一种斑马鱼紫外线损伤模型的构建方法及应用与流程

本发明属于动物模型构建，具体涉及一种斑马鱼紫外线损伤模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、紫外辐射的波长分布在200～400nm范围内，并分为三个不同的区域，包括uva(300～400nm)、uvb(280～315nm)、uvc(100～280nm)。在到达地球的总紫外辐射中，90％-98％是uva，1％-10％是uvb，uvc基本上被地球大气层中的臭氧层吸收，因此能够对人体产生危害的主要是uva和uvb。尽管uvb辐射是到达地球的全部紫外辐射的一小部分，但是，与uva辐射相比，它能诱导严重的皮肤损伤。近年来，随着环境污染问题日益加剧，臭氧层受到的破坏也随之加重，而皮肤作为机体与外界环境联系最为紧密的器官之一，长期接触到紫外辐射，机体皮肤表皮不仅会变得粗糙松弛干燥，还可能导致色素沉着和色斑等现象，甚至癌症等。

2、目前，最常用于研究紫外损伤的模型主要有细胞模型、3d全层皮肤模型、小鼠皮肤模型、人体皮肤模型。但是细胞模型、3d全层皮肤模型属于体外模型，不能完全真实地反映产品或活性物在皮肤上的效果；化妆品动物试验禁令在全球快速发展也导致了动物模型的使用限制；人体试验虽然是化妆品客观评价和安全、功效宣称的主要方式，但是它测试周期较长，费用昂贵，尤其是紫外辐射会对志愿者造成明显的皮肤损伤；因此，越来越多的研究者开始关注并开发构建更加便捷、准确、高效的紫外损伤生物模型。

3、作为被美国国立卫生院(nih)列为继大小鼠后的第三模式生物，斑马鱼模型具有独特的优势。首先，斑马鱼与人类的基因同源性高达87％，在皮肤生理结构方面与人类具有高度的相似性，含有基底层、棘层、颗粒层、透明层和表皮角质细胞层。其次，斑马鱼的产卵量很大，因此通过斑马鱼模型可以实现多达上百个样品的高通量的筛选。第三，由于斑马鱼胚胎的发育速度很快，大约是哺乳动物的8-10倍，因此测试周期相对较短，通常一个实验的测试周期在3天左右，而试验成本大约是人体试验的1％-10％。第四，斑马鱼胚胎实验过程是在体视显微镜下完成的，大部分实验可以通过显微拍照的方式记录斑马鱼皮肤表面生理变化过程，这种图文记录的呈现方式更加直观、可信。同时，根据欧盟动物保护法，出生5天以内的斑马鱼胚胎和幼鱼不属于动物，可以替代哺乳动物测试，符合3r(替代、减少、优化)原则。因此，斑马鱼作为一种体外动物替代实验模型而越来越受关注。

4、目前，现有研究中也存在通过斑马鱼模型进行抗紫外辐射功效的测试，但是现有的模型构建方法基本都采用uvb波段的单一波长照射，和实际紫外辐射存在一定差异，且评价指标单一，无法有效模拟自然紫外线对皮肤的影响。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种斑马鱼紫外线损伤模型的构建方法及应用，所述构建方法更加贴近自然环境下紫外线对机体的照射条件，使模型更接近于试剂，综合效果更真实。

