Gli-A2p-null位点优异等位变异的面包小麦的应用及其创制方法

本技术属于生物育种，具体涉及gli-a2p-null位点优异等位变异的面包小麦的应用及其创制方法。

背景技术：

1、小麦是全球最重要的粮食作物之一，世界上约有40％的人口以小麦面粉食品为主食，因此小麦品质、产量等性状的基础与遗传改良研究备受各国政府和科研究人员的重视。小麦作为全球三大谷物之一，提供了全球人口20％的蛋白质和能量，增加小麦产量对稳定全球粮食安全具有重要意义。我国小麦的种植面积、总产及消费量均居世界首位。

2、小麦是重要的粮食作物，多种多样的面制品深受民众的喜爱。小麦中的面筋是小麦加工品质的形成基础，面能够拉伸是因为面筋存在。面粉中独特的面筋蛋白是决定面团品质特性的主要因素之一，它们决定了面团的揉混特性和稳定特性，进一步决定了面包的烘焙性(payne and corfield等，1979年)。面筋蛋白主要由麦谷蛋白和醇溶蛋白组成。面筋蛋白的种类和含量决定了小麦面粉的终用途。面筋蛋白分为麦谷蛋白和醇溶蛋白。麦谷蛋白存在于小麦第一同源群上。ω、γ和α/β醇溶蛋白编码的基因存在于小麦第一同源群短臂的gli-1位点上，与低分子量麦谷蛋白紧密连锁。麦谷蛋白分为高分子量麦谷蛋白和低分子量麦谷蛋白，决定面筋和面团的强度和弹性(anjum等，2008)。高分子量麦谷蛋白亚基的等位变异和组成会直接影响到面包的烘焙质量并因此被人们广泛的研究。醇溶蛋白根据电泳中迁移率中的差别分为ω、γ和α/β醇溶蛋白，并通过非共价键和麦谷蛋白作用影响面筋的延展性。虽然醇溶蛋白占面筋蛋白的50％以上，但它在面团加工过程中的作用仍然不能像高分子量麦谷蛋白亚基一样明确。醇溶蛋白由多基因家族编码，成簇状遗传，醇溶蛋白对面团品质的贡献很难予以研究(nadeem等，2016)。

3、α/β醇溶蛋白编码的基因位于普通小麦(triticum aestivum l.，aabbdd，2n＝6x＝42)第六同源群短臂上的三个gli-2位点，每个位点中α/β醇溶蛋白基因数目众多，序列相似度高。α/β醇溶蛋白约占总醇溶蛋白含量的50％到60％，可以说α/β醇溶蛋白是面筋蛋白中最多，也是变异最大的一类面筋蛋白(halstead-nussloch等，2021)。α/β醇溶蛋白中的hla-dq2.5限制性抗原表位glia-α1a(pfpqpqlpy)、glia-α1b(pypqpqlpy)、glia-α2(pqpqlpypq)、glia-α3(frpqqpypq)和hla-dq8，限制性抗原表位glia-α1(qgsfqpsqq)、hla-dq8.5glia-α1(qgsfqpsqq)，经过脱酰胺作用之后成为烈性刺激物激活特异性cd4+t细胞，诱导后产生强烈的适应性免疫响应，是诱导乳糜腹泻病主要过敏原蛋白(pisapia等，2016)。

4、不同蛋白组分在面团加工过程中行使不同功能，最终决定面团的加工品质。利用突变体和基因沉默技术能够快速地了解未知基因的功能，是研究小麦的面筋蛋白功能的有效手段，如化学诱变技术(如ems)，基因沉默技术(如rnai)等(fu等，2007)。然而，由于醇溶蛋白基因的高拷贝数、高度相似性和高重复序列等特点，化学诱变很难达到同一位点多个基因同时沉默的效果；在小麦中，利用rnai技术降低醇溶蛋白含量，影响到面团的延展性，导致面包体积的减小；醇溶蛋白的降低显著降低了乳糜腹泻病抗原多肽，且显著提高了小麦面粉中的赖氨酸含量，增加了面粉的营养品质(zhao等，2004)。在合成蛋白且在能量有限的情况下，合成的蛋白占的量是此消彼长的，如果将部分醇溶蛋白缺失，那么就有更多的氨基酸去合成谷蛋白。α/β醇溶蛋白基因显著降低，导致其它类面筋蛋白的上升补偿效应，面团与对照相比无明显变化，面筋抗性增加，延展性轻微降低(becker等，2012)。大幅降低醇溶蛋白含量，可能引起面团加工品质的显著下降，如烘焙面包的体积减小(mickowska等，2016)。而近年兴起的基因组编辑技术，如crispr/cas9系统在敲除高拷贝基因时也存在诸多难题。

