一种AD7c-NTP单克隆抗体及其应用的制作方法

本技术涉及医药的，具体涉及一种ad7c-ntp单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（alzheimer’s disease, ad）是老年期最常见的中枢神经系统退行性疾病，由于早期诊断困难，治疗效果不佳，ad已成为老年医学和神经科学领域中亟待解决的重要问题。ad的两大主要病理特征是脑内细胞外β淀粉样肽（amyloid peptide, aβ）沉积形成的老年斑和细胞内大量异常磷酸化的tau蛋白（p-tau）聚集形成的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangle，nft）。阿尔茨海默病相关神经丝蛋白（ad7c-ntp）是一种在神经元胞体中表达的分子量约41kda的跨膜磷蛋白。1996年麻省总医院的de la monte教授发现，ad7c-ntp在ad脑内表达水平升高，与tau-1共存，与p-tau水平正相关，且出现在组织学尚完整的变性神经元中，证明异常ad7c-ntp蛋白表达增加是ad神经变性的早期事件。随后大量研究表明ad7c-ntp存在于nfts中，主要与诱发神经炎症及细胞死亡有关。

2、目前ad的诊断主要依据患者临床表现、头颅ct或mri等影像学资料、神经心理检查量表等综合评价，临床诊断率低。当前用于ad诊断的特异性生物学指标有aβ42含量、tau蛋白总量和磷酸化tau蛋白等，但是这些生物学指标需要通过腰穿取脑脊液获得，有创伤性，不易被患者接受。因此寻找高敏感度、特异度、无创的生物学指标以提高ad早期诊断率，为早期生活方式干预、药物干预及延缓病程提供帮助。

3、ad7c-ntp可特异性反映大脑神经损伤，与tau蛋白具有同等效力。ad7c-ntp特异性分布大脑额叶、颞叶，只反映大脑神经元损伤；ad7c-ntp为神经元轴突跨膜蛋白，与tau蛋白共同定位；因此提供一种能够用于ad7c-ntp特异性识别检测的ad7c-ntp单克隆抗体检测试剂盒，对于实现阿尔茨海默病快速检测、早期诊断、早期干预具有重大意义。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本技术提供一种ad7c-ntp单克隆抗体及其应用。

2、本技术提供了一种ad7c-ntp单克隆抗体，所述ad7c-ntp单克隆抗体包括：选自a1或a2的重链可变区互补决定区和轻链可变区互补决定区；

3、a1：氨基酸序列分别为seq id no.2~4所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，和氨基酸序列分别为seq id no.5~7所示的轻链可变区cdr1’、cdr2’和cdr3’；

4、a2：氨基酸序列分别为seq id no.10~12所示的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，和氨基酸序列分别为seq id no.13~15所示的轻链可变区cdr1’、cdr2’和cdr3’。

5、根据本技术的一些实施例，所述ad7c-ntp单克隆抗体a1包括氨基酸序列如seq idno.8所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如seq id no.9所示的轻链可变区。

6、根据本技术的一些实施例，所述ad7c-ntp单克隆抗体a2包括氨基酸序列如seq idno.16所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如seq id no.17所示的轻链可变区。

7、本技术中，单克隆抗体的产生不受任何特定的产生单克隆抗体的方法限制。例如：可以为使用培育本发明中杂交瘤细胞、纯化得到所述抗体；或采用重组dna技术获得（如参见journal of virological methods, 2009, 158（1-2）：171-179）。

8、根据本技术的一些实施例，所述ad7c-ntp单克隆抗体选自b1、b2、b3、b4中的任一种：

9、b1为由所述重链可变区和所述轻链可变区连接得到的单链抗体；

10、b2为含有b1所述单链抗体的融合抗体；

11、b3为含有所述重链可变区和所述轻链可变区的fab；

12、b4为含有所述重链可变区和所述轻链可变区的完整抗体。

13、第二方面，本技术提供了一种生物材料，所述生物材料选自c1、c2、c3、c4中的任一种：

14、c1为编码上述任一项所述单克隆抗体的核酸分子；

15、c2为含有c1所述核酸分子的表达盒；

16、c3为含有c1所述核酸分子或c2所述表达盒的重组载体；

17、c4为含有c1所述核酸分子或c2所述表达盒或c3所述重组载体的重组生物细胞。

18、根据本技术的一些实施例，所述c1生物材料核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

19、根据本技术的一些实施例，所述c1生物材料核酸分子可以为编码所述单克隆抗体的基因。

20、根据本技术的一些实施例，所述c2生物材料表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述单克隆抗体的dna，该dna不但可包括启动所述单克隆抗体的编码基因转录的启动子，还可包括终止所述单克隆抗体的编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括复制起始位点、转录起始序列、增强子序列、选择元件或报告基因。

21、根据本技术的一些实施例，所述c3生物材料中所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述载体可以为克隆载体，也可以为表达载体。

22、根据本技术的一些实施例，所述c4生物材料中所述生物细胞可以为细菌（如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等）、藻类、真菌（如酵母或曲霉菌等）、昆虫细胞（如s2果蝇细胞或sf9细胞等）或动物细胞（如cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞或hek293细胞等）。所述生物细胞不包括生殖材料。

23、根据本技术的一些实施例，所述c4生物材料中所述生物细胞具体可以为杂交瘤细胞。所述杂交瘤细胞由脾细胞与sp2/0细胞融合得到。

24、优选地，所述c1生物材料核酸分子的核苷酸序列如d1、d2、d3中的任一项所示；

25、d1中编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no.18所示，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.19所示；

26、d2中编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no.20所示，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.21所示；

27、d3中与d1或d2所示核酸分子具有90%以上同一性且编码所述单克隆抗体的核酸分子。

28、第三方面，本技术提供了一种检测ad7c-ntp的试剂盒，其特征在于，包括上述单克隆抗体。

29、根据本技术的一些实施例，所述试剂盒还包括酶联免疫吸附检测试剂、免疫组织化学检测试剂、免疫荧光检测试剂、免疫印迹检测试剂中的一种。

30、可以理解的是，本技术的产品不限于上述例举的试剂。其他本领域常见的检测ad7c-ntp dna结合蛋白的方法的试剂也可以应用于本发明。

31、根据本技术的一些实施例，所述试剂盒还包括经氨基酸序列如seq id no.1所示的重组ad7c-ntp蛋白免疫动物后得到的多克隆抗体。

32、根据本技术的一些实施例，所述产品的使用方法包括以下步骤：

33、制备含待测样本的血清、尿液，用所述试剂盒检测ad7c-ntp。

34、第四方面，本技术提供了上述单克隆抗体、或上述生物材料在非诊断目的的检测ad7c-ntp或在制备检测ad7c-ntp相关产品中的应用。

35、根据本技术的一些实施例，上述单克隆抗体或上述生物材料或上述试剂盒用于免疫检测及其它涉及抗原抗体特异结合的实验或操作。

36、根据本技术的一些实施例，所述抗原包括ad7c-ntp重组蛋白。

37、综上所述，本技术的技术方案具有以下效果：

38、本技术提供的单克隆抗体1d9和单克隆抗体9c5均能够以较高亲和力与ad7c-ntp特异性结合，且具有较高的灵敏度，检测限较低，具有检测人血清、尿液中ad7c-ntp蛋白含量临床应用价值。

39、此外，本技术还发现通过将单克隆抗体1d9和单克隆抗体9c5进行联合，进行双抗夹心elisa方法检测，能够进一步提高对ad7c-ntp的检测灵敏度。