一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子组合物、缓释剂及其制备方法与流程

本发明涉及干细胞因子，具体涉及一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子组合物、缓释剂及其制备方法。

背景技术：

1、子宫内膜层（endometrium）是指构成哺乳类子宫内壁的一层，是女性生殖器官的一部分。对雌激素和孕激素都起反应，因此可随着性周期（发情周期、月经周期）发生显著的变化。子宫内膜分为功能层和基底层2层。内膜表面2/3为致密层和海绵层统称功能层，受卵巢性激素影响发生周期变化而脱落。基底层为靠近子宫肌层的1/3内膜，不受卵巢性激素影响，不发生周期性的变化。

2、由于频繁的宫腔操作、感染、缺血等因素引起子宫内膜损伤，可能导致女性出现闭经、月经量减少、反复流产、不孕和胎盘异常等，严重影响女性生殖健康。从细胞层面来看，子宫内膜损伤发生是由于子宫内膜基质细胞的活力降低，甚至经历细胞凋亡，从而诱导子宫内膜萎缩和子宫内膜稳态的破坏。而子宫内膜损伤激活的细胞凋亡信号通路又抑制了子宫内膜血管生成，进而阻碍子宫内膜再生。更重要的是，子宫内膜严重损伤通常是不可自然逆转的。

3、临床上，成功修复和重塑子宫内膜的关键因素在于子宫内膜的再上皮化和血运重建，其次，抗感染和炎症控制是优化子宫内膜新生的重要环境保障。但目前仍没有同时满足以上要求的理想的临床治疗方法，手术以及药物治疗都存在一些副作用或疗效甚微。因此，学者们仍不断探索子宫内膜损伤修复的治疗方法，以改善子宫内膜损伤患者的子宫内膜微环境和耐受性状态，从而提高这些患者的妊娠率。

4、随着技术的不断进步，人们将间充质干细胞附着在可降解的胶原支架材料上，结合宫腔镜技术分离宫腔粘连后，将支架材料和间充质干细胞的复合体移植到宫腔内，使间充质干细胞的覆盖子宫内膜粘连面，促进了子宫内膜血管组织的再生，术后3个月发现子宫内膜血运良好，实现了受损子宫内膜的功能性修复。在子宫内膜损伤的治疗研究中，干细胞疗法得到了广泛的应用，在减少子宫内膜纤维化、修复受损子宫内膜等方面取得了较好的效果。

5、而越来越多的学者认为干细胞的旁分泌作用或许是其参与治疗的主要机制，即干细胞主要依靠其外泌体和分泌的生长因子促进组织修复。干细胞外泌体内包含多种趋化因子、细胞因子以及转录因子等，在子宫内膜再生方面主要通过促进血管再生、刺激宿主子宫内膜细胞活性以及免疫调节等方式减少细胞死亡，并为宿主细胞提供营养支持和促进组织的再生。通过离心、过滤等方式提取得到的干细胞外泌体或生长因子相较于间充质干细胞本身也更为安全，已成为新的研究热点。

6、然而，现有技术中采用干细胞因子治疗子宫内膜损伤的效果有限，直接使用溶液形式的干细胞外泌体或干细胞因子也难以起到持续修复的作用。因此，本发明制作了一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子组合物，不仅疗效更佳，制备为缓释剂还能起到持续修复的作用。

技术实现思路

1、基于现有技术中存在的不足，本发明的目的是利用干细胞因子，提供一种治疗效果更佳的干细胞因子组合物，制备为缓释剂还能起到持续修复子宫内膜损伤的作用。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种子宫内膜间充质干细胞浓缩液，由以下方法制备而成：

4、s1、取第3~6代的人子宫内膜间充质干细胞，在含有体积分数8%~10%fbs的dmem培养基中培养；

5、s2、待细胞生长至汇合度为60~70%时，更换为第二培养基，继续培养20-28小时，收集细胞培养液；

6、s3、将步骤s2得到的细胞培养液用0.22μm的微孔滤膜过滤，再将滤液通过10kd的超滤膜，即得子宫内膜间充质干细胞浓缩液。

7、优选的，所述步骤s1的培养条件为：在co2体积分数为5%、相对湿度为95%、温度为37℃的细胞培养箱中培养。

8、优选的，所述步骤s2中的第二培养基为含有2~6mg/l黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)和体积分数1~3%fbs的dmem/f12培养基。

9、第二方面，本发明提供了一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子组合物，包括以下组分：子宫内膜间充质干细胞浓缩液和重组ⅲ型人源化胶原蛋白。

10、优选的，所述子宫内膜间充质干细胞浓缩液和重组ⅲ型人源化胶原蛋白的质量比为（8~10）：1。

11、第三方面，本发明提供了一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子缓释剂，包含以下组分：子宫内膜间充质干细胞浓缩液，重组ⅲ型人源化胶原蛋白，透明质酸，缓释材料和粘合剂。

12、优选的，所述修复子宫内膜损伤的干细胞因子缓释剂，包含以下质量百分数的组分：40~50%子宫内膜间充质干细胞浓缩液，5%重组ⅲ型人源化胶原蛋白，5~15%透明质酸，20~35%缓释材料和5~15%粘合剂。

