一种负载黄芩苷的生物膜环糊精双包埋纳米载药系统的制备及应用的制作方法

本发明涉及纳米载药，特别涉及一种负载黄芩苷的生物膜环糊精双包埋纳米载药系统及其制备方法和应用。

背景技术：

1、黄芩苷(baicalin)是从唇形科植物黄芩(scutellaria baicalensis georgi)的干燥根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗过敏、美白等多种生物活性，因其来源自然、功效明显、副作用少、安全性高，被广泛应用于食品、药品及化妆品领域。但由于黄芩苷稳定性差、载药量低、水溶性和脂溶性较差、刺激性强、生物利用度低，限制了其应用。

2、纳米载药系统是一种利用纳米粒子搭载药物的特殊剂型，通过纳米载体的包裹，药物不仅能够增强治疗效果，降低不良反应，还可通过基团于纳米载体表面的修饰，成为智能响应型靶向药物体系。常见的纳米载药系统有脂质体包载体系、纳米乳包载体系、环糊精包载体系、聚合物包载体系、生物膜包载体系等。

3、运用纳米载药系统技术有望改善黄芩苷溶解度、稳定性以及生物利用度问题，现有技术比如清华大学深圳研究生院的cn106606785a提供了一种黄芩苷-羟丙基-β-环糊精包合物，采用超临界流体法结合有机酸制备黄芩苷-羟丙基-β-环糊精包合物，可将黄芩苷的溶解度增加84倍，减少了有机溶剂使用，将包合率、载药量从传统制备法的1.51％、0.33％显著提高至66.48％、4.27％。再如北京安德普泰医疗科技公司的cn111053744b提供了一种利用ph差促进脂质体主动包封黄芩苷，提高了黄芩苷脂质体的包封率、均匀性，具有良好的稳定性以及缓释作用。但是此类技术都侧重于对单一的纳米载药系统的性状进行优化或者选择合适的单一纳米载药系统，其制备得到的纳米载药系统无法兼容溶解度、稳定性以及生物利用度的特点。一般认为环糊精包载体系具有较高的稳定性和水溶性，但其生物利用度较低，而且大量的环糊精还会引起消化不良和肾毒性。脂质体包裹体系具有一定的生物相容性和缓释作用，但是其靶向性较低，稳定性不够高,易被生物组织分解。生物膜包载体系作为一种仿生药物载体具有更加优秀的性能，生物膜外层是磷脂双分子层构成的膜，内部是一个空腔可以负载大分子、小分子和核酸类物质，具有良好的生物传递性以及缓释作用，但是使用过程中依旧会发现生物膜与药物的相容性问题以及药物本身不稳定的问题，导致药物包载率不高，包载不均匀，稳定性较差。

4、因此亟需一种可同时解决黄芩苷稳定性差、载药量低、水溶性和脂溶性较差、刺激性强、生物利用度低等问题的纳米载药系统。

技术实现思路

1、本方案提供了一种负载黄芩苷的生物膜环糊精双包埋纳米载药系统及其制备方法和应用，有效解决现有的黄芩苷的稳定性差、载药量低、水溶性和脂溶性较差、刺激性强、生物利用度低等问题。

2、为实现以上目的，本方案提供了一种负载黄芩苷的生物膜环糊精双包埋纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)制备负载黄芩苷的纳米粒：取设定量的环糊精固体加入润滑剂后置于胶体磨中研磨设定时长，加入设定量的黄芩苷和超分子缔合剂混混合研磨得到黄芩苷-环糊精超分子，真空挥干润滑剂后利用去离子水溶解黄芩苷-环糊精超分子得到混合液，对混合液通过高压微射流均质机以一定均质压力进行多次均质得到均质溶液，对均质溶液冷冻干燥去除溶剂得到纳米粒；

4、(2)制备生物膜囊泡：从天然生物体中提取什生物膜进行分离纯化，得到生物膜囊泡；

5、(3)将生物膜囊泡用一定体积的pbs缓冲液进行稀释后与纳米粒按照一定比例混合，超声振荡一定时间后以氮气为压力源采用高压挤出法挤出，并离心收集底部沉淀即得负载黄芩苷的生物膜环糊精双包埋纳米载药系统。

6、作为优选，步骤(1)中所述环糊精选择为α-环糊精，β-环糊精或γ-环糊精的一种。在一些优选实施例中，所述环糊精选择为β-环糊精。优选的β-环糊精相较于α-环糊精和γ-环糊精，拥有大小适中的分子洞，包接范围广，能够被生物膜再次包裹。