5、以上突变方法都很难创制出有效的并符合我国生产应用的醇溶蛋白座位缺失突变体。所以，为了研究某一座位醇溶蛋白的功能，有针对性的降低醇溶蛋白含量并对面团品质的影响具有较好的生产应用的现实意义。

技术实现思路

1、本技术要解决的技术问题是：如何提高小麦籽粒加工品的品质，例如如何提高小麦面粉的品质和/或所述面粉制备的面包品质。

2、为解决上述技术问题，本技术提供加工品，所述加工品是由包括小麦的原料制成(所述加工品的制备原料包括小麦)的产品，所述小麦不含醇溶蛋白基因，所述醇溶蛋白基因为α/β3基因、α/β4基因和α/β5基因。

3、所述α/β3基因为核苷酸序列是seq id no.1的dna分子，所述α/β4基因为核苷酸序列是seq id no.2的dna分子，所述α/β5基因为核苷酸序列是seq id no.3的dna分子。

4、进一步地，所述的加工品中，所述小麦可为小麦(triticum sp.)ga2pn，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.45699。

5、进一步地，所述的加工品中，所述加工品可选自面粉、小麦淀粉、食品和/或发酵产品。

6、本技术中，所述加工品不属于专利法所称的植物。所述加工品无繁殖能力，也不具有借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的能力。

7、本技术中，所述加工品可为小麦面粉(如面包粉、饺子粉、饼干粉、面条粉、蛋糕粉、颗粒粉、营养强化粉、自发馒头粉、煎炸粉、预配粉等)，小麦淀粉，食品(如热加工或冷加工制作的食品、蒸制或烘焙制作的食品，如面包，馒头，饼干，面条等，例如发酵加工品，包括饮料、酒类，如啤酒、白酒、酒精，例如生物燃料等。

8、所述小麦的籽粒与普通小麦小偃81相比，具有以下任一项或几项特征：a1)麦谷蛋白含量提高；a2)高分子量麦谷蛋白含量提高；a3)低分子量麦谷蛋白含量提高；a4)籽粒中α/β醇溶蛋白含量降低；a5)籽粒中总醇溶蛋白含量降低。

9、所述面粉为以小麦(triticum sp.)ga2pn的籽粒制成的面粉，该面粉与以普通小麦小偃81的籽粒制成的面粉相比，具有以下至少一种特征：b1)、面粉沉降值提高；b2)、面粉湿面筋含量提高；b3)、面粉面筋指数提高；

10、所述食品可为面包。所述面包可为以小麦(triticum sp.)ga2pn的籽粒制成的面粉为主料制成的面包，该面包与以普通小麦小偃81的籽粒制成的面粉为主料制成的面包相比，面包品质提高，所述面包品质选自下述至少一种：体积，外形，表皮质地，表皮色泽，面包心色泽，平滑度，纹理结构，弹柔性、口感和香味。

11、本技术还提供上述小麦在制备加工品中的应用。

12、所述加工品可为上述的至少一种加工品。

13、本技术还提供上述小麦在小麦育种中的应用。

14、所述小麦育种的育种指标包括下述至少一种：籽粒的麦谷蛋白含量、籽粒中α醇溶蛋白含量、籽粒中总醇溶蛋白含量、籽粒的中高分子量麦谷蛋白含量和籽粒的低分子量麦谷蛋白含量、由小麦籽粒制成的面粉沉降值、由小麦籽粒制成的面粉湿面筋含量、由小麦籽粒制成的面粉面筋指数、由小麦籽粒制成的面粉制作面包的面包体积、由小麦籽粒制成的面粉制作的面包的品质。

