ecDNA扩增抑制药物及ecDNA标志物应用

本发明属生物，具体涉及一种ecdna扩增抑制药物，还涉及一种ecdna标志物应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤是人类健康和生活质量的主要威胁之一。在恶性肿瘤中，结直肠癌(colorectal cancer,crc)是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年递增，且患者具有很高的复发性和耐药性。尽管现代针对结直肠癌的诊疗技术已经取得了较大的进展，但结直肠癌的综合治疗仍然面临着巨大挑战，尤其是结直肠癌中的异质性会造成患者在临床上的复发及耐药性。而结直肠癌的高度异质性的原因之一是染色体不稳定性。针对染色体不稳定性进行的结直肠癌治疗及药物开发具有广阔的应用前景。同时，在结直肠癌发生发展过程中进行早期筛查和实时监测对延长患者的总生存期起着关键作用。

2、肿瘤细胞中的染色体不稳定性由染色体断裂、同源重组及非同源末端重组等异常事件所导致。研究表明，染色体不稳定导致肿瘤高度异质性及耐药性的过程中，其诱导致癌基因的扩增是主要原因，而染色体外环状dna(extrachromosomal circular dna,ecdna)是造成染色体不稳定及致癌基因拷贝数扩增的主要方式。ecdna在1965年通过显微成像技术发现，被描述为在细胞核中的“双微染色质体(double minute chromatin body)”。近年来的研究发现，ecdna普遍存在于肿瘤细胞中，自身携带原癌基因，通常可有高达几十甚至几百个拷贝，产生大量的致癌基因转录产物，并构成了原癌基因扩增的真正机制及适应性储库，为响应于肿瘤微环境中的选择性压力及细胞毒性治疗试剂提供了竞争优势。由于ecdna在肿瘤中的不均等分配模式及其快速波动，从而可推动肿瘤的进化，与肿瘤的发生、发展密切相关。

3、现有针对ecdna的研究主要集中于ecdna对肿瘤的促进、异质性及耐药机制方面。而对于如何消除或者减少肿瘤细胞中ecdna方面的研究尚未有具体明确的方法或试剂。因此在临床应用中，寻找针对ecdna高敏感性和高特异性的生物标志物以及肿瘤免疫治疗新靶点，对肿瘤治疗具有重要临床价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种ecdna扩增抑制药物，解决现有技术中针对ecdna缺乏消除或减少其数量的药物的不足。

2、一种ecdna扩增抑制药物，包括以下活性成分：shrna；所述shrna是对lig3、top2b和mdc1中一种或多种表达具有抑制作用的shrna。

3、本发明中，所述shrna包括shtop2b、shlig3和shmdc1中的一种或多种；

4、所述shlig3的上游序列如seq id no.3所示，下游序列如seq id no.4所示；

5、所述shtop2b的上游序列如seq id no.5所示，下游序列如seq id no.6所示；

6、所述shmdc1的上游序列如seq id no.7所示，下游序列如seq id no.8所示。

7、进一步地，所述shlig3的靶向蛋白为lig3；所述shtop2b的靶向蛋白为top2b；所述shmdc1的靶向蛋白为mdc1。

8、本发明中，还包括ddr信号通路抑制剂，所述ddr信号通路抑制剂包括atm抑制剂或chk2抑制剂。

9、进一步地，所述atm抑制剂是ku55933；所述chk2抑制剂是azd7762。

10、本发明中，所述ecdna扩增抑制药物还包括用于负载所述活性成分的载体，所述载体包括质粒、慢病毒、细胞株、脂质体和类脂囊泡中的一种。

11、进一步地，所述质粒为plko.1-puro质粒。

12、本发明一些实施方案中，所述细胞株为结直肠癌细胞株。

13、本发明一些实施方案中，所述ecdna扩增抑制药物通过shrna负载于结直肠癌细胞株得到沉默靶基因的结直肠癌细胞株。

14、进一步地，所述沉默靶基因的结肠癌细胞株通过以下步骤制得：

15、s1、将重组shrna干扰载体与包装质粒共转染至hek293t细胞中，使用完全培养基进行培养并收集上清液；

16、s2、将收集到得上清液离心，弃上清液，重悬得到慢病毒颗粒，转染至colo320dm结直肠癌细胞株中，进行培养筛选，然后进行扩增培养，得到沉默靶基因的结直肠癌细胞株。

17、本发明中，所述重组shrna干扰载体通过以下方式获得：合成shrna的引物单链，并在5’端携带酶切位点序列，然后退火配对产生双链；对plko.1-puro载体质粒用agel和ecori进行双酶切；将所述退火双链片段与经过双酶切后的载体质粒进行连接，得到重组shrna干扰载体。

