经修饰的短干扰核酸(siNA)分子和其用途的制作方法

描述包含经修饰的核苷酸的短干扰核酸(sina)分子、组合物以及其方法与用途。

背景技术：

1、rna干扰(rnai)是针对双股rna的生物反应，所述双股rna介导对内源寄生性与外源病原性核酸的抗性且调控蛋白质编码基因的表达。已研发出短干扰核酸(sina)(诸如sirna)以供用于治疗多种疾病的rnai疗法。举例来说，已提出rnai疗法用于治疗代谢疾病、神经退化性疾病、癌症和病原性感染(参见例如rondindone,生物技术(biotechniques),2018,40(4s),doi.org/10.2144/000112163；boudreau和davidson,发育生物学的当前主题(curr top dev biol),2006,75:73-92；chalbatani等人,国际纳米医学杂志(int jnanomedicine),2019,14:3111-3128；arbuthnot,药物新闻和观点(drug news perspect),2010,23(6):341-50；和chernikov等人,药理学前沿(front.pharmacol.),2019,doi.org/10.3389/fphar.2019.00444，其各自以全文引用的方式并入)。然而，rnai疗法的主要局限在于有效递送sirna至目标细胞且使sirna降解的能力。

2、本公开通过提供包含经修饰的核碱基的sina分子来改良sina分子的递送和稳定性。本公开的sina分子提供经修饰的核苷酸、核苷酸长度、设计(例如钝端或悬垂臂、核苷间键联、结合物)和修饰模式的优化组合和数目，用于改良sina分子的递送和稳定性。

技术实现思路

1、本文描述短干扰核酸(sina)分子，其包含新型经修饰核碱基单体、磷酸酯模拟物和/或其它修饰。本文还描述使用所公开的sina分子治疗各种疾病和病况的方法。

2、在第一方面中，本公开提供一种核苷酸，其包含以下结构：

3、

4、和核酸序列；以及包含前述核苷酸中的任一个或其核苷酸组合的sina。

5、在第二方面中，本公开提供一种核苷酸，其包含以下结构：

6、其中rx是核碱基、芳基、杂芳基或h。举例来说，所述核苷酸可以包含以下结构：

7、其中ry是核碱基。

8、在第三方面中，本公开提供一种核苷酸，其包含以下结构：

9、

10、其中ry是核碱基；和核酸序列，以及包含前述核苷酸的sina。在一些实施例中，所述核苷酸可以包含以下结构：

11、

12、在第四方面中，本公开提供一种核苷酸磷酸酯模拟物，其包含以下结构：

13、

14、其中ry是核碱基且r15是h或ch3。

15、本公开提供短干扰核酸(sina)分子，其包含至少一个、至少两个、至少3个、至少4个或至少5个根据第一、第二或第三方面的核苷酸，其任选地可位于sina的种子区中和/或能够使所述种子区不稳定。在一些实施例中，所述反义股可以包含选自以下的5'-稳定化端帽：

16、

17、

18、其中ry是核碱基且r15是h或ch3。

19、本公开提供短干扰核酸(sina)分子，其包含有义股和反义股，其中所述反义在其5'端处包含根据第四方面的核苷酸磷酸酯模拟物。

20、本公开提供短干扰核酸(sina)分子，其包含：

21、(a)有义股，其包含与对应于目标基因的rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列：

22、长度是15至30个核苷酸；并且

23、包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且从所述第一核苷酸序列的5'端起位置3、5、7、8、9、10、11、12、14、17和/或19处的所述核苷酸是2'-氟核苷酸，或其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且至少一个经修饰的核苷酸是2'-氟核苷酸；和

24、反义股，其包含与对应于所述目标基因的所述rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列：

25、长度是15至30个核苷酸；并且

26、包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且至少一个经修饰的核苷酸是2'-氟核苷酸；或

27、(b)有义股，其包含与对应于目标基因的rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列：

28、(i)长度是15至30个核苷酸；并且

29、(ii)包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且至少一个经修饰的核苷酸是2'-氟核苷酸；和

30、反义股，其包含与对应于所述目标基因的所述rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列：

31、(iii)长度是15至30个核苷酸；并且

32、(iv)包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且从所述第二核苷酸序列的5'端起位置2、5、6、8、10、14、16、17和/或18处的所述核苷酸是2'-氟核苷酸；

