一种免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法与流程

本发明涉及疾病模型构建，具体而言，涉及一种免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法。

背景技术：

1、动脉粥样硬化或冠状动脉疾病(cad)是最常见的心血管疾病(cvd)，其主要成分是大动脉的脂质堆积和炎症，最终可能导致其临床并发症、心肌梗死(mi)和中风。作为一种进展缓慢的疾病，临床上显著的动脉粥样硬化主要发生在老年人身上，尽管在一些国家的发病率下降，但仍是全球死亡的主要原因。动脉粥样硬化病变的特征是脂质、炎性细胞、平滑肌细胞和坏死性细胞碎片在血管内壁单层内皮细胞下的内膜空间长期积聚和转化。

2、目前动脉粥样硬化的主要治疗药物有他汀类药物(statins)、胆固醇吸收抑制剂(ezetimibe)、pcsk9抗体(pcsk9 inhibitors)等，这些药物主要通过降低患者的血脂水平、抑制炎症等来达到治疗效果。然而目前的治疗药物难以实现斑块的逆转，即使通过药物降低胆固醇水平，已经形成的动脉粥样斑块也难以完全逆转。同时患者之间存在个体差异，一些患者可能对某些药物产生耐受性，导致治疗效果下降。同时，某些药物可能会引发不良的副作用，限制了其长期使用。因此，研发能针对更多动脉粥样硬化患者的治疗药物具有重要意义。

3、小鼠模型作为药物开发的重要工具，被广泛应用于动脉粥样硬化的机制研究和药物开发中。目前最常用的小鼠模型为apoe基因敲除小鼠模型和ldl受体基因敲除小鼠模型。这些小鼠因为缺乏apoe基因或ldl受体基因而出现胆固醇代谢异常，易患动脉粥样硬化。它们在高胆固醇饮食的刺激下，形成斑块，模拟了人类动脉粥样硬化的一些特征。但是，目前apoe基因敲除小鼠模型和ldl受体基因敲除小鼠模型也存在一些问题，限制了动脉粥样硬化的机制研究和药物开发。首先，apoe和ldl受体基因敲除小鼠常使用c57bl/6小鼠作为基因背景，而基因背景可能对动脉粥样硬化的表型产生影响，且单一的基因背景仅能模拟部分临床患者。其次，在正常饮食条件下，apoe和ldl受体基因敲除小鼠出现动脉粥样硬化和胆固醇升高表型很晚，需要加上高脂饮食诱导16周左右才能出现较明显的动脉粥样硬化斑块，表型的呈现耗费时间周期长且不稳定。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，从而构建免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型，该小鼠模型可以有效增加小鼠的基因多样性，模拟不同人群的基因背景。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其包括如下步骤：

4、s1：针对多种野外雄性小鼠进行全基因组测序，获得与c57bl/6小鼠差异的100-200个差异snps位点；

5、s2：分别取多种野外雄性小鼠的精子与多个c57bl/6小鼠的卵子分别进行体外受精，经发育获得多个f1代小鼠；对多个f1代小鼠进行snps检测；从中挑选某一特定染色体，筛选出与供体野外小鼠相比，在特定染色体上的差异snps位点信息最接近的f1代小鼠作为配繁小鼠；

6、s3：将配繁小鼠与c57bl/6小鼠进行配繁，每一代均检测snps位点信息，并根据snps位点信息结果挑选特定染色体与野外小鼠最接近，其余染色体上的snps信息与c57bl/6小鼠接近的小鼠继续进行配繁；

7、s4：配繁后，获得特定染色体的snps位点信息与野外家鼠一致，其他染色体上的snps信息与c57bl/6小鼠一致的野化鼠；

8、s5：对野化鼠进行基因编辑，以获得动脉粥样硬化小鼠模型；基因编辑是指敲除目标野化鼠的动脉粥样硬化相关基因，动脉粥样硬化相关基因选自apoe基因、ldl受体基因和slfn4基因中的至少一种。

9、本发明通过体外辅助生殖和基因编辑技术，在c57bl/6小鼠中引入了不同(品系和/或地区)野外小鼠的染色体构建野外小鼠来源的染色体替换系(以下简称“野化鼠”)，可以有效增加小鼠的基因多样性，进而模拟不同人群的基因背景。在野化鼠上进一步敲除动脉粥样硬化相关基因，能够增加野化鼠对动脉粥样硬化的易感性，获得了不需要高脂饮食诱导，即可自发出现动脉粥样硬化症状的小鼠模型。本发明免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建，可用于研究动脉粥样硬化的发病机制，用于筛选和评价针对动脉粥样硬化的药物。此外，采用本发明提供的方法构建的小鼠模型，其血脂分布与人类动脉粥样硬化患者更加接近，能够更为真实地模拟人类动脉粥样硬化，这有助于人们研究动脉粥样硬化的发病机制、筛选和评价针对动脉粥样硬化的药物。

