一种治疗犬黑色素瘤的环状RNA疫苗的制作方法

本发明涉及治疗犬黑色素瘤疫苗，具体涉及一种治疗犬黑色素瘤的环状rna疫苗。

背景技术：

1、犬黑色素瘤常见于口腔、皮肤、眼部和足趾部位，是犬常发肿瘤之一，也是老龄犬死亡的主要原因。目前犬肿瘤的临床治疗手段主要包括手术、化学治疗和放射性治疗。常见的化疗药物包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙等，这些均存在肿瘤特异性差和毒副作用大等缺点。

2、肿瘤疫苗是指通过将肿瘤组织中肿瘤相关抗原经过药学上可以接受载体形式注射于肿瘤患者体内，激活机体免疫系统杀灭肿瘤细胞的特异性免疫反应，以达到控制和治疗肿瘤的目的。

3、酪氨酸酶是黑色素形成过程中的主要催化酶。酪氨酸酶表达于复合性黑色素痣，而在真皮深部表达降低，同时高表达于恶性黑色素瘤中。因此，酪氨酸酶常被用于黑色素瘤的标志物和特异性抗原。由于酪氨酸酶为机体自身蛋白，在进行免疫接种时容易产生免疫抑制和耐受，不能达到治疗黑色素瘤的目的。国外有公司采用异种抗原进行免疫接种来突破机体的免疫抑制，例如，梅里亚公司推出的oncept疫苗，是将人酪氨酸酶抗原通过质粒dna形式形成来dna疫苗来治疗犬黑色素瘤。该疫苗在后续回顾性研究显示，其治疗效果有限。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种治疗犬黑色素瘤的环状rna疫苗，及其制备方法和应用。通过脂质体递送表达优化的犬酪氨酸酶的环状rna到细胞内，在体内高效表达优化的犬酪氨酸酶，刺激机体产生免疫反应，达到治疗的效果。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、本发明提供了一种治疗犬黑色素瘤的环状rna疫苗，所述环状rna疫苗中包含编码优化的犬酪氨酸酶的环状rna分子，所述优化的犬酪氨酸酶包括犬酪氨酸酶或其同源序列，连接臂，和增强序列或其同源序列。

4、所述犬酪氨酸酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

5、所述犬酪氨酸酶的核苷酸序列如seq id no:2所示。

6、所述同源序列为具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。

7、作为本发明的一个实施方案，所述连接臂是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自gly、ser、ala和thr中的至少一种。更优选地，所述连接子为(gly-gly-gly-gly-ser)n，其中n为2-5之间的整数(比如可以为2、3、4或5)。

8、优选的连接臂氨基酸序列如下：ggggsggggsggggs(seq id no:3)。

9、优选的连接臂核苷酸序列如下：

10、ggcggcgggggcagcggcggcgggggatctggcggaggaggcagc(seq id no:4)。

11、作为本发明的一个实施方案，所述增强序列选自氨基酸序列如seq id no:5、seqid no:7、seq id no:9或seq id no:11所示的增强序列。

12、氨基酸序列如seq id no:5所示的增强序列记为增强序列cona；增强序列cona的核苷酸序列如seq id no:6所示。

13、氨基酸序列如seq id no:7所示的增强序列记为增强序列t113g；增强序列t113g的核苷酸序列如seq id no:8所示。

14、氨基酸序列如seq id no:9所示的增强序列记为增强序列k115t；增强序列k115t的核苷酸序列如seq id no:10所示。

15、氨基酸序列如seq id no:11所示的增强序列记为增强序列l87t；增强序列l87t的核苷酸序列如seq id no:12所示。

16、作为本发明的一个实施方案，所述环状rna包含如下(a)～(d)中任一项所示排列次序的元件：

17、(a)第一外显子、第二外显子、5’间隔区、翻译起始元件、编码元件和3’间隔区；

18、(b)第一外显子、第二外显子、翻译起始元件和编码元件；

19、(c)翻译起始元件和编码元件；

20、(d)翻译起始元件、编码元件和插入元件；

21、所述编码元件编码所述优化的犬酪氨酸酶。

22、作为本发明的一个实施方案，所述翻译起始元件包含如下所示的一种或两种以上的具有翻译起始活性的序列：ires序列、5’utr序列、kozak序列、包含m6a修饰的序列、核糖体18s rrna的互补序列。

