一种帕金森病动物模型的构建方法及应用

本发明属于生物，尤其涉及一种帕金森病动物模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、帕金森病(parkinson's disease,pd)是第二常见的神经退行性疾病，在临床上表现为不可控震颤、运动障碍、痉挛、步态异常等。它的病理学特点是中脑黑质多巴胺能神经元的大量变性坏死，及变性神经元胞浆内嗜酸性包涵体—路易体形成。pd相关研究存在三大难点：病因不明，机制不清，治疗匮乏。

2、大量证据表明内质网应激与帕金森病的病理密切相关。与同龄健康患者相比，pd患者脑组织中显示出未折叠蛋白反应(unfolded protein response，upr)通路的激活；并且，在多种不同类型的pd疾病动物模型中，均被发现有内质网应激激活的证据。

3、研究发现将内质网应激诱导剂注射到小鼠大脑中会导致小鼠运动能力减弱、多巴胺能神经元死亡以及神经胶质活化，针对内质网应激的药理学治疗手段可以缓解pd的病理改变。这些证据均表明了内质网应激可能是pd的发病机制之一。因此，深入了解内质网应激对pd的影响和分子机制，不但有助于在分子细胞水平揭示pd及其他神经退行疾病的发生机制，还有助于寻找新的治疗靶点，开发新型的抗pd药物，探索治疗pd的新途径。

4、现有技术用于研究帕金森病的动物模型主要以毒素诱导型为主，包括6-羟多巴(6-ohda)、百草枯(paraquat)、鱼藤酮(rotenone)、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(mptp)等；另外有一些转基因模型小鼠，包括过表达野生型或突变型α-synuclein小鼠、一些基因剔除小鼠如多巴胺d2受体缺失小鼠、同源盒转录因子engrailed 1和engrailed 2双缺失小鼠、孤儿核受体nurr1缺失小鼠、转录因子pitx3缺失小鼠、转录因子lmx1b缺失小鼠、e3泛素连接酶parkin缺失小鼠等。这些模型在不同时间和不同程度可表现出神经元丢失的病理改变，然而机制各不相同。

5、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前转基因帕金森病动物模型较少，且都不能准确模拟内质网应激诱导神经元死亡的病理过程，不利于帕金森疾病发病机制研究和药物研发的进程。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题或不足，为解决现有研究帕金森病的动物模型较少、且准确度相对较低的问题，本发明提供了一种帕金森病动物模型的构建方法及应用，是一种基于内质网应激机制的pd模型，以解决上述技术问题从而推动帕金森疾病发病机制研究和药物研发的进程。

2、一种帕金森病动物模型的构建方法，包括如下步骤：

3、步骤1：修饰非人目标哺乳动物的多巴胺神经元中的同源染色体上的mettl14基因，修饰后使得同源染色体上的mettl14基因产生如下至少一种的效果：(1)mettl14基因不表达；(2)mettl14基因的表达被抑制；(3)mettl14基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能。

4、步骤2：鉴定帕金森病动物模型构建是否成功，包括：(1)检测帕金森病动物模型运动能力和探索能力是否受损；(2)检测帕金森病动物模型中脑黑质区域多巴胺神经元是否变性丢失，神经元树突棘是否减少，神经递质多巴胺是否减少，以及多巴胺神经元功能相关蛋白表达是否下降；(3)检测帕金森病动物模型中脑黑质区域多巴胺神经元中内质网形态是否发生内质网应激相关改变(如水肿、扩张、空腔变性和颗粒溶解等)。

5、步骤3：若步骤2的鉴定未能全部通过，则返回步骤1，循环执行步骤1-2直至步骤2的鉴定完全通过后，完成帕金森病动物模型的构建。

6、进一步的，所述步骤2中采用转棒、爬杆、矿场和高架十字迷宫的方法检测帕金森病动物模型运动能力和探索能力是否受损。

7、进一步的，所述步骤2中采用免疫组化、高尔基染色、免疫印迹和酶联免疫吸附测定的方法检测帕金森病动物模型中脑黑质区域多巴胺神经元是否变性丢失，神经元树突棘是否减少，神经递质多巴胺是否减少，以及多巴胺神经元功能相关蛋白表达是否下降。