33、其中所述有义股和/或所述反义股包含至少一个、至少两个、至少3个、至少4个或至少5个根据第一、第二或第三方面的核苷酸。在一些实施例中，所述反义股可以包含选自以下的5'-稳定化端帽：

34、

35、其中ry是核碱基且r15是h或ch3。

36、本公开提供短干扰核酸(sina)分子，其包含：

37、(a)有义股，其包含与对应于目标基因的rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列：

38、长度是15至30个核苷酸；并且

39、包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且从所述第一核苷酸序列的5'端起位置3、5、7、8、9、10、11、12、14、17和/或19处的所述核苷酸是2'-氟核苷酸，或其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且至少一个经修饰的核苷酸是2'-氟核苷酸；和

40、反义股，其包含与对应于所述目标基因的所述rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列：

41、长度是15至30个核苷酸；并且

42、包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且至少一个经修饰的核苷酸是2'-氟核苷酸；或

43、(b)有义股，其包含与对应于目标基因的rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列：

44、(i)长度是15至30个核苷酸；并且

45、(ii)包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且至少一个经修饰的核苷酸是2'-氟核苷酸；和

46、反义股，其包含与对应于所述目标基因的所述rna至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列：

47、(iii)长度是15至30个核苷酸；并且

48、(iv)包含15个或更多个独立地选自2'-o-甲基核苷酸和2'-氟核苷酸的经修饰的核苷酸，其中至少一个经修饰的核苷酸是2'-o-甲基核苷酸且从所述第二核苷酸序列的5'端起位置2、5、6、8、10、14、16、17和/或18处的所述核苷酸是2'-氟核苷酸；

49、其中所述反义股在其5'端处包含根据第四方面的核苷酸磷酸酯模拟物。

50、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述有义股和/或所述反义股独立地包含1个或多个硫代磷酸酯核苷间键联。

51、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述有义股和/或所述反义股独立地包含1个或多个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联。

52、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述sina进一步包含磷酸化阻断子、半乳糖胺和/或5'-稳定化端帽。

53、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述有义股包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施例中，(i)所述有义股中的至少一个硫代磷酸酯核苷间键联处于从所述第一核苷酸序列的所述5'端起位置1与2处的所述核苷酸之间；(ii)至少一个硫代磷酸酯核苷间键联处于从所述第一核苷酸序列的所述5'端起位置2与3处的所述核苷酸之间。

54、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述反义股进一步包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个硫代磷酸酯核苷间键联。在一些实施例中，(i)所述反义股中的至少一个硫代磷酸酯核苷间键联处于从所述第二核苷酸序列的所述5'端起位置1与2处的所述核苷酸之间；(ii)所述反义股中的至少一个硫代磷酸酯核苷间键联处于从所述第二核苷酸序列的所述5'端起位置2与3处的所述核苷酸之间；(iii)所述反义股中的至少一个硫代磷酸酯核苷间键联处于从所述第二核苷酸序列的所述3'端起位置1与2处的所述核苷酸之间；和/或(iv)至少一个硫代磷酸酯核苷间键联处于从所述第二核苷酸序列的所述3'端起位置2与3处的所述核苷酸之间。

55、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述有义股包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联。在一些实施例中，(i)所述有义股中的至少一个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联处于从所述第一核苷酸序列的所述5'端起位置1与2处的所述核苷酸之间；(ii)至少一个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联处于从所述第一核苷酸序列的所述5'端起位置2与3处的所述核苷酸之间。

56、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述反义股进一步包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联。在一些实施例中，(i)所述反义股中的至少一个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联处于从所述第二核苷酸序列的所述5'端起位置1与2处的所述核苷酸之间；(ii)所述反义股中的至少一个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联处于所述第二核苷酸序列的所述5'端起位置2与3处的所述核苷酸之间；(iii)所述反义股中的至少一个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联处于从所述第二核苷酸序列的所述3'端起位置1与2处的所述核苷酸之间；和/或(iv)至少一个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联处于所述第二核苷酸序列的所述3'端起位置2与3处的所述核苷酸之间。

57、本公开另外提供短干扰核酸(sina)，其包含有义股和反义股，其中所述有义股和/或所述反义股独立地包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基磷酸甲磺酰酯核苷间键联。