10、在一种可选的实施方式中，步骤s1中，多种野外雄性小鼠可以选择不同地区的野外小鼠(如野外小家鼠)，或野外家鼠进行全基因组测序。选择多个不同地区的小鼠进行全基因组测序，有助于获得更多的差异snps。

11、多种野外雄性小鼠的品系或种类数目至少为2个，或至少为3个，或至少为4个，或至少为5个，或至少为6个，或至少为7个，或至少为8个，或至少为9个，或至少为10个，或至少为11个，或至少为15个。

12、步骤s2中，筛选出与供体野外小鼠相比，在特定染色体上的差异snps位点信息最接近的f1代小鼠作为配繁小鼠。这样的筛选原则，有助于获得特定染色体最接近野外小鼠的小鼠，从而获得特定染色体上更高野外小鼠背景的繁育材料。

13、特定染色体包括不限于小鼠的第1对染色体至第20对染色体中的任意一种。

14、在本发明应用较佳的实施方式中，符合动脉粥样硬化症表型选自如下至少一种：脂肪增加、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)升高、甘油三酯(tg)升高、总胆固醇(tc)升高、体重增加、肝脏脂肪积累增加、动脉出现斑块、动脉管壁增厚、动脉管壁变硬和动脉管腔狭窄。

15、在本发明应用较佳的实施方式中，特定染色体根据如下方法进行确定：通过对多种野外小鼠进行全基因组测序，明确各条染色体上野外小鼠与实验小鼠c57bl/6小鼠差异的snps，并对差异的snps所在基因进行go和kegg富集分析，确定代谢相关基因富集最多的染色体。

16、在本发明应用较佳的实施方式中，特定染色体为1号染色体。

17、步骤s5在基因编辑前还包括：从野化鼠中挑选出符合动脉粥样硬化症表型的野化鼠作为基因编辑对象。

18、基因编辑技术选自crispr/cas9技术、crispr/cas12a技术、crispr/cas13a技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应物核酸酶技术和cre-loxp基因敲除技术中的至少一种。但在其他的实施例中，在明确了所敲除基因的前提下，采用本领域常规的基因编辑技术是容易实现基因敲除目的的。

19、在本发明应用较佳的实施方式中，在步骤s2中，将受精卵移植到代孕小鼠的输卵管中发育。

20、在本发明应用较佳的实施方式中，将原核阶段或二细胞阶段的受精卵移植到代孕小鼠的输卵管中发育。

21、上述步骤s4中，配繁代数为5-6代。

22、第二方面，本发明还提供了免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法构建的动脉粥样硬化小鼠模型在筛选预防或治疗心血管疾病的药物中的应用。

23、本发明提供的动脉粥样硬化小鼠模型无需高脂饮食诱导，且具有良好的动脉粥样硬化表型，与敲除apoe基因的c57bl/6小鼠相比，动脉斑块症状出现周期提前，且动脉粥样硬化表型更显著。

24、在本发明应用较佳的实施方式中，心血管疾病包括不限于：主动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病、颈动脉粥样硬化、脑动脉粥样硬化、肾动脉粥样硬化和四肢动脉粥样硬化中的至少一种。

25、第三方面，本发明还提供了免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法构建的动脉粥样硬化小鼠模型在评价预防或治疗心血管疾病的药物中的应用。

26、在本发明应用较佳的实施方式中，心血管疾病选自：主动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病、颈动脉粥样硬化、脑动脉粥样硬化、肾动脉粥样硬化和四肢动脉粥样硬化中的至少一种。

27、在本发明应用较佳的实施方式中，心血管疾病为动脉粥样硬化。

28、本发明具有以下有益效果：

29、本发明通过体外辅助生殖和基因编辑技术，在c57bl/6小鼠中引入了不同(品系和/或地区)野外小鼠的染色体构建野外小鼠来源的染色体替换系(以下简称“野化鼠”)，可以有效增加小鼠的基因多样性，进而模拟不同人群的基因背景。在野化鼠上进一步敲除动脉粥样硬化相关基因，能够增加野化鼠对动脉粥样硬化的易感性，获得了不需要高脂饮食诱导，即可自发出现动脉粥样硬化症状的小鼠模型。本发明免高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型的构建，可用于研究动脉粥样硬化的发病机制，用于筛选和评价针对动脉粥样硬化的药物。此外，采用本发明提供的方法构建的小鼠模型，其血脂分布与人类动脉粥样硬化患者更加接近，能够更为真实地模拟人类动脉粥样硬化，这有助于人们研究动脉粥样硬化的发病机制、筛选和评价针对动脉粥样硬化的药物。