经修饰的抗VEGFR2(KDR)抗体及其用途的制作方法

本发明涉及具有改善特性的经修饰的抗vegfr2(kdr)抗体或其抗原结合片段，以及其用途。具体地，本发明涉及抗vegfr2(kdr)抗体，其中，人抗体的重链框架区(fr)中的vh1被vh3置换，人抗体的轻链框架区(fr)中的vl1被vk1置换，其中，人抗体特异性结合vegfr2/kdr，并且诱导突变以增加对抗原的亲和力；或其抗原结合片段；用于诊断或治疗血管生成相关疾病的组合物，该组合物包括抗体或其抗原结合片段；用于预防或治疗肿瘤或癌症的组合物；以及用于与除抗体之外的治疗剂组合给药的组合物。

背景技术：

1、vegfr2/kdr是主要的血管生成受体，结合vegf异构体a、c、d和e，并且不仅对内皮细胞分化很重要，而且对vegf的促有丝分裂、血管生成和渗透性增强作用也很重要。抗vegfr2抗体可以阻止所有已知的vegf异构体与vegfr2/kdr结合以及启动信号传导。此外，由于肿瘤分泌更多的vegf，而受体的数量保持相对恒定，因此即使存在非常高水平的vegf异构体，靶向受体也增加了完全抑制信号传导的可能性。

2、血管生成意指通过内皮细胞的生长、分裂和迁移从现有血管形成新血管。在成人中，除非在特殊情况下，诸如伤口愈合或女性生殖周期，否则它不会发生。然而，过度的血管生成在疾病诸如肿瘤生长和转移、年龄相关性黄斑变性、类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变变、银屑病或慢性炎症中已有所报道(cameliet andjain,nature,407:249,2000)，并且为此，已进行了大量努力来使用血管生成抑制剂治疗疾病，尤其是肿瘤。

3、参与血管生成的因子包括血管内皮生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)、血小板源性生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgfb)和成纤维细胞生长因子(fgf)，其中的内皮生长因子是直接参与分化和迁移的内皮细胞特异性因子，并有四种不同的异构体(vegf165、vegf121、vegf189、vegf206)，并且vegf165是除胎盘外的所有人组织中最丰富的异构体(tisher et al.,j biol chem,266:11947,1991)。

4、血管内皮生长因子(vegf)调节来自内皮前体(成血管细胞)的原位分化的新血管的形成，在伤口愈合期间(brown et al.,j.exp.med.,176:1375,1992)于胚胎组织(breieret al,development(camb),114:521,1992)、巨噬细胞和增殖的上皮角质形成细胞中表达，并可以导致与炎症相关的组织水肿(ferrara et al.,endocr.rev.,13:18,1992)。原位杂交研究已示出，vegf在许多人肿瘤细胞系(包括多形性胶质母细胞瘤、血管母细胞瘤、中枢神经系统赘生物和艾滋病相关的卡波西氏肉瘤)中高度表达(plate et al.,nature 359:845,1992；plate et al.,cancer res.53:5822,1993；berkman et al.,j.clin.invest.91:153,1993；nakamura et al.,aids weekly.13(1),1992)。在缺氧诱导的血管生成中也观察到了高水平的vegf(shweiki et al.,nature 359:843,1992)。

5、vegf的生物学功能是通过vegf受体介导的，其对vegf具有高亲和力，并在胚胎发生期间(millauer et al.,cell,72:835,1993)和肿瘤发生期间在内皮细胞中选择性表达。通常，vegf受体(vegfr)是iii类受体型酪氨酸激酶，其特征为在其氨基末端胞外受体配体结合结构域中具有多个、典型地五个或七个免疫球蛋白样环(kaipainen et al.,j.exp.med.,178:2027,1993)。其他两个位点包括羧基末端细胞内催化结构域和跨膜位点，该跨膜位点被称为激酶插入结构域的可变长度亲水性激酶间序列的插入所破坏(termanet al.,oncogene,6:1677,1991)。vegfr包括fms样酪氨酸激酶受体(flt-1)或vegfr-1(shibuya et al.,oncogene,5:519,1990；wo 92/14248；terman et al,oncogene,6:1677,1991)，以及包含激酶插入结构域的受体/胎儿肝脏激酶(kdr/flk-1)或vegfr-2(matthewset al.,proc.natl.acad.sci.usa,88:9026,1991)，尽管其他受体诸如神经纤毛蛋白-1和神经纤毛蛋白-2也可以结合vegf。另一种酪氨酸激酶受体vegfr-3(flt-4)与vegf同源物vegf-c和vegf-d结合，并且在淋巴管的发育中起重要作用。

6、高水平的flk-1通过浸润性胶质瘤的内皮细胞来表达。(plate et al.,nature359:845,1992)。flk-1水平被由人胶质母细胞瘤产生的vegf特异性上调(plate et al.,cancer res.53:5822,1993)。flk-1在胶质母细胞瘤相关内皮细胞(gaec)中高水平表达的事实表明，受体活性可能在肿瘤发生期间被诱导，因为在正常脑内皮细胞中几乎检测不到flk-1转录物。这种上调只发生在肿瘤附近的血管内皮细胞中。用中和抗vegf单克隆抗体(mab)阻断vegf活性抑制了裸鼠中人肿瘤移植物的生长(kim et al.,nature 362:841,1993)，表明vegf在肿瘤相关血管生成中的直接作用。