15、所述小麦育种的育种目的包括培育具有下述至少一种性状的小麦：

16、籽粒的麦谷蛋白含量高(高于亲本)的小麦，

17、籽粒的麦谷蛋白含量高(高于亲本)的小麦，

18、籽粒中α/β醇溶蛋白含量低(低于亲本)的小麦，

19、籽粒中总醇溶蛋白含量低(低于亲本)的小麦，

20、由小麦籽粒制成的面粉沉降值提高(高于亲本)的小麦，

21、由小麦籽粒制成的面粉湿面筋含量提高(高于亲本)的小麦，

22、由小麦籽粒制成的面粉面筋指数提高(高于亲本)的小麦，

23、由小麦籽粒制成的面粉制作面包的面包体积提高(高于亲本)的小麦，

24、由小麦籽粒制成的面粉制作的面包的品质提高(高于亲本)的小麦，

25、所述面包品质选自下述至少一种：体积，外形，表皮质地，表皮色泽，面包心色泽，平滑度，纹理结构，弹柔性、口感和香味。

26、本技术还提供上述醇溶蛋白基因或调控所述醇溶蛋白基因的表达的物质在调控小麦籽粒性状中的应用，所述小麦籽粒性状包括下述任意一种或者几种：

27、a1)、籽粒中麦谷蛋白含量；

28、a2)、籽粒中高分子量麦谷蛋白含量；

29、a3)、籽粒中低分子量麦谷蛋白含量；

30、a4)、籽粒制备的面粉沉降值；

31、a5)、籽粒制备的面粉湿面筋含量；

32、a6)、籽粒制备的面粉面筋指数；

33、a7)、籽粒制备的面粉制作面包的体积；

34、a8)、籽粒制备的面粉制作的面包的品质；

35、a9)、籽粒中α/β醇溶蛋白含量；

36、a10)、籽粒中总醇溶蛋白含量。

37、本技术还提供检测上述醇溶蛋白基因的引物。

38、本技术中，所述引物包括检测α/β3基因、α/β4基因和α/β5基因的引物对。

39、本技术中，所述检测α/β3基因的引物对为α/β3-f和α/β3-r，所述α/β3-f为核苷酸序列是seq id no.4的单链dna分子，所述α/β3-r为核苷酸序列是seq id no.5的单链dna分子。

40、本技术中，所述检测α/β4基因的引物对为α/β4-f和α/β4-r，所述α/β4-f为核苷酸序列是seq id no.6的单链dna分子，所述α/β4-r为核苷酸序列是seq id no.7的单链dna分子。

41、本技术中，所述检测α/β5基因的引物对为α/β5-f和α/β5-r，所述α/β5-f为核苷酸序列是seq id no.8的单链dna分子，所述α/β5-r为核苷酸序列是seq id no.9的单链dna分子。

42、本技术中，所述加工品质改良小麦中是否含有醇溶蛋白基因可通过检测所述醇溶蛋白基因的引物测定获得。

43、以待测小麦的基因组dna为模板，引物对为α/β3-f和α/β3-r作为扩增引物如果可以扩增出180bp大小的dna片段，则待测小麦含有α/β3醇溶蛋白基因；如果不能扩增出180bp大小的dna片段，则待测小麦中不含有α/β3醇溶蛋白基因。

44、以待测小麦的基因组dna为模板，引物对为α/β4-f和α/β4-r作为扩增引物如果可以扩增出414bp大小的dna片段，则待测小麦含有α/β4醇溶蛋白基因；如果不能扩增出414bp大小的dna片段，则待测小麦中不含有α/β4醇溶蛋白基因。

45、以待测小麦的基因组dna为模板，引物对为α/β5-f和α/β5-r作为扩增引物如果可以扩增出187bp大小的dna片段，则待测小麦含有α/β5醇溶蛋白基因；如果不能扩增出187bp大小的dna片段，则待测小麦中不含有α/β5醇溶蛋白基因。

46、本技术还提供一种制备加工品质改良小麦的方法，所述方法包括：将命名为小麦a的小麦中的醇溶蛋白基因的表达量降低，得到加工品质改良小麦，所述小麦a为含有α/β3基因、α/β4基因和α/β5基因的小麦；

