一种生物酶解果实提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及烟用香料，尤其涉及一种生物酶解果实提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、烟用香料作为卷烟配方的核心组成部分，对丰富卷烟香气、提高抽吸品质起着重要的作用。新鲜水果水分充足，香气浓郁，含糖量高，是优质的烟用天然香料，利用水果制备天然香料，能够赋予卷烟独特而自然的香韵，起到柔和烟气，改善吃味等作用。

2、将水果用溶剂提取可得提取物，在卷烟中添加果实提取物可以提升卷烟香气质与香气量，改善口感舒适性，但通常会给口腔带来一些负面影响，据推测可能与其含纤维素、半纤维素、果胶质、蛋白质等大分子物质有关。

3、现有技术中通常会通过酶解的方式将这些纤维素、果胶等转化为与烟草特征香成分密切相关的小分子物质，比如公开号为cn113755244a的专利文件公开的这样一种烟用红枣香精制备方法，包括：高粱尾酒提取物、红枣预处理、酶解工艺、热回流提取工艺、絮凝工艺、减压分段分离和烟用红枣香精制备等步骤。酶解工艺是采用添加复合酶，复合酶为果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶， 在40℃~60℃条件下酶解2~6小时。其通过复合酶酶解作用破坏细胞壁，提高有效成分溶出率，同时促进淀粉、蛋白等物质转化，提高产物还原糖等含量，解决了目前红枣香精制备存在的产品中会有部分蛋白质、果胶、淀粉、多糖大分子等物质残留问题。

4、现有技术中，大多注重于将纤维素、半纤维素、果胶等尽可能地降解为小分子还原糖，以降低卷烟抽吸时的刺激性和杂气，但还原糖分子量小，结合水的能力有限，因而保润能力不足，其作为香料应用到卷烟上后，一方面不利于卷烟的长期存储，另一方面使得卷烟抽吸时还存在烟气干燥、甜润感不足的问题。

技术实现思路

1、本发明要解决上述问题，提供一种生物酶解果实提取物及其制备方法和应用。

2、本发明解决问题的技术方案是，首先提供一种生物酶解制备果实提取物的方法，包括以下步骤：

3、s1.用浓度为1~100mg/l的乙烯利溶液对果实进行浸泡处理，浸泡完毕后取出干燥；然后采用多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶对果实进行酶解处理，得到一次酶解液；

4、s2.对一次酶解液进行固液分离，得到固相物和液相物；用浓度为450~550mg/l的乙烯利溶液对固相物进行浸泡处理，浸泡完毕后取出干燥，并重新加入至液相物中；再向液相物中加入木聚糖酶进行酶解处理，得到二次酶解液；

5、s3.采用溶剂对二次酶解液进行提取处理，得到果实提取物。

6、果实细胞壁主要由果胶质、纤维素和半纤维素等多糖类和少量蛋白质组成，细胞壁组分的降解主要是通过细胞壁酶对相应细胞壁多糖的降解来实现。果胶甲酯酶（pme）和多聚半乳糖醛酸酶（pg）是降解果胶多糖的主要酶，纤维素酶（cs）是降解纤维素的多糖的主要酶，木聚糖酶（xyl）是重要的半纤维素多糖降解酶。

7、有研究表明，乙烯能够促进各种细胞壁酶的活性，加促细胞壁的降解。发明人在此基础上通过实验发现，低浓度范围（不超过100mg/l）内，乙烯可以对果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶的活性起促进作用，超出浓度范围会出现反向抑制问题；同时在上述范围内，随着乙烯浓度升高，果胶甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性增强，但纤维素酶的活性却表现为先增加后降低的趋势。而相对高浓度（500mg/l左右）的乙烯对木聚糖酶的活性起促进作用，过低过高均会出现反向抑制问题。另外，只有多聚半乳糖醛酸酶活性增大才促进细胞壁组分向分子量小于3500的小分子组分转化、增加可溶性糖含量；而果胶甲酯酶是作用于果胶分子的甲氧基、产物为多聚半乳糖醛酸酶提供底物，对果胶加溶没有直接作用；纤维素酶和木聚糖酶即使活性增大，但酶解产物仍然以分子量大于3500的大分子为主。

8、本发明利用这一特性对果实进行乙烯辅助酶解处理，通过控制乙烯的浓度，较少地促进多聚半乳糖醛酸酶活性，较大地促进纤维素酶和木聚糖酶的活性，以主要获得分子量在3500以上的小分子多糖。本技术的酶解产物相比于果胶质、纤维素和半纤维素等酶解底物，分子量要小得多，能够有效减少抽吸刺激性和杂气；相比于寡糖和单糖，分子量又稍大，因而具备更高的粘度、成膜性、吸水溶胀性，在保润、稳定方面更为优异。将这种酶解产物用作卷烟香料，不仅丰富卷烟抽吸香气质与香气量、减少刺激性和杂气，还改善了卷烟的保润能力，并提升抽吸甜润感。