7、作为优选，步骤(1)中所述超分子缔合剂由抗坏血酸、生育酚、羟基甲氧基苯基癸酮的一个或多个和peg-40、吐温-80、peg/ppg/聚丁二醇-8/5/3甘油、双丙甘醇的一个和多个组成。在一些优选实施例中，所述超分子缔合剂选择为羟基甲氧基苯基癸酮和双丙甘醇的组合。

8、作为优选，步骤(1)中所述环糊精、黄芩苷、超分子缔合剂和去离子水以质量比(5～10)：(0.5～1.5)：(0.1～0.2)：(40～50)的比例加入。

9、作为优选，步骤(1)中润滑剂采用无水乙醇，环糊精置于胶体磨中研磨10min，随后加入黄芩苷混合研磨20min。

10、作为优选，步骤(1)中高压微射流均质机以15-25mpa均质压力进行均质3次得到均质溶液。进一步优选，可选择为20mpa均质压力。

11、作为优选，步骤(2)中所述生物膜选择为红细胞膜、白细胞膜、血小板膜、肿瘤细胞膜或细胞质膜囊泡的一种。进一步优选，步骤(2)中所述生物膜优选细胞质膜囊泡。

12、在一些实施例中，步骤(2)中所述的“从天然生物体中提取生物膜”通过如下方法进行：将细菌接种在培养基上进行发酵培养后收集发酵液，对发酵液进行离心获取菌体沉淀后重悬得到含有菌体的溶液，对含有菌体的溶液采用高压微射流均质法进行破碎后得到碎片溶液中含有生物膜。

13、在一些实施例中，细菌选自冻干枯草芽孢杆菌粉、冻干乳酸杆菌粉、冻干双歧杆菌菌粉以及冻干嗜热链球菌菌粉的一种。

14、在一些实施例中，将含有菌体的溶液通过高压微射流均质机以25-35mpa均质压力进行均质破碎。优选的，将含有菌体的溶液通过高压微射流均质机以30mpa均质压力进行均质破碎。

15、作为优选，步骤(2)中所述的“分离纯化”优选尺寸排阻色谱法，具体操作为将碎片溶液通过装有琼脂糖或葡聚糖等凝胶基质的固体层析柱，用洗脱液进行洗脱，收集含有细胞质膜囊泡的馏分。

16、作为优选，步骤(3)中所述生物膜囊泡、pbs缓冲液、纳米粒也以质量比(0.7-1.0)：5：(0.06～0.08)的比例加入。

17、作为优选，步骤(3)中超声时间为20min，离心条件为4℃下15000g离心20min。

18、为了清楚理解该方案，下面对该方案中涉及到专业知识进行介绍：

19、黄芩苷是黄酮类化合物，结构为5,6,7-三羟基黄酮7-o-β-d-葡萄糖醛酸苷，其结构中含有黄酮母核、糖链、苯环、酚羟基等功能基团。

20、环糊精是一种环状低聚糖，其具有一种独特的环状结构，外层由氧原子组成，这些氧原子比碳原子更具电负性。因此，环糊精的外层具有亲水性，能够使其在水中分散均匀，保持体系的稳定，而内层则是由碳原子构成，具有疏水性。黄芩苷作为疏水性分子，受到环糊精的疏水效应的影响，会倾向于进入环糊精的内部以减少与水分子的接触。本专利中，利用胶体磨以及微射流高压均质机使环糊精与黄芩苷充分混合均匀，在水分子的持续作用下，使黄芩苷主动进入环糊精疏水内部。同时，环糊精具有空腔效应，对于小于其空腔直径的分子具有一定的选择性，黄芩苷作为一个小分子物质，尺寸适合于环糊精内腔，能够被环糊精包裹在内部，由于其结构中的糖链以及酚羟基，能够与环糊精的空腔形成氢键、范德华力、电荷间相互作用等各种相互作用力，增加包合物的稳定性。环糊精具有疏水性空腔，能够使空气中氧气等非极性分子不被吸附，这有利于保护黄芩苷中的邻苯二酚结构不被氧化，从而提高包合物的稳定性。但还会有少量极性气体(水蒸气和二氧化碳)会被吸附进入环糊精腔体缝隙，影响黄芩苷包合物稳定性。因此本专利通过调整确定了最佳的黄芩苷与环糊精的比例，使黄芩苷充分填充环糊精内腔，减少极性气体进入腔体，在提高载药量的同时增加包合物稳定性。