18、进一步地，所述包装质粒为pspax2和pmd2.g混合物。

19、本发明中，所述培养筛选的培养基中加入嘌呤霉素。

20、一种ecdna标志物在制备抗肿瘤药物或制备ecdna诊断试剂产品中的应用，所述ecdna标志物为lig3、top2b和mdc1中一种或多种。

21、本发明中，所述ecdna标志物还包括磷酸化的组蛋白2a变体。

22、进一步地，所述磷酸化的组蛋白2a变体为γh2ax。

23、本发明中，所述肿瘤为肿瘤细胞中含有ecdna的肿瘤。

24、进一步地，所述肿瘤包括结直肠癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、胃癌和前列腺癌。

25、本发明中，所述ecdna有致癌基因，所述致癌基因为myc致癌基因。

26、本发明中，所述ecdna诊断试剂产品为检测试剂盒。

27、本发明具有以下有益效果：

28、(1)本发明ecdna扩增抑制药物通过抑制lig3、top2b和mdc1表达的shrna来实现肿瘤细胞内ecdna数量减少，以及ecdna上致癌基因拷贝数的降低，具有高敏感性。

29、(2)本发明ecdna扩增抑制药物中shlig3,shtop2b和shmdc1载体可在colo320 dm结直肠癌细胞系中稳定表达，并且能够稳定敲低细胞系中对应的靶向蛋白lig3,top2b和mdc1的表达，lig3,top2b或mdc1的敲低会明显是细胞系中的ecdna转变为hsr，并且也会导致ecdna细胞内的ddr水平降低。表明lig3,top2b或mdc1与细胞系中ecdna的扩增/复制相关，同时ecdna的扩增/复制与细胞内ddr信号通路相互藕联。因此，可将shlig3,shtop2b或shmdc1用于制备肿瘤细胞异质性或耐药性的抑制剂。

技术特征：

1.一种ecdna扩增抑制药物，其特征在于，包括以下活性成分：shrna,所述shrna是对lig3、top2b和mdc1中一种或多种表达具有抑制作用的shrna。

2.根据权利要求1所述ecdna扩增抑制药物，其特征在于，所述shrna包括shtop2b、shlig3和shmdc1中的一种或多种；

3.根据权利要求1所述ecdna扩增抑制药物，其特征在于，还包括ddr信号通路抑制剂，所述ddr信号通路抑制剂包括atm抑制剂或chk2抑制剂。

4.根据权利要求3所述ecdna扩增抑制药物，其特征在于，所述atm抑制剂是ku55933；所述chk2抑制剂是azd7762。

5.根据权利要求1-4任一项所述ecdna扩增抑制药物，其特征在于，还包括用于负载所述活性成分的载体，所述载体包括质粒、慢病毒、细胞株、脂质体和类脂囊泡中的一种。

6.根据权利要求1所述ecdna扩增抑制药物，其特征在于，所述ecdna扩增抑制药物通过shrna负载于结直肠癌细胞株得到沉默靶基因的结直肠癌细胞株；所述沉默靶基因的结肠癌细胞株通过以下步骤制得：

7.一种ecdna标志物在制备抗肿瘤药物或制备ecdna诊断试剂产品中的应用，其特征在于，所述ecdna标志物为lig3、top2b和mdc1中一种或多种。

8.根据权利要求7所述ecdna标志物在制备抗肿瘤药物或制备ecdna诊断试剂产品中的应用，其特征在于，所述ecdna标志物还包括磷酸化的组蛋白2a变体，所述磷酸化的组蛋白2a变体为γh2ax。

9.根据权利要求7所述ecdna标志物在制备抗肿瘤药物或制备ecdna诊断试剂产品中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、胃癌和前列腺癌。

10.根据权利要求7所述ecdna标志物在制备抗肿瘤药物或制备ecdna诊断试剂产品中的应用，其特征在于，所述ecdna诊断试剂产品为检测试剂盒。

技术总结本发明公开了一种ecDNA扩增抑制药物，包括以下活性成分：shRNA，所述shRNA是对LIG3、TOP2B和MDC1中一种或多种表达具有抑制作用的shRNA。还包括DDR信号通路抑制剂，所述DDR信号通路抑制剂是对参与ecDNA扩增的途径进行抑制。本发明ecDNA扩增抑制药物通过抑制LIG3、TOP2B和MDC1表达的shRNA来实现肿瘤细胞内ecDNA数量减少，从而使ecDNA上致癌基因拷贝数的降低，具有高敏感性。技术研发人员：甘海云,康星,李欣然受保护的技术使用者：中国科学院深圳先进技术研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/11