47、所述醇溶蛋白基因包括α/β3基因、α/β4基因和α/β5基因，所述α/β3基因为核苷酸序列是seq id no.1的dna序列，所述α/β4基因为核苷酸序列是seq id no.2的dna序列，所述α/β5基因为核苷酸序列是seq id no.3的dna序列。

48、相比于所述小麦a，所述加工品质改良小麦具有如下任一项所述的特征：

49、a1)、籽粒中麦谷蛋白含量提高；

50、a2)、籽粒中高分子量麦谷蛋白含量提高；

51、a3)、籽粒中低分子量麦谷蛋白含量提高；

52、a4)、籽粒制备的面粉沉降值提高；

53、a5)、籽粒制备的面粉湿面筋含量提高；

54、a6)、籽粒制备的面粉面筋指数提高；

55、a7)、籽粒制备的面粉制作面包的体积提高；

56、a8)、籽粒制备的面粉制作面包的品质提高；

57、a9)、籽粒中α/β醇溶蛋白含量降低；

58、a10)、籽粒中总醇溶蛋白含量降低。

59、在本技术的一个实施例中，所述小麦a可为小麦小偃81。

60、所述加工品质选自下述至少一种：籽粒中麦谷蛋白含量、籽粒中高分子量麦谷蛋白含量、籽粒中低分子量麦谷蛋白含量、籽粒制备的面粉沉降值、籽粒制备的面粉湿面筋含量、籽粒制备的面粉湿面筋指数、籽粒制备的面粉制作面包的面包体积和面包品质、籽粒中α/β醇溶蛋白含量、籽粒中总醇溶蛋白含量。

61、进一步地，所述的方法中，所述醇溶蛋白基因的表达量降低通过杂交实现；

62、所述杂交包括将以小麦m1作为母本，小麦a作为父本进行杂交得到f1代籽粒，从f1代籽粒中筛选出不含所述醇溶蛋白基因的籽粒种植后与作为轮回亲本的所述小麦a连续回交，得到回交后代籽粒，从回交后代籽粒中筛选出不含所述醇溶蛋白基因的籽粒种植后连续自交，得到加工品质改良小麦；

63、在本技术的一个实施例中，所述加工品质改良小麦可为小麦ga2pn。

64、所述小麦ga2pn在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.45699。

65、小麦ga2pn材料相对于野生型小偃81缺少了3个α/β醇溶蛋白基因，分别是α/β3(seq id no.1)、α/β4(seq id no.2)和α/β5(seq id no.3)。

66、ga2pn的农艺性状为：ga2pn与野生型小偃81的农艺性状相近。冬性，中熟。幼苗匍匐，叶色深绿，叶片较长。株高80厘米，株型较紧凑，抗倒伏能力一般。穗纺缍型，无芒、白壳、白粒，籽粒角质，结实性较好。分蘖力较强，成穗率较高，平均亩穗数42万穗，穗粒数34粒，千粒重40克。冬季抗寒性强，抗倒春寒。旗叶干尖较重。慢条锈病，中感纹枯病和秆锈病，高感叶锈病、白粉病和赤霉病。

67、即小麦ga2pn材料与小偃81野生型农艺性状相近。小麦ga2pn相对于野生型小偃81缺少了3个α/β醇溶蛋白基因，分别是α/β3(seq id no.1)、α/β4(seq idno.2)和α/β5(seqid no.3)。

68、所述小麦ga2pn(triticum sp.)在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.45699。

69、进一步地，所述的方法中，所述连续回交的次数至少为3次。

70、进一步地，所述的方法中，所述连续自交的次数至少为4次。

71、进一步地，所述的方法中，所述连续回交的次数为3次，所述连续自交次数为4次。

72、进一步地，所述的方法中，所述连续回交包括在bc1f1代、bc2f1代和bc3f1代中分别筛选出不含所述醇溶蛋白基因的籽粒的步骤。

73、进一步地，所述的方法中，所述连续自交包括在bc3f2代、bc3f3代和bc3f4代中分别筛选出不含所述醇溶蛋白基因的籽粒的步骤。

74、所述小麦m1不含所述醇溶蛋白基因。

75、所述加工品质改良小麦不含所述醇溶蛋白基因。

76、物理辐射技术-离子束诱变，即将离子束作为诱导因素，注入到小麦种子中，除了能够诱导小片段的突变和置换外，还能导致大片段的dna损坏，从而形成大片段的插入、缺失和易位，从而获得各种各样的改变，是诱变育种方式之一。其中，片段缺失最为常见。发明人利用离子束诱变筛选到醇溶蛋白位点的突变，较快的得到理想的缺失突变体。