9、其中，步骤s1中采用浓度为1~100mg/l的乙烯利溶液，由于对于多聚半乳糖醛酸酶而言，乙烯利浓度越高活性越大；对于纤维素酶而言，乙烯利浓度越高活性先增加后减少；因此优选采用使得纤维素酶活性呈峰值的乙烯利浓度，扩大多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的活性差距，因此作为本发明的优选，采用浓度为20~30mg/l的乙烯利溶液，比如可以是20mg/l、22.5mg/l、25mg/l、27.5mg/l、30mg/l，优选为25mg/l，此时两种酶的活性差距达到最大。

10、步骤s2中采用浓度为450~550mg/l，比如可以是450 mg/l、480 mg/l、500 mg/l、520 mg/l、550 mg/l，优选为 550 mg/l。

11、乙烯的促进抑制作用还与温度有关，在10~50℃温度范围内，纤维素酶的活性随温度上升先减小后增加，多聚半乳糖醛酸酶的活性随温度上升而先上升后减少再上升，浸泡温度和酶解温度优选控制在纤维素酶活性大、多聚半乳糖醛酸酶活性小的温度范围内，同时考虑到酶解过程中，为了保证酶解效率，酶解温度不宜过低，因此作为本发明的优选，浸泡温度为10~30℃，比如可以是10℃、15℃、20℃、25℃、30℃，优选为10℃。酶解温度为40~50℃，比如可以是40℃、42℃、45℃、48℃、50℃，优选为45℃。

12、在10~60℃范围内，木聚糖酶的活性随温度上升而上升，作为本发明的优选，步骤s2中，浸泡温度为50~60℃，比如可以是50℃、52℃、55℃、58℃、60℃，优选为60℃。同时为了保证酶解效率，作为本发明的优选，步骤s2中，酶解温度为45~55℃，比如可以是45℃、48℃、50℃、52℃、55℃，优选为50℃。

13、步骤s1、s2中，酶的用量和酶解时间还需得到限制，酶的用量过多、酶解时间过长会导致酶解过度；酶的用量过少、酶解时间过短会导致酶解不足，因此，作为本发明的优选，步骤s1中，多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的总质量浓度为0.5%~1.5%，比如可以是0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%，优选为1.0%。其中，多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的质量比为2：（0.8~1.2），比如可以是2:0.8、2:0.9、2:1、2:1.1、2:1.2，优选为2:1。

14、作为本发明的优选，步骤s2中，木聚糖酶的质量浓度为0.01%~0.03%，比如可以是0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%，优选为0.02%。

15、作为本发明的优选，步骤s1和s2中，酶解时间分别独立为30~90min，比如可以独立为30min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，优选为60min。

16、酶解主要是将果实细胞壁降解，酶解完成后，通过提取可以快速有效提取果实细胞中包含挥发性香气物质在内的有效成分。提取所用溶剂不受限制，可以采用水、低浓度乙醇、乙酸乙酯中的一种或多种。

17、通常现有技术中，会将加入的酶灭活后再进行提取，本技术中，通过加酸、高温的方式，在降低酶活力的同时提高提取效率。一般来说，果胶酶的最适ph在2.5~6.0，纤维素酶的最适ph在4.5~6.5，木聚糖酶的最适ph在3.5~6.5，因此，作为本发明的优选，步骤s3中，调节二次酶解液的ph至1.0~3.0后，于50~80℃下提取。其中ph可以是1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，优选为2.0。提取温度可以是50℃、60℃、70℃、80℃，优选为80℃。作为本发明的优选，采用盐酸调节ph。

18、在一些实施方式中，为了进一步提高提取效果，作为本发明的优选，采用超声辅助法进行提取，超声功率100~300w，比如可以是100w、150 w、200 w、250 w、300 w，优选为200w；超声时间20~60min，比如可以是20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，优选为40min。

19、在一些实施方式中，为了提高纯度以及便于保存，作为本发明的优选，提取后在6000~10000r/min下离心15~25min，并取上清液经滤膜过滤，过滤纳米滤膜孔径为800d~1000d。其中转速可以是6000r/min、7000 r/min、8000 r/min、9000 r/min、10000 r/min，优选为8000 r/min；离心时间可以是15min、18min、20min、22min、25min，优选为20min；滤膜孔径可以是800d、900d、1000d，优选为1000d。

20、本技术还有一个目的是提供一种利用上述方法制得的生物酶解果实提取物，这种提取物中富含分子量在3500~8000的小分子多糖和果实挥发性香气成分，具有良好的香气和保润性。

21、本技术还有一个目的是提供一种生物酶解果实提取物在卷烟中的应用，将这种提取物添加到卷烟烟丝中，使得卷烟烟丝在加热抽吸时、能为使用者提供香气量丰富、低刺激性、甜润的烟气口感。

22、作为本发明的优选，提取物与卷烟烟丝的质量比为0.01%~0.1%，比如可以是0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%，优选为0.05%。

23、本发明的有益效果：

24、本技术提供了一种生物酶解果实提取物及其制备方法和应用，通过控制乙烯的浓度，较少地促进多聚半乳糖醛酸酶活性，较大地促进纤维素酶和木聚糖酶的活性，以主要获得分子量在3500以上的小分子多糖。将这种酶解产物用作卷烟香料，不仅丰富卷烟抽吸香气质与香气量、减少刺激性和杂气，还改善了卷烟的保润能力，并提升抽吸甜润感。