58、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述反义股包含选自由以下组成的群组的5'-稳定化端帽：式(1)至式(16)、式(9x)至式(12x)、式(16x)、式(9y)至式(12y)、式(16y)、式(21)至式(36)、式36x、式(41)至(56)、式(49x)至(52x)、式(49y)至(52y)、式56x、式56y、式(61)、式(62)和式(63)：

59、

60、

61、

62、其中rx是核碱基、芳基、杂芳基或h。

63、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述反义股包含选自由以下组成的群组的5'-稳定化端帽：式(71)至式(86)、式(79x)至式(82x)、式(79y)至(82y)、式86x、式86x'、式86y和式86y'：

64、

65、

66、其中rx是核碱基、芳基、杂芳基或h。

67、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述反义股包含选自由以下组成的群组的5'-稳定化端帽：式(1a)至(15a)、式(1a-1)至(7a-1)、式(1a-2)至(7a-2)、式(1a-3)至(7a-3)、式(1a-4)至(7a-4)、式(9b)至(12b)、式(9ax)至(12ax)、式(9ay)至(12ay)、式(9bx)至(12bx)和式(9by)至(12by)：

68、

69、

70、

71、

72、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述反义股包含选自由以下组成的群组的5'-稳定化端帽：式(21a)至(35a)、式(29b)至(32b)、式(29ax)至(32ax)、式(29ay)至(32ay)、式(29bx)至(32bx)和式(29by)至(32by)：

73、

74、

75、

76、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述反义股包含选自由以下组成的群组的5'-稳定化端帽：式(71a)至(86a)、式(79xa)至(82xa)、式(79ya)至(82ya)、式(86xa)、式(86x'a)、式(86y)和式(86y')：

77、

78、

79、

80、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述sina进一步包含半乳糖胺。在一些实施例中，所述半乳糖胺是式(vi)的n-乙酰半乳糖胺(galnac)：其中

81、m是1、2、3、4或5；

82、各n独立地是1或2；

83、p是0或1；

84、各r独立地是h；

85、各y独立地选自-o-p(＝o)(sh)-、-o-p(＝o)(o)-、-o-p(＝o)(oh)-和-o-p(s)s-；

86、z是h或第二保护基；

87、l是连接子，或l与y的组合是连接子；并且

88、a是h、oh、第三保护基、活化基团或寡核苷酸。

89、在所公开的sina分子的一些实施例中，所述半乳糖胺是式(vii)的n-乙酰半乳糖胺(galnac)：

90、其中rz是oh或sh；并且各n独立地是1或2。

91、在所公开的sina分子的一些实施例中，(i)所述sina的至少一端是钝端；(ii)所述sina的至少一端包含悬垂臂，其中所述悬垂臂包含至少一个核苷酸；或(iii)所述sina的两端均包含悬垂臂，其中所述悬垂臂包含至少一个核苷酸。

92、在所公开的sina分子的一些实施例中，(i)所述目标基因是病毒基因；(ii)所述目标基因是来自dna病毒的基因；(iii)所述目标基因是来自双股dna(dsdna)病毒的基因；(iv)所述目标基因是来自嗜肝dna病毒的基因；(v)所述目标基因是来自乙型肝炎病毒(hbv)的基因；(vi)所述目标基因是来自基因型a至j中的任一种的hbv的基因；或(vii)所述目标基因是选自hbv的s基因或x基因。

93、本公开提供表1、表2、表3、表4和表5中所示的sina。

94、本公开提供组合物，其包含如本文所公开的sina；和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，所述组合物可以进一步包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种如本文所公开的sina。在一些实施例中，所述组合物可以进一步包含另一种治疗剂。举例来说，所述另一种治疗剂选自核苷酸类似物、核苷类似物、衣壳组装调节剂(cam)、重组干扰素、进入抑制剂、小分子免疫调节剂和寡核苷酸疗法，诸如另一种sina、反义寡核苷酸(aso)、nap或stopstm。

95、本公开提供治疗有需要受试者的疾病的方法，其包含向所述受试者给予本文所公开的sina或包含本文所公开的sina的组合物。本公开进一步提供所公开的sina和组合物用于治疗受试者的疾病的用途。本公开进一步提供用于治疗受试者的疾病的sina和组合物。