77、本技术通过离子束辐射诱变的方法使醇溶蛋白的gli-a2位点发生部分缺失，降低α/β醇溶蛋白含量，能够从中选择优异等位变异，提高小麦加工品质。

78、术语“降低”、“减少”或“减小”可互换。例如，与对照植物相比，醇溶蛋白基因表达和/或醇溶蛋白含量降低至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％、40％或50％，或更多。术语“增加”、“提高”或“增强”可互换。例如，与对照植物相比，谷醇比增加至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％、40％或50％，或更多。

79、在一些实施方案中，对照植物可以是未进行所述操作的植物，如未降低或缺失所述基因的植物。确定具体基因表达的方法是本领域已知的，包括例如northern和/或western分析。

80、在一些实施方案中，本技术还涉及本文所述的基因和/或蛋白的应用，例如用于产生基因修饰的植物，以获得改善产品品质，如面粉蛋白特性、粉质仪参数和拉伸仪参数。在一些实施方案中，可以通过在植物如小麦中降低或缺失所述基因来获得品质改善的产品。

81、本技术通过用离子束辐射诱变小偃81成熟籽粒，然后采用a-page分析诱变后代的醇溶蛋白组成，筛选到缺失3个α/β醇溶蛋白基因的gli-a2p位点的缺失突变体。

82、本技术将突变体与野生型回交3代，然后自交4代后，得到了与小偃81遗传背景一致，但只有缺失3个α/β醇溶蛋白基因的遗传材料，命名为小麦ga2np(triticumsp.)。

83、本技术利用rna-seq技术，比较野生型与突变体的6a染色体的转录组序列，发现ga2pn缺失3个α/β醇溶蛋白基因。

84、本技术根据3个α/β醇溶蛋白基因的序列，开发了3对as-pcr特异引物，其可鉴定gli-a2p位点的α/β醇溶蛋白基因。在一些实施方案中，本技术发现在小麦材料中通过本技术优选的引物可以得到3个正确扩增的ga2pn材料缺失的3个醇溶蛋白基因，所述醇溶蛋白基因为α/β3、α/β4、和α/β5，并且所述小麦材料具有多方面品质参数显著改善，例如沉降指数、面筋指数、湿面筋含量等方面品质参数明显优于野生型。

85、在一些实施方案中，本技术的各个方面尤其涉及缺失或降低表达的gli-a2p位点的α/β醇溶蛋白基因和/或其表达产物(即其表达的蛋白)，优选的所述α/β醇溶蛋白基因选自下述3个α/β醇溶蛋白基因中的1、2或3个基因：α/β3、α/β4和α/β5。在一些实施方案中，本技术所述醇溶蛋白基因包括α/β3、α/β4和α/β5。在一些实施方案中，本技术的各个方面尤其涉及上述3个基因以及选自剩余三个基因(和/或其表达的蛋白)的任意1、2或3个的组合。

86、与现有技术相比，本技术具有以下有益技术效果：

87、本技术通过测定突变体和野生型的面粉蛋白特性，发现突变体ga2pn的多方面品质参数显著改善，例如沉降值、湿面筋含量、面筋指数等方面品质参数明显优于野生型。本技术达到了显著提高小麦面团品质和面包的烘焙品质的目的，具有重要的应用价值。

88、本技术获得的突变体小麦ga2pn(triticum sp.)在育种方面具有重要的应用价值，可作为优质的育种材料。

89、保藏说明

90、材料名称：小麦ga2pn

91、拉丁名：triticum sp.

92、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

93、保藏机构简称：cgmcc

94、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

95、保藏日期：2024年1月17日

96、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.45699。