一种耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系的培育方法

本发明属于海洋农业中贝类遗传育种，具体涉及一种耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系的培育方法。

背景技术：

1、香港牡蛎，俗称白蚝，主要养殖分布在河口入海区，是华南地区的一种重要贝类经济种，2022年产量约为185万吨，约占全国牡蛎产量的29.86％，可以说具有重要的经济价值。香港牡蛎具有壳厚、肉白、鲜味强、营养价值丰富、肉韧弹等优点，广受华南消费者喜爱，市场销售价格一路飙升且供不应求，从2014年的约4元每斤升高至2023年的约10元每斤，养殖、销售、加工和餐饮等上下游产业链不断扩大且产业一直提升，香港牡蛎产业甚至是广东、广西部分沿海城镇的支柱产业。

2、香港牡蛎的传统养殖需要结合海域盐度变化进行迁移，一般在每年的12月需要把蚝排迁移至盐度较低的河口区，然后在来年的6月重新拉回中高盐度区养殖。香港牡蛎的这种养殖方式需要劳动力大、人工成本高且对养殖户判断迁移时机的技术要求较高，迁移过早影响长势，迁移过晚死亡率增加。但近几年来，随着淡水量入海减少、近岸生态红线规划等导致适合迁移白蚝养殖的区域急剧减少，另一方面人工成本增加、迁移工作费时费力导致养殖户苦不堪言。因此，上述各种因素的影响导致香港牡蛎在3至5月的繁殖期时仍然在中高盐度生长，引起香港牡蛎死亡率急剧升高，最高达90％死亡，给养殖户带来极大的经济损失，严重挫伤了养殖户养殖积极性和严重迟滞了香港牡蛎养殖业的发展壮大。香港牡蛎在该期间的死亡率增加主要是由于盐度升高、性腺发育和海水温度升高引起水中含氧量降低引起，养殖户迫切需要培育一种耐高盐、性腺发育差、抗逆性强的香港牡蛎新品系。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种能够培育出耐高盐、育性差、生长快、抗性强、死亡率低、品质好、可全年上市的耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系的优良方法。

2、通过耐高盐的连续选育可以培育得到耐高盐的香港牡蛎二倍体新品系，而三倍体具有育性差、抗性强、生长快、死亡率低的优点，可以应用多倍体技术解决性腺发育、抗逆性差引起的死亡率高问题。因此，结合使用选择育种技术和多倍体育种技术可以培育得到耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系，解决香港牡蛎养殖面临的产业问题。另外，三倍体育性差，不能直接进行繁育，通过控制四倍体种质可以管控三倍体牡蛎新品系的种权，种权可控有利于育苗公司积极推广新品系、有利于提高牡蛎良种份覆盖率且有利于提高种质研发机构的积极性和种质的持续遗传改良。

3、本发明主要是关于一种耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系的培育方法，包括耐高盐的二倍体群系筛选、耐高盐且生长快的二倍体新品系选育、耐高盐且生长快的四倍体诱导系建立、耐高盐且生长快的四倍体新品系选育、耐高盐且生长快的三倍体新品系规模化生产，特征在于，包括以下步骤：

4、以生长、存活、全重作为筛选指标，筛选出在高盐和低盐海域都死亡率低的耐高盐的二倍体群系，再以壳高为筛选指标，筛选出耐高盐且生长快的二倍体新品系，再以此选育出耐高盐且生长快的四倍体诱导系，再以壳高为筛选指标，筛选出耐高盐且生长快的四倍体新品系，以耐高盐且生长快的四倍体新品系和耐高盐且生长快的二倍体新品系为父母本获得耐高盐且生长快的三倍体新品系。

5、具体步骤为：

6、a、耐高盐的二倍体群系筛选：分别在盐度变化大的香港牡蛎主养区采集不同的地理群系，在盐度为24‰～28‰的海水中人工暂养并促熟亲贝，然后人工解剖并鉴定性别，分别筛选出性腺发育好的雄性个体和雌性个体，人工受精，在盐度24‰～28‰的海水中孵化并培育幼虫，记录各组的孵化参数；分别把不同群系的稚贝同时吊养在若干个盐度为18‰～28‰海域和若干个盐度低于18‰的低盐海域，追踪测量各组的生长、存活、全重，筛选出在高盐和低盐海域都死亡率低的二倍体群系，此即为耐高盐的香港牡蛎二倍体群系；

7、b、耐高盐且生长快的二倍体新品系选育：随机取步骤a耐高盐的香港牡蛎二倍体群系个体，人工暂养并促熟，筛选出壳高前列的个体，解剖、人工受精并培育幼虫，获得f1，把f1吊养在在盐度为18‰～28‰海域；随机若干个存活的f1，人工暂养并促熟，按照壳高前列筛选出个体作为亲本，人工解剖、受精并培育幼虫，获得f2，吊养在盐度为18‰～28‰海域；参照上述条件，再持续高盐胁迫和壳高大选育1代，获得f3，此即为耐高盐且生长快的香港牡蛎二倍体新品系；

8、c、耐高盐且生长快的四倍体诱导系建立：取步骤b中的耐高盐且生长快的香港牡蛎二倍体新品系若干个，筛选出壳高前列的个体做为亲本，人工解剖受精后，使用6-dmap抑制第二极体释放获得耐高盐且生长快的三倍体；促熟耐高盐且生长快的三倍体，筛选出性腺可育的雌性个体，同时用步骤b中耐高盐且生长快的二倍体新品系作为父本来源，可育的三倍体雌性个体和二倍体雄性个体受精后，用cb抑制第二极体释放获得耐高盐且生长快的四倍体诱导系；