13、优选的，所述修复子宫内膜损伤的干细胞因子缓释剂，包含以下质量百分数的组分：50%子宫内膜间充质干细胞浓缩液，5%重组ⅲ型人源化胶原蛋白，12%透明质酸，25%缓释材料和8%粘合剂。

14、优选的，所述子宫内膜间充质干细胞浓缩液，由以下方法制备而成：

15、s1、取第3~6代的人子宫内膜间充质干细胞，在含有8%~10%fbs的dmem培养基中培养；

16、s2、待细胞生长至汇合度为60~70%时，更换为第二培养基，继续培养20~28小时，收集细胞培养液；

17、s3、将步骤s2得到的细胞培养液用0.22μm的微孔滤膜过滤，再将滤液通过10kd的超滤膜，即得子宫内膜间充质干细胞浓缩液；

18、优选的，所述步骤s1的培养条件为：在co2体积分数为5%、相对湿度为95%、温度为37℃的细胞培养箱中培养；

19、优选的，所述步骤s2中的第二培养基为含有2~6mg/l黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)和1~3%fbs的dmem/f12培养基。

20、优选的，所述透明质酸的分子量为800~1000kd。

21、优选的，所述缓释材料可选自乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙甲基纤维素和羟丙基纤维素中的任意一种或者任意两种以上的混合物。

22、优选的，所述缓释材料为羟丙甲基纤维素。

23、优选的，所述粘合剂可选自微晶纤维素和聚维酮。

24、优选的，所述粘合剂为聚维酮。

25、第四方面，本发明提供了一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子缓释剂的制备方法，取子宫内膜间充质干细胞浓缩液，重组ⅲ型人源化胶原蛋白和透明质酸，搅拌混合均匀，加入缓释材料和粘合剂，混合均匀，即得。

26、优选的，所述制备方法为：按质量百分数取40~50%子宫内膜间充质干细胞浓缩液，5%重组ⅲ型人源化胶原蛋白，5~15%透明质酸，搅拌混合均匀，加入20~35%缓释材料和5~15%粘合剂，混合均匀，即得。

27、优选的，所述制备方法为：按质量百分数取50%子宫内膜间充质干细胞浓缩液，5%重组ⅲ型人源化胶原蛋白，12%透明质酸，搅拌混合均匀，加入25%缓释材料和8%粘合剂，混合均匀，即得。

28、优选的，所述子宫内膜间充质干细胞浓缩液，由以下方法制备而成：

29、s1、取第3~6代的人子宫内膜间充质干细胞，在含有8%~10%fbs的dmem培养基中培养；

30、s2、待细胞生长至汇合度为60~70%时，更换为第二培养基，继续培养20-28小时，收集细胞培养液；

31、s3、将步骤s2得到的细胞培养液用0.22μm的微孔滤膜过滤，再将滤液通过10kd的超滤膜，即得子宫内膜间充质干细胞浓缩液；

32、优选的，所述步骤s1的培养条件为：在co2体积分数为5%、相对湿度为95%、温度为37℃的细胞培养箱中培养；

33、优选的，所述步骤s2中的第二培养基为含有2~6mg/l黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)和1~3%fbs的dmem/f12培养基。

34、优选的，所述透明质酸的分子量为800~1000kd。

35、优选的，所述缓释材料可选自乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙甲基纤维素和羟丙基纤维素中的任意一种或者任意两种以上的混合物。

36、优选的，所述缓释材料为羟丙甲基纤维素。

37、优选的，所述粘合剂可选自微晶纤维素和聚维酮。

38、优选的，所述粘合剂为聚维酮。

39、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

40、1、本发明选用子宫内膜间充质干细胞，制备得到的子宫内膜间充质干细胞浓缩液，相较于脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞制备得到的浓缩液，配伍重组ⅲ型人源化胶原蛋白制备而成的干细胞因子组合物可以更好地改善米非司酮诱导的子宫内膜基质细胞凋亡，更好地修复因病理性损伤导致的子宫内膜变薄。将干细胞因子组合物与透明质酸、缓释材料和粘合剂进一步制备为缓释剂型还能起到持续修复子宫内膜损伤的作用。

41、2、本发明的干细胞因子缓释剂以干细胞因子组合物为活性药效成分，干细胞因子组合物主要组成为子宫内膜间充质干细胞浓缩液和重组ⅲ型人源化胶原蛋白，两者协同起效，相辅相成，产生提高修复子宫内膜损伤疗效的显著的有益效果。其中子宫内膜间充质干细胞浓缩液的制备方法经大量试验、反复测试得出，制备方法中经含有黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的第二培养基的饥饿处理20~28小时的步骤，可以提高含有干细胞因子的浓缩液的治疗效果。制备方法中选用的细胞代数、第二培养基中黄素腺嘌呤二核苷添加量、fbs的添加量、细胞在第二培养基中的处理时间均是关键参数，该制备方法相较于现有技术产生了显著的进步。