基于外泌体ecDNA的肺癌标志物及诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医学诊断，具体涉及基于外泌体ecdna的肺癌标志物及诊断试剂盒。

背景技术：

1、肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌早期病情隐匿，通常无任何症状，但大部分患者在初诊时已处于中晚期，失去了手术切除的机会。晚期肺癌患者的五年生存率不足5％，而早期肺癌患者的五年生存率可达90％以上。因此，早期诊断是肺癌患者获得良好预后的一个重要机会。

2、外泌体(exosome)是一种30-150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成。几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标志物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态。

3、ecdna是近期肿瘤学领域的研究热点，ecdna指的是从染色体上脱落以环状结构存在的dna。研究表明ecdna普遍存在于肿瘤细胞中，是原癌基因的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并与肿瘤的发生、发展密切相关。

4、目前肺癌的早期诊断主要是根据早期临床症状、影像学、支气管镜活检以及痰液脱落细胞学等各方面配合进行诊断。

5、影像学：肺癌在早期通常以肺结节的形式出现。利用影像学技术可以检测出肺结节发生。影像学是利用x射线的透射性与摄影效应使人体内部结构和器官形成影像。人体组织结构是由不同元素所组成，依各种组织单位体积内各元素量总和的大小而有不同的密度。基于人体组织有密度和厚度的差别，密度高对x线吸收多，照片上呈白影；密度低x线吸收少，照片上呈黑影。从而通过成像了解人体解剖与生理功能状况以及病理变化，以达到诊断的目的。该诊断方式的缺点是：1)受制于深浅组织的影像相互重叠和隐藏，有时需要多次多角度拍摄x光片才能看清；2)x射线能穿透人体组织，使人体体液和组织细胞产生生理和生物化学改变，引起不同程度的损伤；3)误漏诊率高、特异性差。

6、支气管镜活检：支气管镜检查是将细长的支气管镜经口或鼻置入患者的下呼吸道，即经过声门进入气管和支气管以及更远端，直接观察气管和支气管的病变，并根据病变进行相应的检查和治疗。大多数肺部及气道疾病，如肿瘤、间质性肺病、肉芽肿性疾病以及某些感染性疾病需要通过经支气管镜活检术来确定诊断，这是最常用的一项检查项目。该诊断方式的缺点是：1)支气管镜活检系“盲穿”精准率偏低；2)有穿刺到血管的危险。

7、痰液脱落细胞学检测：咳嗽会产生强大的气流，会使肿瘤细胞更容易脱落和痰液一起被咳出，肺部脱落细胞学检查是肺癌早期诊断的重要方法之一。痰液细胞学检查就是将怀疑肺癌患者排出的痰液进行涂片，然后在显微镜下观察，根据涂片中细胞形态特点，检查癌前病变，恶性肿瘤细胞或癌细胞，做出初步的细胞类型诊断。该诊断方式的缺点是：1)样本采集要求高；2)仅是一种初步的定性诊断；3)由于诊断细胞学主要是观察细胞形态变化而看不到组织结构的改变，因此存在一定的局限性；4)易出现假阴性或假阳性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，基于外泌体ecdna的肺癌标志物提供一种无伤害、高准确率、高特异性的肺癌早期诊断产品，克服现有诊断技术存在的缺陷。

2、本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

3、基于外泌体ecdna的标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用，所述标志物为pik3c2b、pdzrn3、trim65、znf626、rbbp5、dgkz、palb2、gabra2基因中的一种或它们的任何组合。

4、作为优选实施方案，检测所述标志物的引物选自以下一组或多组，

5、检测pik3c2b基因的引物组为seq id no:1所示的上游引物和seq idno:2所示的下游引物；

6、检测pdzrn3基因的引物组为seq id no:3所示的上游引物和seq idno:4所示的下游引物；

7、检测trim65基因的引物组为seq id no:5所示的上游引物和seq idno:6所示的下游引物；

8、检测znf626基因的引物组为seq id no:7所示的上游引物和seq idno:8所示的下游引物；

9、检测rbbp5基因的引物组为seq id no:9所示的上游引物和seq idno:10所示的下游引物；

10、检测dgkz基因的引物组为seq id no:11所示的上游引物和seq idno:12所示的下游引物；

11、检测palb2基因的引物组为seq id no:13所示的上游引物和seq idno:14所示的下游引物；

12、检测gabra2基因的引物组为seq id no:15所示的上游引物和seq idno:16所示的下游引物。

13、本发明还提供一种肺癌早期诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：检测所述标志物在外泌体ecdna中表达水平的试剂。