9、d、耐高盐且生长快的四倍体新品系选育：随机取步骤c耐高盐且生长快的四倍体诱导系，筛选出壳高前列的个体作为亲本，进行人工解剖、受精并在盐度为26‰的高盐海水中孵化和培育四倍体幼虫，然后把四倍体稚贝放在盐度为18‰～28‰海域养殖，此为四倍体f1；按照上述步骤，同样筛选出壳高前列的f1作为亲本，进行人工受精和高盐胁迫养殖，获得f2，此即为耐高盐且生长快的香港牡蛎四倍体新品系；

10、e、耐高盐且生长快的三倍体新品系生产:把步骤b中耐高盐且生长快的香港牡蛎二倍体新品系和步骤d中耐高盐且生长快的香港牡蛎四倍体新品系在盐度为24‰～28‰的海水中暂养并促熟；然后人工解剖和鉴定四倍体倍性，筛选出二倍体雌性和四倍体雄性，在盐度为26‰的海水中受精、孵化和培育，此即为耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系。

11、经过以上环节，获得耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系，此新品系具有耐高盐、生长快、育性差、抗逆性强、品质高、可全年上市的优点。

12、优选，步骤a所述的香港牡蛎主养区是指盐度变化范围在18‰～28‰且每年有超过4个月的时间盐度超过24‰的香港牡蛎养殖区。

13、优选，步骤a所述的不同的地理群系，是指苗种来源为野生附苗、附苗地点不同且已经养殖超过2年的牡蛎群系。

14、优选，步骤a所述的性腺发育好的雄性个体和雌性个体是指雄性个体的精子放在海水中在显微镜下跳动活跃且精母细胞少，雌性个体的卵子放入海水中后超过80％的卵子在40分钟内变圆且卵子无缺可、大小一致。

15、优选，步骤a所述的孵化参数是指受精率、卵裂率和d幼率。

16、优选，步骤a所述的筛选出在高盐和低盐海域都死亡率低的二倍体新品系是为了保证筛选出的二倍体群系在耐受高盐的同时也保留了香港牡蛎适应低盐的特性，因为香港牡蛎的养殖区靠近河口区，盐度变化范围大，部分时间海水盐度会较低。

17、优选，步骤b所述的耐高盐胁迫包括人工受精后孵化、幼虫培育、稚贝中培和海上养殖都需要经受高盐胁迫选育。

18、优选，步骤b中筛选出壳高前列的个体是壳高前5％的个体，它们作为亲本的原因是，选育出生长快的香港牡蛎二倍体新品系。

19、优选，步骤b所述的人工暂养并促熟，其海水盐度为24‰～28‰，培育幼虫的海水是26‰盐度。

20、优选，步骤c中使用6-dmap抑制第二极体释放时，6-dmap的浓度为100mg/l,处理的卵子密度为1×107个/l,处理时机为受精后20min，处理持续时间为25min。

21、优选，步骤c中使用cb抑制第二极体释放时，cb浓度为0.40mg/l,处理的卵子密度为5×106个/l，处理时机为受精后30min，处理持续时间为45min。

22、优选，步骤d中筛选鉴定出四倍体个体，指在用二倍体作为对照的情况下，用流式细胞仪鉴定出四倍体。

23、本发明结合使用了选择育种和多倍体育种技术,通过采集不同地理群体并筛选耐高盐群系、然后通过持续耐高盐胁迫和壳高选育3代获得耐高盐且生长快的香港牡蛎二倍体新品系、再利用三倍体和四倍体诱导技术获得耐高盐且生长快的香港牡蛎四倍体诱导系、进而开展耐高盐胁迫和壳高选育2代获得耐高盐且生长快的香港牡蛎四倍体新品系、最后用耐高盐且生长快的四倍体新品系雄性和耐高盐且生长快的二倍体新品系雌性杂交获得耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系，成功实现对香港牡蛎耐高盐、育性差、生长快的遗传改良。

24、本发明主要是基于香港牡蛎二倍体的不能耐高盐、性腺发育周期长特性引起死亡率高、品质差、生长慢、不能全年上市的产业问题，通过选择育种和多倍体育种的科学有效结合对香港牡蛎进行高盐胁迫、生长选育和多倍体化育种，以期获得耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系。本发明充分利用了选择育种技术对香港牡蛎耐高盐和生长性状的改良和多倍体育种技术对香港牡蛎性腺发育的改良，获得了兼具选育优势和多倍体优势的新品系，具有耐高盐、育性差、生长快、抗逆性强、品质好、可全年上市的优势，具有重大的商业化推广应用潜力和价值。通过本发明获得的耐高盐且生长快的香港牡蛎三倍体新品系比未选育的香港牡蛎二倍体在高盐海域(盐度20‰～28‰)存活率提高了126.19％～207.84％、生长提高了55.10％～64.40％且可育比例降低至8.74％～11.37％(二倍体100％可育)，比耐高盐且生长快的香港牡蛎二倍体在高盐海域存活率提高了21.55％～24.92％、生长提高了9.75％～12.65％且可育比例降低了8.74％～11.37％(二倍体100％可育)。

25、本发明对香港牡蛎的耐高盐、生长和育性性能进行了显著改良，获得的耐高盐新品系同时生长快且育性差，育性差有利于新品系的种权保护。因此，本发明具有适应性强、商业化应用潜力大、易于保护种权、可操作性强等优点。