一种调节补体C3表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种调节补体c3表达的sirna、其缀合物和药物组合物及用途。

背景技术：

1、补体(complement)是先天免疫系统的关键组成部分，由多种成分组成，需要被激活才能发挥作用。补体主要是通过三种激活途径被激活：经典途径、凝集素途径和旁路途径。这些激活途径在不同疾病的发病机制中发挥着不同的作用。补体激活是宿主抵御感染和清除免疫复合物的关键手段。然而，过度的补体激活会导致组织损伤，如溶血，这在疾病中见于阵发性夜间血红蛋白尿(pnh)、非典型溶血性尿毒症综合征和冷凝集素病(cad)等疾病。因此，人们正在努力开发针对不同补体成分的抑制剂作为新的治疗药物。例如，一种针对补体成分5(c5)的单克隆抗体已被批准用于临床，并被证明可有效减少pnh、非典型溶血性尿毒症综合征或cad患者的补体介导的溶血。

2、补体成分3(c3)是所有三种主要补体激活途径的中心成分，这是补体介导的调理作用和膜攻击复合物(mac)形成所必需的。它通过c3转化酶的处理是经典和替代补体途径中的中心反应。活化后，c3b可以通过其活性硫酯与细胞表面碳水化合物或免疫聚集体共价结合。c3a过敏毒素来源于补体c3的蛋白水解降解，是局部炎症过程的介质。在慢性炎症中，作为中性粒细胞的化学引诱剂。它诱导平滑肌收缩，增加血管通透性，并引起肥大细胞和嗜碱性白细胞释放组胺。作为慢性炎症中嗜中性粒细胞的化学引诱剂。c3是补体级联中唯一解决所有三种激活途径的靶标，这些激活途径可以引发和驱动疾病。因此，靶向c3可以全面控制由过量补体激活驱动的疾病。

3、目前，针对治疗补体相关的疾病的药物主要为多肽和单克隆抗体，以c3为靶点的药物研发类型主要是小分子化药，其次是抗体类(参见，参考文献1-6)，大部分项目处于早期开发阶段，只有一款上市药物：pegcetacoplan，它是一种靶向补体c3的聚乙二醇化(pegylated)双环肽，此药品于2021年5月获美国fda批准用于治疗pnh。但该药使用经常会引起一些副作用，包括过敏反应、注射部位反应、感染、腹泻、胃(腹部)疼痛、呼吸道感染、病毒感染和疲劳，而且此类药物半衰期短，持续有效时间短，用药费用昂贵，显然这些药物不能满足所有的临床需求，因此针对该类疾病的治疗方法的需求变得越来越迫切。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种调节补体成分c3 mrna和蛋白表达的sirna、其缀合物和药物组合物及用途，通过特异性的sirna与c3 mrna结合，抑制mrna的翻译，从而抑制c3蛋白的表达。

2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、本发明第一方面提供一种sirna，其包括正义链和反义链，所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述正义链包括如seq id no:1至31中任一项所述序列或与上述序列不超过3个碱基突变的核苷酸序列，所述反义链包括如seq id no:32至62中任一项所述序列或与上述序列不超过5个碱基突变的核苷酸序列。

4、根据某些实施方式，所述正义链包括与上述核苷酸序列中的任一条不超过2个碱基突变的核苷酸序列，不超过1个碱基突变的核苷酸序列。

5、根据某些实施方式，所述正义链的碱基突变可以在核苷酸序列的任意位置，例如第一位、第二位、第三位、第四位、第五位、第六位、第七位、第八位、第九位、第十位、第十一位、第十二位、第十三位、第十四位、第十五位、第十六位、第十七位、第十八位、第十九位中的任意一位、两位或三位。

6、根据某些实施方式，所述反义链包括与上述核苷酸序列中的任一条不超过5个碱基突变的核苷酸序列，不超过4个碱基突变的核苷酸序列，不超过3个碱基突变的核苷酸序列，不超过2个碱基突变的核苷酸序列，不超过1个碱基突变的核苷酸序列。

7、根据某些实施方式，所述反义链的碱基突变可以在核苷酸序列的任意位置，例如第一位、第二位、第三位、第四位、第五位、第六位、第七位、第八位、第九位、第十位、第十一位、第十二位、第十三位、第十四位、第十五位、第十六位、第十七位、第十八位、第十九位、第二十位、第二十一位中的任意一位、两位、三位、四位或五位。

8、根据某些实施方式，按照5’到3’的方向，所述正义链的碱基突变在其核苷酸序列的3’末端，所述反义链的碱基突变在其核苷酸序列的5’末端、第2～8位、3’端最后两位中的任意一位或多位。

