一种RB1突变体在神经退行性疾病中的应用

本发明属于生物，特别涉及一种rb1突变体在神经退行性疾病中的应用。

背景技术：

1、患者基因组的分析发现了一种变异，但不清楚这种变异是否真的与健康状况有关时，这种发现被称为不确定意义变异(简称vus)。在许多情况下，这些变异在人群中非常罕见，以至于关于它们的信息很少。通常需要更多的信息来确定变异是否与疾病有关。这类信息可能包括更广泛的人口数据、功能研究，以及追踪具有或不具有相同健康状况的其他家庭成员的变异。

2、在检查个人基因组时突然出现的绝大多数新变异都不能明确地归类为致病或不致病，它们被称为未知或不确定意义的变异。科学家对特定家庭、群体或人群中所见的变异信息掌握得越多，他们对变异的分类就越准确。这个人群中vus的数量比其他人群要少。目前，欧洲血统的人的基因组信息相对其他群体要广泛得多，导致其他群体中有更多的vus，这使得识别引起疾病的变异变得更加困难。

3、神经退行性疾病的特征是特定神经元群的逐渐丧失。特定神经元凋亡与神经退行性疾病的发病机制有关，包括阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、亨廷顿病(hd)、肌萎缩性侧索硬化(als)。研究人员对rb1缺失小鼠的研究表明，rb1缺失会导致神经系统、晶状体和骨骼肌的大量凋亡。另有研究人员发现rb1的过度磷酸化与神经退行性疾病相关。如已经在ad患者、als患者和pd患者的病理组织中检测到rb1的过度磷酸化。敲除小鼠nrmt1可导致rb1失活，最终诱发神经退行性疾病，而ad相关基因早老素1(ps1)可通过抑制rb1的磷酸化来保护后期神经元死亡。虽然rb1的高磷酸化与神经退行性疾病相关，但rb1基因突变与神经退行性疾病中vus的研究尚未有相关的报道。

4、在斑马鱼体内的研究可以巧妙地用来缩短基因诊断和功能研究之间的差距。斑马鱼模型与最新的诱变技术兼容，便于破译基因突变引起的基本病理机制，为vus功能表征开辟了新的途径。由于斑马鱼体外受精，斑马鱼胚胎可以在单细胞期微注射体外转录mrna，以过表达致病相关蛋白。该技术已被用于表达与神经系统疾病相关的患者特异性基因突变，如肌萎缩侧索硬化症或小纤维神经病。因此，斑马鱼可作为验证人类vus的有利工具。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种突变体斑马鱼在制备神经退行性疾病的动物模型中的应用。

2、本发明的另一目的在于提供rb1突变体在制备诊断或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种突变体斑马鱼在制备神经退行性疾病的动物模型中的应用，所述突变体斑马鱼为zrb1-ko突变体斑马鱼；

5、所述的zrb1-ko突变体斑马鱼为斑马鱼rb1基因2号外显子上第67和68位缺失2个碱基后形成的突变体，会产生一个提前终止密码子使蛋白翻译提前终止，使正常rb1蛋白不能表达，丧失正常的rb1基因功能。

6、所述的zrb1-ko突变体斑马鱼的幼鱼呈现出运动功能异常。

7、所述的zrb1-ko突变体斑马鱼的成年杂合子(zrb1-ko+/-)呈现出记忆和认知功能障碍。

8、所述的zrb1-ko突变体斑马鱼的后脑神经元凋亡增加，进而引起后脑小胶质细胞增加。

9、所述的zrb1-ko突变体斑马鱼的后脑神经元凋亡增加的表型能够被斑马鱼rb1基因的mrna部分拯救。

10、所述的zrb1-ko突变体斑马鱼通过talen(transcription activator-like(tal)effector nucleases)技术进行靶向基因敲除。

11、所述的斑马鱼rb1基因的talen靶点序列如下：

12、左臂识别序列为：ccagtccactaact；

13、右臂识别序列为：ctcccatattctccat。

14、所述的zrb1-ko突变体斑马鱼的后脑神经元凋亡是有丝分裂后神经。

15、所述的rb1通过kmt5b-bcl2a/caspase轴调控后脑有丝分裂后(post-mitotic)神经元凋亡。

16、rb1蛋白突变体在制备诊断和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用，其中，rb1蛋白突变体为r621s和l819v中的至少一种。

17、本发明通过对神经退行性患者中rb1的高频突变r621s和l819v vus临床位点验证，发现该位点在神经元凋亡中具有重要作用。

18、发明总体构思为：

19、(1)我们与广州金域医学检验中心合作，他们为我们提供从2017-2020年所收录的所有病人信息，我们在其中筛选出神经退行性疾病患者的信息，然后将神经退行性疾病患者按照pd/ad/hd/als类型进行分组，在找出这些患者中发生rb1突变的患者信息，最后对所有神经退行性疾病患者中发生rb1突变的信息进行汇总，分析出rb1的突变频率及突变位点。

20、(2)神经退行性疾病的特征是进行性认知功能障碍和行为异常，使用zrb1-ko斑马鱼进行斑马鱼行为学及t迷宫实验。此外分析rb1缺失影响的神经元类型及神经元凋亡通路。

21、(3)使用ao染色验证人rb1的突变位点在zrb1-ko突变体斑马鱼中对神经元凋亡的影响。

22、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

23、(1)本发明通过分析检验中心收集的神经退行性疾病患者检测结果和组织学随访结果，对神经退行性疾病中rb1的突变频率及突变类型进行统计，并对rb1突变斑马鱼进行行为学分析，首次发现临床测序数据分析发现2-3％的神经退行性疾病患者中存在rb1突变，其中对神经退行性患者中rb1的高频突变r621s和l819v vus临床位点验证，发现该位点在神经元凋亡中具有重要作用；另外，本发明首次验证了人rb1的r621s和l819v突变在神经元凋亡中的致病性。

24、(2)本发明中构建了zrb1-ko突变体，可以实现：①新突破：尚未出现有效的人类神经退行性疾病斑马鱼模型；②高通量：每对斑马鱼每周可以产卵上百颗可供使用；③低损害：斑马鱼行为学实验对斑马鱼无额外伤害；④操作方便：斑马鱼行为学实验可直接进行视频追踪，随后进行分析即可；⑤低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于老鼠，平均每天每只消费约为老鼠的1/100。

25、(3)本发明中rb1缺陷突变体表现出显著的后脑神经元凋亡和后脑小胶质细胞浸润增加，这些表型可以通过野生型zrb1 mrna部分挽救；zrb1-ko突变体中的凋亡细胞是后脑有丝分裂后神经元，rb1调节有丝分裂后神经元凋亡独立于其对神经干祖细胞增殖的影响。

26、(4)本发明中发现zrb1-ko突变体斑马鱼幼鱼和rb1成年杂合子体现出运动和记忆学习功能障碍，并且zrb1-ko突变体斑马鱼呈现出后脑有丝分裂后神经元凋亡增加，并且通过kmt5b-bcl2/caspase通路调节凋亡，即rb1可以结合kmt5b抑制bcl2a/caspase的表达，调节凋亡通路，维持有丝分裂后神经元的存活。