21、超分子通常是指由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用结合在一起，组成复杂的、有组织的聚集体，并保持一定的完整性使其具有明确的微观结构和宏观特性。本专利优选的使用双丙甘醇和羟基甲氧基苯基癸酮作为超分子缔合剂，使环糊精与超分子缔合剂形成更稳定的超分子结构，从而提高体系的稳定性。本专利所述的双丙甘醇具有油水两亲性，能够帮助羟基甲氧基苯基癸酮中亲脂性的脂环和甲氧基基团与环糊精外部亲水性的羟基通过氢键、范德华力等分子间作用力缔合。同时羟基甲氧基苯基癸酮结构中含有酚羟基，能够通过捕获自由基、转移氢原子等方式来中和自由基，保护黄芩苷以及体系的稳定性。虽然环糊精超分子具有很高的稳定性，但生物利用度不高，而且大量的环糊精还会引起消化不良和肾毒性，因此借助于生物膜同人体的生物相容性，提高黄芩苷被胃肠道、皮肤吸收的效率发挥药效，进而提高黄芩苷生物利用度、降低黄芩苷及环糊精的用量，起到降低毒副作用的效果。

22、生物膜是一种动态的结构，具有膜脂的流动性和膜蛋白质的运动性，其表面有蛋白质、糖类、核酸等生物体信号分子，能够模拟人体内源性物质功能以及生物过程。生物膜制备的囊泡具有特殊的结构，存在亲水微区和疏水微区，这使得囊泡具有同时运载水溶药物和水不溶药物的能力。采用生物膜囊泡包裹黄芩苷，能够具有缓释作用，降低黄芩苷对细胞的毒性，延长黄芩苷功效作用时间，提高黄芩苷的生物利用度。但单一生物膜包合黄芩苷的方式存在包载率不高，包载不均匀，稳定性较差的问题。

23、值得注意的是，传统生物膜提取方法(超声破碎法、酸碱法、酶法)存在效率低、成本高、破碎不均匀、生物膜完整性被破坏等问题，而本发明中采用的高压微射流均质法利用高压力将菌体溶液通过特殊结构孔道进行挤压、剪切和撞击，能够解决上述问题，获得更稳定、均一的生物膜组件，具有操作简单、提取率高、可重复性好等优点。且生物膜提取过程中往往含有其他杂质囊泡或干扰蛋白存在，这些杂质会影响到生物膜本身的包裹能力，因此对生物膜生产和测试必须保证高质量的标准，这就需要对生物膜进行分离纯化。传统的分离纯化方法是差速离心法，利用不同物质密度、大小、形状不同，通过变化离心力以分离需求物质，这种方法对仪器要求十分严格，耗时较久，有破坏囊泡完整性的风险，强大的离心力可能会导致干扰蛋白与生物膜发生融合。而本方案采用的尺寸排阻色谱法是基于不同粒径的颗粒通过洗脱液流过多孔聚合物构成固定相的洗脱速度不同而精细地分离出不同粒径的物质。细胞质膜囊泡是一种粒径小的天然囊泡物质，当细胞质膜囊泡通过固体层析柱时，会比其他小分子物质(如蛋白质)先洗脱下来，利用这一特点便可以对细胞质膜囊泡进行分离纯化。尺寸排阻色谱法具有更快的纯化速度，更低的设备成本要求，分离的样品纯度更高，能够保留囊泡结构的完整性，还具有一定的富集作用。

24、相较现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：

25、采用独创的双包埋纳米载药系统以提高负载的黄芩苷的稳定性、生物利用度以及生物安全性，可通过双包埋纳米载药系统起到缓释作用以降低其刺激性，进而提高了黄芩苷在化妆品中的功效作用。具体的，本方案通过超分子缔合剂缔合环糊精超分子以提高超分子体系的稳定性，采用环糊精超分子包合黄芩苷得到纳米粒，以提高黄芩苷在体系内的稳定性、溶解性、载药量；随后以天然提取的生物膜包合纳米粒得到负载黄芩苷的生物膜环糊精双包埋纳米载药系统，借助生物膜的具有良好的生物相容性、安全性、缓释性提高了整个体系的性能，从而解决了现有黄芩苷存在稳定性差、载药量低、水溶性和脂溶性较差、刺激性强、生物利用度低的问题。另外，本方案提供的负载黄芩苷的生物膜环糊精双包埋纳米载药系统的制备方法采用高压微射流均质法进行均质，通过旋蒸和冻干制备的环糊精纳米粒为固态形式，具有更高的储存稳定性和载药量。