9、根据某些实施方式，所示碱基突变包括碱基的替换、插入或者缺失。

10、根据某些实施方式，按照5’到3’的方向，所述正义链的碱基突变在其核苷酸序列的3’末端，所述反义链的碱基突变在其核苷酸序列的5’末端。

11、在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸、2’-氟代修饰的核苷酸、2’-o-ch2-ch2-o-ch3修饰的核苷酸、2’-o-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸、2’-ch2-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸、2’-脱氧基核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、硫代磷酸酯键修饰的核苷酸、vp修饰的核苷酸、lna、ena、cet bna、una、gna或safe-01中的一种或多种的组合，其中，safe-01所示结构式中的r1为h、oh或ch3，base为天然核碱基、修饰的核碱基、通用碱基或h原子。

12、在某些实施方案中，所述正义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个或十九个。

13、在某些实施方案中，所述反义链中的修饰核苷酸的个数为一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或二十一个。

14、在某些实施方案中，所述正义链和所述反义链中的全部的核苷酸为修饰的核苷酸。

15、在某些实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、8和9位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。

16、在某些实施方案中，所述sirna中以下核苷酸之间的连接中至少一个为硫代磷酸酯基连接：

17、所述正义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

18、所述正义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

19、所述正义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

20、所述正义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

21、所述反义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

22、所述反义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；

23、所述反义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；

24、所述反义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。

25、在一些实施方式中，按照5’到3’的方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

26、所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

27、所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

28、所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

29、所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

30、或者，

31、所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

32、所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

33、所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。

34、在一些实施方式中，按照5’到3’的方向，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：

35、所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

36、所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；

37、所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；

38、所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。

39、进一步地，所述正义链和所述反义链的非氟代修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸。

40、在某些实施方案中，所述sirna选自表1或表2中的sirna。

41、本发明第二方面提供一种sirna缀合物，其包括上述sirna中的一条或多条，以及缀合至所述sirna的任意位置的一个或多个缀合基团。

42、根据某些实施方式，所述sirna的任意位置连接两个、三个或四个连续连接的所述缀合基团。

43、根据某些实施方式，所述缀合基团连接在所述正义链的3’末端和/或5’末端。

44、根据某些实施方式，所述sirna缀合物具有以下结构中的任一种：

45、

46、

47、

48、本发明的sirna与n-乙酰半乳糖胺残基偶联，通过去唾液酸糖蛋白受体介导肝细胞特异性摄取，可以维持较长时间的半衰期，从而延长药效时间，这将为补体相关的疾病带来更加安全长效的治疗方法。

49、根据某些实施方式，所述sirna缀合物选自表6或表8所示的sirna缀合物。

50、本发明第三方面提供一种药物组合物，其包括上述sirna或上述sirna缀合物，以及药学上可接受的载体或辅料。

51、在某些实施方案中，所述药物组合物用于调节补体c3的表达。

52、本发明第四方面提供上述sirna，或上述sirna缀合物，或上述药物组合物用于制备治疗和/或预防补体c3的表达相关疾病的药剂的用途。

53、本发明第五方面提供上述sirna，或上述sirna缀合物，或上述药物组合物用于制备治疗和/或预防补体c3的表达相关疾病的药剂的用途。

54、根据某些实施方式，所述疾病包括阵发性夜间血红蛋白尿(pnh)、非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)、视神经脊髓炎(nmo)、多灶性运动神经病变(mmn)、重症肌无力(mg)、c3肾小球肾炎、系统性狼疮、红细胞病、类风湿性关节炎、缺血-再灌注损伤和神经退行性疾病。

55、本发明第六方面提供一种调节补体c3表达的方法，包括将治疗有效量的本发明的sirna，或本发明的sirna缀合物，或本发明的药物组合物与表达c3的细胞接触或给予有需要的受试者。

56、本发明还提供了一种治疗和/或预防补体c3表达相关联的疾病的方法，包括将治疗有效量的本发明的sirna，或本发明的sirna缀合物，或本发明的药物组合物给予有需要的受试者。

57、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

58、本发明提供的sirna、sirna缀合物和药物组合物在细胞实验和动物实验中显示出优异的补体c3表达抑制活性，具有良好的治疗补体c3表达相关联的疾病的潜力。例如，本发明的sirna、sirna缀合物和药物组合物组织特异性好，安全性高；药效持续时间长，皮下给药，用药依从性高；与现有同类型的药物相比，药效和安全性都有很大的提升。