一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理TiLs的制备方法与流程

本发明涉及生物医学，具体为一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法。

背景技术：

1、恶性肿瘤是指在人体各器官和组织中无限制生长和分化的恶性肿瘤，具有侵犯周围组织和器官甚至远处转移的能力。其起源通常是由于正常细胞的基因突变而失去生长控制，这些突变可能由遗传或环境因素引起。甲状腺癌是一种起源于甲状腺的恶性肿瘤，其种类包括乳头状癌、滤泡状癌等，可能由多种危险因素诱发。

2、甲状腺癌的早期治疗对提高生存率和生活质量至关重要。常见的治疗方法包括手术、放疗、化疗等，但对于中晚期甲状腺癌患者而言，治疗选择较为有限，且效果往往不理想。免疫治疗作为一种新兴治疗手段，尤其是肿瘤浸润性淋巴细胞(tils)的应用，为恶性肿瘤的治疗提供了新的方向。tils是一种存在于肿瘤组织中的淋巴细胞，可以通过识别肿瘤细胞表面抗原来发起免疫反应，对抗肿瘤细胞。然而，传统的tils治疗存在提取和扩增困难、回输后靶标识别率不高等问题。

3、脉冲电场技术的出现为tils治疗提供了新的策略。脉冲电场是一种在极短时间内施加的高强度电场脉冲，这种电场能够短暂地改变细胞膜的通透性，促进药物进入细胞或增加细胞膜对物质的透过性。在tils治疗中，通过脉冲电场预处理tils，可以改变tils的细胞膜电位和通透性，从而增强其活性和抗肿瘤能力。预处理后的tils回输到患者体内，预期能够提高免疫系统对肿瘤的攻击能力，增强免疫反应。

4、本发明针对中晚期甲状腺癌患者的治疗难题，提出了一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，该方法通过脉冲电场技术预处理tils，旨在提升tils的活性，提高其对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，为中晚期甲状腺癌治疗提供新的思路和方法。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，包括以下步骤：

3、s1、获取中晚期甲状腺癌患者体内的肿瘤样本，采用细针抽吸或手术切除的方式；

4、s2、通过混合酶消化法，使用胶原酶和透明质酸酶处理所述肿瘤样本，从而分离出tils；

5、s3、将分离出的tils培养至含有8％-10％热失活胎牛血清的rpmi 1640培养基中，于37℃-40℃、5％-8％co2的条件下进行体外扩增；

6、s4、将扩增后的tils进行纳秒脉冲电场预处理，然后回输给患者。

7、优选的，所述纳秒脉冲电场预处理的参数为电压300至600伏，脉冲宽度10至100纳秒，频率1至10赫兹，预处理的作用时间为1至5分钟，作用频次为每周一次，连续进行4至6周。