14、作为优选实施方案，所述的肺癌早期诊断试剂盒检测所述标志物表达水平的方法，包括以下步骤：

15、(1)外泌体总dna的提取与纯化；

16、(2)外泌体线性dna的去除和ecdna滚环扩增；

17、(3)使用检测所述标志物的引物进行pcr扩增；

18、(4)pcr扩增产物纯化、建库测序；

19、(5)统计标志物基因的reads数，确定基因表达水平。

20、作为优选实施方案，在步骤(1)之前还包括：血浆样本的处理和外泌体的纯化。

21、作为优选实施方案，所述步骤(2)中采用核酸外切酶去除线性dna。

22、作为优选实施方案，所述步骤(2)中使用idt的随机引物、滚环扩增酶进行滚环扩增。

23、作为优选实施方案，所述步骤(3)中每条引物在pcr扩增体系中的浓度为10-200μm。

24、所述肺癌早期诊断试剂盒通过检测标志物判断阳性样本的方法为：pik3c2b基因上调，和/或pdzrn3、trim65、znf626、rbbp5、dgkz、palb2、gabra2其中至少一种基因下调的样本为阳性。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

26、1，本发明通过ngs测序分析筛选出特异的与肺癌发生相关的来自ecdna的标志物基因，使用高通量的ngs分析检测这些标志物基因来评判预测肺癌的发生。本发明提供的特异性标志物，使肺癌早期诊断的检测结果更加精确和特异。

27、2，针对筛选出的8种ecdna生物标志物设计了独特的捕获引物组合，并联合滚环扩增，增加了靶标片段的文库量，同时降低测序背景值。

技术特征：

1.基于外泌体ecdna的标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：所述标志物为pik3c2b、pdzrn3、trim65、znf626、rbbp5、dgkz、palb2、gabra2基因中的一种或它们的任何组合。

2.根据权利要求1所述的标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：检测所述标志物的引物选自以下一组或多组，

3.一种肺癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括：检测权利要求1所述标志物在外泌体ecdna中表达水平的试剂。

4.权利要求3所述的肺癌早期诊断试剂盒检测所述标志物表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的肺癌早期诊断试剂盒检测所述标志物表达水平的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括：血浆样本的处理和外泌体的纯化。

6.根据权利要求4所述的肺癌早期诊断试剂盒检测所述标志物表达水平的方法，其特征在于：所述步骤(2)中采用核酸外切酶去除线性dna。

7.根据权利要求4所述的肺癌早期诊断试剂盒检测所述标志物表达水平的方法，其特征在于：所述步骤(2)中使用idt的随机引物、滚环扩增酶进行滚环扩增。

8.根据权利要求4所述的肺癌早期诊断试剂盒检测所述标志物表达水平的方法，其特征在于：所述步骤(3)中每条引物在pcr扩增体系中的浓度为10-200μm。

9.根据权利要求4所述的肺癌早期诊断试剂盒检测所述标志物表达水平的方法，其特征在于：pik3c2b基因上调，和/或pdzrn3、trim65、znf626、rbbp5、dgkz、palb2、gabra2其中至少一种基因下调的样本为阳性。

技术总结本发明公开了一种基于外泌体ecDNA的肺癌标志物及诊断试剂盒。所述标志物为PIK3C2B、PDZRN3、TRIM65、ZNF626、RBBP5、DGKZ、PALB2、GABRA2基因中的一种或它们的任何组合。检测所述标志物基因的引物序列如SEQ ID NO:1‑16所示。本发明通过NGS测序分析筛选出特异的与肺癌发生相关的来自ecDNA的标志物基因，使用高通量的NGS分析检测这些标志物基因来评判预测肺癌的发生。本发明提供的特异性标志物，使肺癌早期诊断的检测结果更加精确和特异。技术研发人员：马跃,赵小玉,张亚楠受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18