8、进一步的，所述步骤2中采用透射电子显微镜的方法检测帕金森病动物模型中脑黑质区域多巴胺神经元中内质网形态是否发生内质网应激相关改变。

9、进一步的，上述方法构建的帕金森病动物模型的应用：使用化合物小分子/核酸/蛋白/药物处理帕金森病动物模型，处理途径包括脑定位注射、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和消化道给药，进而研究帕金森病的发病机制以及研发治疗药物。

10、进一步的，在本发明应用较佳的实施方式中，所述非人目标动物的多巴胺能神经元中的同源染色体进行相同的修饰。同源染色体上进行相同的修饰是指，位于同源染色体上的两个不同位置的mettl14基因具有一样的修饰，即纯合修饰。具有如此修饰的目标动物，必然表现出pd疾病特征。

11、进一步的，在本发明应用较佳的实施方式中，所述修饰为突变、缺失、插入中的一种或几种的组合。例如同时突变mettl14基因的一些碱基，并缺失mettl14基因的一些序列，使得非人目标动物表现出pd神经变性的特征，均在本发明的保护范围之内。因此，无论选用何种修饰，只要使其mettl14基因产生如上步骤1中效果(1)-(3)中的任意一种，使目标动物表现出pd神经变性特征，即属于本发明的保护范围。

12、进一步的，在本发明应用较佳的实施方式中，修饰通过如下技术中的一种或几种的联用实现：基因敲除技术和基因编辑技术；在本发明应用较佳的实施方式中，基因敲除技术为cre-loxp基因敲除技术。在本发明应用较佳的实施方式中，基因编辑技术选自crispr/cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术(z inc-finger nuc leases，zfn)和转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcer ipt ion act ivator-l ike effector nucleases,talen)中的至少一种。本领域的技术人员可以根据需要选择本领域现有的基因修饰技术(一种或几种的组合)对mettl14基因进行修饰，从而使得目标动物表现出pd神经变性特征。

13、进一步的，在本发明应用较佳的实施方式中，所述非人目标哺乳动物包括不限于小鼠、大鼠、马、牛、羊、兔、狗、猪、猴、猿和猩猩中的任意一种。本领域技术人员可以根据需要或兴趣，选择合适的非人哺乳动物作为目标动物，以构建pd神经变性模型。

14、mettl14蛋白(methy ltransferase l ike 14)作为甲基转移酶复合体的核心酶介导rna的m6a甲基化修饰过程，广泛分布于各种类型的组织细胞中。mettl14介导的m6a可能参与了rna转录、选择性剪切、出核转运、翻译以及降解等生物学过程，而导致rna功能紊乱，进而影响一系列的动物生命活动。mettl14被证明参与机体多种病理生理过程，包括在肿瘤发生、神经发育等，但其详细作用机制以及其在多巴胺神经元的生物学功能还不甚明了，限制了其开发应用。

15、发明人创造性地发现，通过对目标动物的多巴胺神经元中的同源染色体上的mettl14基因进行修饰，均可以使得修饰后的目标动物表现出多巴胺神经元变性和内质网应激的病理特征。因此，具有上述mettl14基因修饰的目标动物可作为pd疾病模型，从而用于预防或治疗pd疾病的药物筛选，也可用于pd疾病机制研究，为pd研究提供了新的模型基础。

16、综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明基于帕金森病患者的内质网应激机制，通过对目标动物的多巴胺神经元中的同源染色体上的mettl14基因进行修饰(使mettl14基因不表达，mettl14基因的表达被抑制，或mettl14基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能)；均可使得修饰后的目标哺乳动物表现出多巴胺神经元变性的pd疾病特征。例如多巴胺神经元死亡和丢失、神经元形态改变、多巴胺分泌减少等。因此，具有上述mettl14基因修饰的目标动物可以作为pd疾病模型，可以用于预防或治疗pd的药物筛选，也可以用于pd疾病机制研究，为pd研究提供了新的模型基础，可以帮助阐明pd的发病过程及机制，并为该疾病的治疗或预防提供新的靶标。