8、优选的，所述tils在回输前经过以下评估步骤：

9、流式细胞术鉴定，以确保所回输的tils具有高度的纯度和活性；

10、免疫表型分析，以评估tils的亚群组成和免疫活性；

11、细胞因子分泌分析，以评估tils的功能状态；

12、细胞毒性测试，以确认其对甲状腺癌细胞株的杀伤效率。

13、优选的，所述tils的回输方式为直接注射到肿瘤组织中或者通过静脉注射输送到全身，以实现对中晚期甲状腺癌的治疗。

14、优选的，所述方法进一步包括对患者进行预先的免疫状态评估，以定制化tils的回输方案。

15、优选的，所述方法进一步包括对纳秒脉冲电场预处理后的tils进行基础研究和临床研究，以验证预处理效果和治疗潜力。

16、优选的，所述基础研究包括以下内容：

17、制备中晚期甲状腺癌动物模型，可通过已知化学诱导方法或转基因技术；

18、从动物模型的肿瘤组织中提取tils，操作包括肿瘤切除、机械和酶联分离；

19、在无菌条件下，将提取的tils在特定培养基中培养和扩增；

20、对tils进行纳秒脉冲电场预处理，使用设定的优化参数，并监测其对tils活性的影响，包括增殖速率、细胞因子分泌及细胞毒杀功能；

21、在体外条件下，评估预处理tils对甲状腺癌细胞系的杀伤效率；

22、在动物模型中，评估预处理tils的抗肿瘤效果，包括肿瘤生长抑制和生存期延长。

23、优选的，所述临床研究包括以下内容：

24、从自愿参与的中晚期甲状腺癌患者的肿瘤组织中经过同意后提取tils；在无菌条件下，对患者来源的tils进行培养和扩增

25、应用优化后的纳秒脉冲电场参数对tils进行预处理，以激活和增强其免疫反应能力；

26、对预处理后的tils进行一系列质量控制测试，包括细胞活性、纯度、免疫表型和功能性测试；

27、根据患者的免疫状态和肿瘤特性，进行个体化的tils回输治疗方案设计；

28、进行tils回输，监测患者的免疫反应、肿瘤响应情况和潜在的不良反应；

29、评估tils治疗对中晚期甲状腺癌患者生存期和生活质量的影响。

30、优选的，所述基础研究和临床研究步骤均在经过严格无菌处理的实验室和临床环境中进行，以保证tils的纯度和活性，并确保实验和治疗过程的生物安全性。

31、优选的，干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法在提高患者免疫反应、增强肿瘤细胞杀伤效率以及提升治疗效果的应用。

32、本发明提供了一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法。具备以下有益效果：

33、1、本发明利用高精度的纳秒脉冲电场技术，对传统的肿瘤浸润性淋巴细胞(tils)治疗方法进行了革新，通过精准控制电场的参数，如场强、脉宽、频率、刺激次数及刺激时间，实现了对tils的高效预处理。相较于传统电场，纳秒脉冲电场具有更高的场强和更短的作用时间，能够在不产生热损伤的情况下，实现对细胞膜的瞬时穿透，以及对细胞器和染色质的精准调控，从而激发出多样化的生物学效应和细胞特异性反应。

34、2、本发明纳秒脉冲电场的“一过性”穿透作用能够降低dna甲基化转移酶(dnmt1)的活性，这种独特的分子层面调控，有助于提升tils的肿瘤识别能力，进而增强其对肿瘤细胞的靶向杀伤力。在中晚期甲状腺癌的治疗中，这种方法不仅能够解决传统tils治疗中存在的技术难点，如tils提取及扩增的困难、回输后的靶标识别率不高问题，更能显著提高治疗的效果和患者的生存率。

35、3、本发明为中晚期甲状腺癌患者提供了一种全新的治疗手段，丰富了现有的治疗方法库，为临床治疗提供了新的思路。同时，本技术的发展也代表了免疫治疗领域的一次重大突破，不仅有望改善患者的临床治疗预后，还可能对其他类型的恶性肿瘤治疗提供借鉴和应用的可能性，促进整个免疫治疗学科的科技进步和发展。

技术特征：

1.一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述纳秒脉冲电场预处理的参数为电压300至600伏，脉冲宽度10至100纳秒，频率1至10赫兹，预处理的作用时间为1至5分钟，作用频次为每周一次，连续进行4至6周。

3.根据权利要求2所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述tils在回输前经过以下评估步骤：

4.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述tils的回输方式为直接注射到肿瘤组织中或者通过静脉注射输送到全身，以实现对中晚期甲状腺癌的治疗。

5.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述方法进一步包括对患者进行预先的免疫状态评估，以定制化tils的回输方案。

6.根据权利要求1所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述方法进一步包括对纳秒脉冲电场预处理后的tils进行基础研究和临床研究，以验证预处理效果和治疗潜力。

7.根据权利要求6所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述基础研究包括以下内容：

8.根据权利要求6所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述临床研究包括以下内容：

9.根据权利要求6所述的一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法，其特征在于，所述基础研究和临床研究步骤均在经过严格无菌处理的实验室和临床环境中进行，以保证tils的纯度和活性，并确保实验和治疗过程的生物安全性。

10.一种权利要求1-9任一项所述的干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理tils的制备方法在提高患者免疫反应、增强肿瘤细胞杀伤效率以及提升治疗效果的应用。

技术总结本申请涉及生物医学领域，公开了一种用于干预治疗中晚期甲状腺癌的脉冲电场预处理Ti Ls的制备方法，包括S1、获取中晚期甲状腺癌患者体内的肿瘤样本，采用细针抽吸或手术切除的方式；S2、通过混合酶消化法，使用胶原酶和透明质酸酶处理所述肿瘤样本，从而分离出T iLs；S3、将分离出的Ti Ls培养至含有8％‑10％热失活胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃‑40℃、5％‑8％CO<subgt;2</subgt;的条件下进行体外扩增。本发明利用高精度的纳秒脉冲电场技术，通过精准控制电场的参数，如场强、脉宽、频率、刺激次数及刺激时间，实现了对T iLs的高效预处理，实现对细胞膜的瞬时穿透，以及对细胞器和染色质的精准调控，从而激发出多样化的生物学效应和细胞特异性反应。技术研发人员：晁晓东,蔡敏,王立兵,许艳慧受保护的技术使用者：初源诺康医疗技术开发（西安）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18