一种用于产生母源突变体的斑马鱼品系的构建方法及其应用

本发明属于遗传繁殖，具体涉及一种用于产生母源突变体的斑马鱼品系的构建方法及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、脊椎动物早期胚胎发育的进行依赖在卵子中储存的rna和蛋白质，即母源因子。由于母源产物大都产生于第一次减数分裂的双线期，为了研究这些基因母源产物的功能，需要纯合突变雌性个体，其产生的卵母细胞和胚胎中的母源产物才能被清除。如果基因合子纯合突变致死，得到纯合突变雌性个体几乎不可能，这给研究这些合子突变致死基因的母源产物功能带来很大的困难。为了绕开这个技术障碍，人们开发出生殖细胞替换手术1、镶嵌体2和卵母细胞原位注射3等技术，但这些技术往往实验周期长、技术难度大或实验成本高。

3、为了突破母源因子功能研究的技术瓶颈，我们优化了用crispr/cas9系统进行条件性敲除的策略，建立了在卵母细胞中进行快速条件性敲除的技术，可以实现一个世代获取母源突变体。该系统主要包括两个成分，一是tg(zpc:zcas9)转基因斑马鱼，其在卵母细胞中特异表达cas9蛋白；二是串联3-4个sgrna表达框的转基因质粒系统，可以借助i-sce i转基因体系将sgrna的表达框导入基因组以实现稳定表达。我们借助这一系统成功获得了在卵母细胞中条件敲除的母源突变体4,5。但是之前报导过的tg(zpc:zcas9)转基因品系的基因编辑效率随传代呈现下降趋势，导致现有的tg(zpc:zcas9)转基因品系编辑效率极低。同时该转基因品系是用tol2转座子系统建立的，为了不干扰zpc:zcas9在基因组上的状态，必须用i-sce i介导的转基因导入sgrna表达序列，其效率比tol2低，而且容易出现跨代沉默。因此先前的技术方案编辑效率不稳定，不能兼容高效的sgrna表达载体的导入方式，给实际应用带来了很大困扰。

4、参考文献：

5、1.b.ciruna et al.,production of maternal-zygotic mutant zebrafish bygerm-line replacement.proc natl acad sci u s a 99,14919-14924(2002).

6、2.y.y.xing et al.,mutational analysis of dishevelled genes inzebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulationcell movements.plos genet 14,e1007551(2018).

7、3.x.wu,w.shen,b.zhang,a.meng,the genetic program of oocytes can bemodified in vivo in the zebrafish ovary.j mol cell biol 10,479-493(2018).

8、4.c.zhang et al.,rapid generation of maternal mutants via oocytetransgenic expression of crispr/cas9 and sgrnas in zebrafish.sci adv 7,eabb1237(2021).

9、5.c.zhang et al.,a time-saving strategy to generate double maternalmutants by an oocyte-specific conditional knockout systemin zebrafish.biology10,777(2021).

技术实现思路

1、针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种用于产生母源突变体的斑马鱼品系的构建方法及其应用。具体的，本发明在rbm24a最后一个内含子(即第三个内含子)中成功构建了zpc:zcas9基因敲入品系，基因敲入的cas9表达稳定而且具有很高的基因编辑效率。纯合的基因敲入鱼存活和生殖不受影响，因此rbm24a最后一个内含子的敲入位点实际上可以用于母源基因表达的安全港位点。通过tol2转座子系统将sgrna表达质粒更高效的转基因到斑马鱼中。含有zpc:cas9敲入和sgrna表达载体转基因的品系可以持续传代，每一代都有一定比例的母源突变体胚胎产生，达成一次构建，持续产生母源突变体的效果。本发明构建的zpc:cas9 kirbm24a 3rd intron斑马鱼品系经验证可以高效产生母源突变体，显示其应用于母源基因大规模功能筛选的潜力。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明的第一个方面，提供一种用于产生母源突变体的斑马鱼品系的构建方法，所述构建方法包括：选择rbm24a基因第三个内含子中的基因敲入位点，并通过基因敲入的方式获得在卵母细胞高效特异表达cas9的斑马鱼品系。

4、本发明的第二个方面，提供上述构建方法和/或上述构建方法获得的斑马鱼品系在母源基因大规模功能筛选和/或研究中的应用。

5、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

6、上述技术方案成功构建了用于母源基因条件性敲除的斑马鱼品系zpc:cas9kirbm24a 3rd intron。在该品系中，zpc启动子与cas9连接在一起后敲入rbm24a第三个内含子中，实现cas9蛋白在卵母细胞中高效稳定表达，但不影响rbm24a基因的功能。该基因敲入位点可以作为基因组安全港位点实现基因母源过量表达，而由此构建的zpc:cas9 kirbm24a3rd intron可以用于稳定高效的卵母细胞条件性基因敲除，实现母源基因大规模功能筛选，因此具有良好的实际应用之价值。

技术特征：

1.一种用于产生母源突变体的斑马鱼品系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：选择rbm24a基因第三个内含子中的基因敲入位点，并通过基因敲入的方式获得在卵母细胞高效特异表达cas9的斑马鱼品系。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述基因敲入位点即sgrna靶点，上述sgrna靶点的序列优选为5’-ggctgctgtcatgttgggt-3’(seq id no.1)。

4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述报告基因为荧光蛋白基因。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因。

6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤s3中，所述sgrna序列如seq idno.2所示。

7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤s3中，所述载体质粒的序列如seq id no.6所示。

8.权利要求1-7任一项所述构建方法和/或权利要求1-7任一项所述构建方法获得的斑马鱼品系在母源基因大规模功能筛选和/或研究中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述母源基因是bmp2b基因。

10.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述母源基因是nanog基因。

技术总结本发明属于遗传繁殖技术领域，具体涉及一种用于产生母源突变体的斑马鱼品系的构建方法及其应用。本发明成功构建了用于母源基因条件性敲除的斑马鱼品系zpc:cas9KI<supgt;rbm24a</supgt; <supgt;3rd</supgt; <supgt;intron</supgt;。在该品系中，zpc启动子与cas9连接在一起后敲入rbm24a第三个内含子中，实现Cas9蛋白在卵母细胞中高效稳定表达，但不影响rbm24a基因的功能。该基因敲入位点可以作为基因组安全港位点实现基因母源过量表达，而由此构建的zpc:cas9KI<supgt;rbm24a</supgt; <supgt;3rd</supgt; <supgt;intron</supgt;可以用于稳定高效的卵母细胞条件性基因敲除，实现母源基因大规模功能筛选，因此具有良好的实际应用之价值。技术研发人员：邵明,张伊庄受保护的技术使用者：山东大学技术研发日：技术公布日：2024/6/5