茎、叶、花均可入药，以根和根茎为主，具有活血化瘀、消肿定痛的功效。清代《本草纲目拾遗》中记载：“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药中之最珍贵者。”扬名中外的中成药“云南白药”和“片仔癀”，即以三七为主要原料制成。

2、现代药理学研究表明，三七的药理作用主要包括：对血液和造血系统的作用；对心血管系统的作用；对神经系统的作用；抗炎症作用；对免疫系统的作用；抗肿瘤作用；抗氧化，延缓抗衰老作用；对物质代谢的影响等。目前对三七中单体皂苷的临床与药理研究取得了大量的新成果，使三七的医学应用领域得到了有力扩展。

3、三七皂苷(panax notoginseng saponins,pns)作为三七的主要活性成分，目前在三七的根茎叶花中已经分离出60余种达玛烷型四环三萜皂苷，主要包括人参皂苷re、rb1、rd、rf、rg1、rh1等以及三七皂苷r1、r2、r3、fc、fa等。除主要活性物质皂苷外，三七中还含有植物甾醇、三七素、黄酮和多种氨基酸等活性成分。

4、目前，以三七为原料的产品，从行业看，已经在制药、保健品、食品、化妆品与日用品等行业得到广泛应用；从产品剂型看，有注射剂、滴丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、膏剂等。由于三七独特的功效，用途不断拓展，尤其在我国进入心脑血管疾病高发期的背景下，产品开发的深度和广度不断加强，市场需求巨大。云南白药集团、天津天仕力、广州白云山、玉溪维和、珍宝岛制药、上海华宇等企业都以三七为主要原料药。年需要量已经接近8000吨，且用量仍逐年快速上涨。

5、从植物药中提取活性成分，将其开发成临床用药或保健品已成为当今医药保健市场的一大热点，然而植物中这些天然产物大多含量低，价格昂贵，近年来，由于盲目挖掘，不仅使三七野生资源日益减少，而且由于三七生长周期长、环境要求苛刻、病虫害严重且存在连作障碍等问题，使得三七可利用的资源更加匮乏，因此有必要寻找解决三七资源短缺问题的新途径。

6、愈伤组织培养是植物常见培养形式，有多种用途。一方面，可用于细胞大规模工厂化生产有用化合物，另一方面可用于筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，更重要的是愈伤组织可为科研领域中转录因子和基因功能的研究验证工作提供理想材料。

7、关于三七愈伤组织培养研究并不多见。郑光植等研究表明，三七愈伤组织在ms培养基比heller、miller、b5和b5+n中培养效果好。王定康研究表明3年生三七花药为最佳外植体，愈伤诱导率为55.0％。黄天卫等利用三七幼嫩花蕾成功诱导三七愈伤，诱导率达55.6％。张铁等认为三七叶柄为外植体诱导出愈伤组织质量较好，最容易增殖。李涛等利用文山三七块根作为外植体，并获得最佳愈伤组织诱导条件。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种利用三七幼芽诱导三七愈伤组织的方法，通过该方法，能够快速形成三七愈伤组织，可应用于三七植物相关转录因子和基因功能等研究验证工作。

2、本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

3、一种诱导三七幼芽形成三七愈伤组织的方法，包括如下步骤：

4、a.取三七种子使其发芽，得到三七幼芽；

5、b.将三七幼芽置于培养基中进行诱导培养，得到三七愈伤组织，所述培养基中含有植物激素，所述植物激素包含生长素2,4-d、激动素kt、植物生长调节剂6-ba、生长素类植物生长调节剂α-naa。

6、根据本发明所述的方法，优选地，所述方法包括将三七种子砂藏培养以萌发幼芽。更优选的，所述砂藏培养的温度为10～25℃，尤其是13～16℃。所述砂藏培养的时间为20～50天，优选30～40天。

7、根据本发明所述的方法，优选地，所用三七幼芽长度为2～6cm。

8、根据本发明所述的方法，优选地，所用三七幼芽在诱导培养前先进行清洗和消毒。

9、根据本发明所述的方法，优选地，所用培养基为ms培养基。

10、根据本发明所述的方法，优选地，所述植物生长素2,4-d的添加量为1mg·l-1～3mg·l-1，优选为2mg·l-1。

11、根据本发明所述的方法，优选地，所述激动素kt的添加量为0.5mg·l-1～1.5mg·l-1，优选为1mg·l-1。

12、根据本发明所述的方法，优选地，所述植物生长调节剂6-ba的添加量为0.5mg·l-1～1.5mg·l-1，优选为1mg·l-1。

13、根据本发明所述的方法，优选地，所述生长素类植物生长调节剂α-naa的添加量为1mg·l-1～3mg·l-1，优选为2mg·l-1。

14、根据本发明所述的方法，优选地，所述诱导培养的温度为20～35℃，优选25～30℃；所述诱导培养的湿度为30～50％，优选35～40％；所述诱导培养的时间为20～50天，优选30～40天。所述诱导培养优选在暗处进行。

15、本发明还提供了一种三七愈伤体系的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

16、(1)按照本发明的方法诱导培养三七愈伤组织。

17、(2)将步骤(1)所得三七愈伤组织进行传代培养，得到质量稳定的三七愈伤组织。

18、根据本发明所述的方法，优选地，传代培养时的培养基与诱导培养时相同或者不同。更优选的，传代培养时的培养基与诱导培养时相同。

19、根据本发明所述的方法，优选地，所述传代培养时培养基的组成为ms培养基和植物激素，所述植物激素包含生长素2,4-d、激动素kt、植物生长调节剂6-ba、生长素类植物生长调节剂α-naa。

20、根据本发明所述的方法，优选地，所述植物生长素2,4-d的添加量为1mg·l-1～3mg·l-1，优选为2mg·l-1。

21、根据本发明所述的方法，优选地，所述激动素kt的添加量为0.5mg·l-1～1.5mg·l-1，优选为1mg·l-1。

22、根据本发明所述的方法，优选地，所述植物生长调节剂6-ba的添加量为0.5mg·l-1～1.5mg·l-1，优选为1mg·l-1。

23、根据本发明所述的方法，优选地，所述生长素类植物生长调节剂α-naa的添加量为1mg·l-1～3mg·l-1，优选为2mg·l-1。

24、根据本发明所述的方法，优选地，所述传代培养的温度为20～35℃，优选25～30℃；所述传代培养的时间为20～50天，优选30～40天。

25、本发明所述的三七，其拉丁学名为panax notoginseng。

26、本发明所述的植物生长素是一种人工合成的生长素类似物，简称2,4-d。

27、本发明所述的植物激动素是一种内源细胞分裂素，简称kt。

28、本发明所述的植物生长调节剂是一种人工合成的细胞分裂素，简称6-ba。

29、本发明所述的生长素类植物生长调节剂是一种有机化合物，简称α-naa(α-萘乙酸)。

30、本发明，所述诱导培养基和传代培养基选优采用固体培养基，即在上述培养基配方基础上添加琼脂或其他固化剂制成，固化剂的用量采用常规用量即可。

31、有益效果

32、采用本发明的方法，通过三七幼芽诱导三七愈伤组织，操作方法简便，诱导率高，所得愈伤组织颜色多呈白色，愈伤细胞能够保持松散状态，细胞活力佳。本发明所述方法能够降低植物三七受生长限制、地域限制、距离限制及运输限制等因素造成植物三七凋亡或死亡，导致研究单位无法利用植物三七诱导愈伤组织。这对于研究三七中所包含的化合物的生物合成途径和调控机制，提供了十分有利的工具。