2、本发明提供了一种斑马鱼紫外线损伤模型的构建方法，包括如下步骤：

3、对置于水中的斑马鱼胚胎紫外线照射10-15min，得到紫外线照射后的斑马鱼胚胎；

4、将所述紫外线照射后的斑马鱼胚胎在养殖水中孵育24-48h，得到斑马鱼紫外线损伤模型；

5、所述紫外线包括uva和uvb，所述uvb和uva的光强比为1:10。

6、优选的，所述斑马鱼胚胎为受精后3天的斑马鱼胚胎。

7、优选的，将所述斑马鱼胚胎和水置于细胞培养板中进行所述紫外线照射，斑马鱼胚胎的数量与水的体积比为10-20枚：5.0-8.0ml。

8、优选的，所述uva的照射强度为2.4j/cm2，uvb的照射强度为0.24j/cm2。

9、优选的，所述紫外线照射的方式为间歇性照射，所述间歇性照射的方式包括，每照射3min，暂停30-40min。

10、优选的，所述孵育的温度为23-33℃。

11、优选的，所述斑马鱼包括ab系斑马鱼。

12、优选的，所述构建方法还包括对得到的紫外线损伤模型的可靠性进行评价；

13、所述评价的方法包括：设置空白对照组，得到空白对照斑马鱼，所述空白对照组除不对斑马鱼胚胎进行紫外线照射之外，其他条件与构建所述斑马鱼紫外线损伤模型的条件相同；

14、比较所述斑马鱼紫外线损伤模型与空白对照斑马鱼的尾鳍皱缩率和黑色素含量，当所述尾鳍皱缩率和黑色素含量在所述斑马鱼紫外线损伤模型与空白对照斑马鱼中具有显著性差异时，表明所述斑马鱼紫外线损伤模型可靠，否则为非可靠斑马鱼紫外线损伤模型。

15、本发明还提供了上述技术方案所述的构建方法在评价产品的抗紫外线辐射能力和/或筛选抗紫外线产品中的应用。

16、有益效果：

17、本发明提供了一种斑马鱼紫外线损伤模型的构建方法，包括如下步骤：对置于水中的斑马鱼胚胎紫外线照射10-15min，得到紫外线照射后的斑马鱼胚胎；将所述斑马鱼胚胎孵育24-48h，得到斑马鱼紫外线损伤模型；所述紫外线包括uva和uvb，所述uvb和uva的光强比为1:10。本发明采用uva和uvb对斑马鱼胚胎进行联合照射建模，所述uva和uvb的组合及光强比更贴近实际紫外线，使模型更接近于实际。

18、进一步的，与现有的紫外线损伤模型构建方法相比，本发明所述构建方法除了能够使斑马鱼的尾鳍产生明显的皱缩外，还能产生黑色素，使得所述构建方法能够从尾鳍皱缩率和黑色素含量两方面评价产品抗紫外辐射的能力，综合效果更真实，能够更有效地评价待测产品的抗紫外辐射能力。

技术特征：

1.一种斑马鱼紫外线损伤模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述斑马鱼胚胎为受精后3天的斑马鱼胚胎。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将所述斑马鱼胚胎和水置于细胞培养板中进行所述紫外线照射，斑马鱼胚胎的数量与水的体积比为10-20枚：5.0-8.0ml。

4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述uva的照射强度为2.4j/cm2，uvb的照射强度为0.24j/cm2。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述紫外线照射的方式为间歇性照射，所述间歇性照射的方式包括，每照射3min，暂停30-40min。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述孵育的温度为23-33℃。

7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述斑马鱼包括ab系斑马鱼。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括对得到的紫外线损伤模型的可靠性进行评价；

9.权利要求1-8任一项所述的构建方法在评价产品的抗紫外线辐射能力和/或筛选抗紫外线产品中的应用。

技术总结本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种斑马鱼紫外线损伤模型的构建方法及应用。本发明采用UVA和UVB对斑马鱼胚胎进行联合照射建模，UVA和UVB的组合及光强比更贴近实际紫外线，使模型更接近于实际紫外线损伤的情况。进一步的，与现有的紫外线损伤模型构建方法相比，本发明所述构建方法除了能够使斑马鱼的尾鳍产生明显的皱缩外，还能产生黑色素，使得所述构建方法能够从尾鳍皱缩率和黑色素含量两方面评价产品抗紫外辐射的能力，综合效果更真实，能够更有效地评价待测产品的抗紫外辐射能力。技术研发人员：章聪,聂韡,高巍,束成杰,杨洋,陈斌,孙姗姗,龚祝南,钱凯受保护的技术使用者：中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/13