23、作为本发明的一个实施方案，所述插入元件包含如下所示的一种或两种以上的序列：非翻译区序列、polyn序列、适配体序列、核糖体开关序列、结合转录调控因子的序列；其中，所述polyn序列，其中n选自a、t、g、c中的至少一种。

24、作为本发明的一个实施方案，所述环状rna分子是由重组核酸分子转录获得线性rna，进一步环化形成，所述重组核酸分子的编码区具有如seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22或seq id no:24所示的核苷酸序列。

25、所述重组核酸分子沿5’端到3’端依次包含内含子片段ii、翻译起始原件截断片段ii、编码区、polyac元件、翻译起始原件截断片段i和内含子片段i；所述编码区具有如seqid no:18、seq id no:20、seq id no:22或seq id no:24所示的核苷酸序列。

26、在一些实施例中，所述环状rna分子的制备方法包括如下步骤：

27、s1、按沿5’端到3’端依次包含内含子片段ii、翻译起始原件截断片段ii、编码区、polyac元件、翻译起始原件截断片段i和内含子片段合成基因片段并克隆至puc57载体，得到dna载体；

28、s2、所述dna载体分别转化dh5α感受态细胞，得到工程菌；所述工程菌经质粒抽提，测序验证序列正确；

29、s3、验证序列正确的工程菌质粒经酶切与纯化，获得线性化质粒；

30、s4、所述线性化质粒进行转录获得线性rna；

31、s5、环化，获得环状rna。

32、步骤s4中，转录产物中加入licl溶液沉淀，离心获得线性rna沉淀，经无酶水重悬沉淀，获得线性rna水溶液；所述线性rna水溶液经环化、浓缩、hplc纯化、超滤浓缩，获得环状rna分子。

33、作为本发明的一个实施方案，所述疫苗还包括可电离阳离子脂质载体。通过将上述环状rna包载进入脂质载体中，可以提高机体对环状rna的摄取效率，同时提高了环状rna的储存稳定性。

34、作为本发明的一个实施方案，所述可电离阳离子脂质载体为脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒的原料组成按摩尔百分比计包括：阳离子脂质45％-55％、胆固醇35％-44％、中性脂质3％-10％和peg修饰脂质0.8％-1.8％；所述阳离子脂质为cmax4；所述胆固醇为5-胆甾烯-3β-醇；所述中性脂质为dspc或者dope；所述peg修饰脂质为peg-dmg、peg-dsg或者peg-dpg。

35、作为本发明的一个实施方案，所述犬黑色素瘤的环状rna疫苗还包括冷冻保护剂。所述冷冻保护剂组成包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种。

36、所述环状rna疫苗中，所述冷冻保护剂含量为5％-20％(w/v)。

37、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

38、1)目前尚未有报道犬黑色素瘤mrna抗原报道，本发明通过优化增强犬酪氨酸酶的免疫原性，刺激免疫系统识别犬酪氨酸酶，同时使用环状rna技术和lnp递送技术制备得到犬酪氨酸酶环状rna疫苗，在体内高表达优化的犬酪氨酸酶，从而激活免疫系统对犬黑色素瘤产生治疗作用。

39、2)与已公开的dna疫苗人酪氨酸酶抗原相比，以本发明抗原制备的犬黑色素瘤疫苗，与犬黑色素瘤内源性表达的酪氨酸酶具有更相近的抗原表位和t细胞表位，更容易在体内激活特异性t细胞，产生更好的治疗效果，为患病犬提高更长的生存期。

40、3)本发明的环状rna疫苗具有较低的免疫剂量，对患病犬安全，无副作用。