96、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述疾病是病毒性疾病，其任选地由dna病毒或双股dna(dsdna)病毒引起。在一些实施例中，所述dsdna病毒是嗜肝dna病毒。在一些实施例中，所述嗜肝dna病毒是乙型肝炎病毒(hbv)，且任选地其中所述hbv选自hbv基因型a至j。在一些实施例中，所述方法和用途可以进一步包含给予另一种hbv治疗剂。在一些实施例中，所述sina或所述组合物与所述另一种hbv治疗剂是同时给予或依序给予。在一些实施例中，所述另一种hbv治疗剂选自核苷酸类似物、核苷类似物、衣壳组装调节剂(cam)、重组干扰素、进入抑制剂、小分子免疫调节剂和寡核苷酸疗法。在一些实施例中，所述病毒性疾病是由冠状病毒引起的疾病，且任选地其中所述冠状病毒是sars-cov-2。

97、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述疾病是肝病。在一些实施例中，所述肝病是非酒精性脂肪肝病(nafld)或肝细胞癌(hcc)。在一些实施例中，所述nafld是非酒精性脂肪变性肝炎(nash)。一些实施例可以进一步包含向所述受试者给予肝病治疗剂。在一些实施例中，所述肝病治疗剂选自过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisomeproliferator-activator receptor；ppar)促效剂、法尼醇x受体(farnesoid x receptor；fxr)促效剂、脂质改变剂和基于肠泌素的疗法。在一些实施例中，(i)所述ppar促效剂选自pparα促效剂、双重pparα/δ促效剂、pparγ促效剂和双重pparα/γ促效剂；(ii)所述脂质改变剂是阿雷美罗(aramchol)；或(iii)所述基于肠泌素的疗法是胰高糖素样肽1(glucagon-like peptide 1；glp-1)受体促效剂或二肽基肽酶4(dpp-4)抑制剂。在一些实施例中，所述sina或组合物与所述肝病治疗剂是同时给予或依序给予。

98、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物以至少1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg或15mg/kg的剂量给予。

99、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物以0.5mg/kg至50mg/kg、0.5mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至40mg/kg、1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至50mg/kg、3mg/kg至40mg/kg、3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、3mg/kg至10mg/kg、4mg/kg至50mg/kg、4mg/kg至40mg/kg、4mg/kg至30mg/kg、4mg/kg至20mg/kg、4mg/kg至15mg/kg、4mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至50mg/kg、5mg/kg至40mg/kg、5mg/kg至30mg/kg、5mg/kg至20mg/kg、5mg/kg至15mg/kg或5mg/kg至10mg/kg的剂量给予。

100、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物给予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。

101、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物一天给予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，一周给予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或一个月给予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。

102、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天给予至少一次。

103、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物给予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、51、52、53、54或55周的一段时间。

104、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物以5mg/kg或10mg/kg的单次剂量、以每周一次的10mg/kg的三次剂量、以每三天一次的10mg/kg的三次剂量或以每三天一次的10mg/kg的五次剂量给予。

105、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物以在1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、2mg/kg至10mg/kg、3mg/kg至15mg/kg或3mg/kg至10mg/kg范围内的六次剂量给予；其中第一次剂量与第二次剂量任选地相隔至少3天给予；其中第二次剂量与第三次剂量任选地相隔至少4天给予；并且其中第三次剂量与第四次剂量、第四次剂量与第五次剂量和/或第五次剂量与第六次剂量任选地相隔至少7天给予。

106、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物在粒子或病毒载体中给予，其中所述病毒载体任选地选自腺病毒、腺相关病毒(aav)、α病毒、黄病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、麻疹病毒、微小rna病毒、痘病毒、反转录病毒和棒状病毒的载体。在一些实施例中，所述病毒载体是重组病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体选自aavrh.74、aavrh.10、aavrh.20、aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12和aav-13。

107、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物是全身性给予或局部给予。

108、在所公开的方法和用途的一些实施例中，所述sina或所述组合物是静脉内、皮下或肌肉内给予。

109、前述一般描述和以下详细描述是例示性和解释性的，且意图提供如所要求的本公开的进一步解释。根据本公开的以下附图简单说明和详细描述，其它目标、优势和新型特征对于所属领域的技术人员将显而易见。