7、尽管vegf配体在肿瘤细胞中得到上调，并且其受体在肿瘤浸润性的血管内皮细胞中得到上调，但在不参与血管生成的正常细胞中vegf配体及其受体的表达较低。因此，这些正常细胞阻断了vegf与其受体之间的相互作用，从而抑制了血管生成，并因此抑制了肿瘤生长。

8、高水平的vegfr-2由浸润性胶质瘤的内皮细胞表达，并通过人胶质母细胞瘤所产生的vegf特异性上调(plate et al.,nature,359:845,1992；plate etal.,cancer res.,53:5822,1993)。由于在正常脑内皮细胞中很少检测到vegfr-2转录物，vegfr-2在胶质母细胞瘤相关内皮细胞(gaec)中的高水平表达表明了受体活性在肿瘤发生期间被诱导。

9、vegf在多种类型的肿瘤中高水平表达(plate et al.,nature,359:8435,1992；dvorak et al.,j.exp.med.,174:1275,1991)，并且新形成的毛细血管聚集在产生vegf的肿瘤细胞周围(plate et al.,nature,359:8435,1992)。在缺氧条件下，诸如与快速生长的肿瘤相关的那些条件下，vegf表达得到强烈上调(shweiki et al.,nature,359:843,1992)。通过抗体诸如贝伐单抗(avastin)(ferrara et al.,nat rev drug discov.,3(5):391,2004；avery et al.,ophthalmology,113(3):363,2006)中和vegf是一种经临床批准的疗法，用来抑制癌症或其他血管生成疾病诸如amd。然而，即使与化疗组合也发现了对vegf阻断的抗性。这种抗性可能与脉管系统重塑和其他血管生成因子表达增加有关。因此，本领域仍然需要用于抑制癌症和与血管生成相关的其他疾病的改进的组合物和方法。

10、尽管酪氨酸激酶抑制剂(tki)和抗kdrp抗体两者都可以抑制kdr介导的血管生成，但抗体方法比tki更具优势。与tki不同，抗kdr抗体是更特异的kdr靶标(即，抗kdr抗体不抑制其他vegf受体)。由于这种更高的特异性，抗kdr抗体可以限制和/或避免由特异性较低的tki引起的脱靶效应和毒性(witte et al.,cancer metastasis rev.,jun；17(2):155,1998)。

11、与仅结合一种配体(vegf-a)的贝伐单抗不同，抗kdr抗体有望阻止所有已知的vegf与vegfr2/kdr结合。与单纯阻断vegf-a相比，抗kdr抗体可以对肿瘤血管生成具有更强的抑制作用。在贝伐单抗抗性的情况下，使用抗kdr抗体的疗法可以是有效的。

12、在此技术背景下，本发明的发明人通过将重链可变区的框架区(fr)从vh1置换为vh3以及将轻链可变区的框架区(fr)从vl1置换为vk1，并通过在重链和轻链的cdr3区诱导突变以增加对抗原的亲和力，从而产生对抗原的亲和力增加的新型抗体，来对特异性结合vegfr2/kdr的现有抗体进行了改善。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供具有与vegfr2/kdr改善结合的经修饰的抗体或其抗原结合片段。

2、本发明的另一目的是提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

3、本发明的另一目的是提供包括所述核酸的载体、包括所述载体的转基因细胞，及制备其的方法。

4、本发明的另一目的是提供用于预防或治疗血管生成疾病的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。本发明的另一目的是提供预防或治疗血管生成疾病的方法，包括向个体给药所述抗体或其抗原结合片段的步骤。本发明的另一目的是提供所述抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗血管生成疾病的组合物中的用途。

5、本发明的另一目的是提供用于诊断血管生成疾病的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。

6、本发明的另一目的是提供用于预防或治疗肿瘤或癌症的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。本发明的另一目的是提供预防或治疗癌症的方法，包括向个体给药所述抗体或其抗原结合片段的步骤。本发明的另一目的是提供所述抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗癌症的组合物中的用途。

7、本发明的另一目的是提供用于与其他治疗剂共同给药的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。

8、为了实现上述目的，本发明提供了与vegfr2/kdr结合的抗体或其抗原结合片段，包括：

9、重链cdr1，包括选自由seq id no:1、7、13、19和25组成的组的序列，

10、重链cdr2，包括选自由seq id no:2、8、14、20和26组成的组的序列；以及

11、重链可变区，包括含有选自由seq id no:3、9、15、21、27、51、52和53组成的组的序列的重链cdr3；以及

12、轻链cdr1，包括选自由seq id no:4、10、16、22和28组成的组的序列，

13、轻链cdr2，包括选自由seq id no:5、11、17、23和29组成的组的序列；以及

14、轻链可变区，包括含有选自由seq id no:6、12、18、24和30组成的组的序列的轻链cdr3。

15、本发明还提供与vegfr2/kdr结合的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重链可变区包括与选自由seq id no:32、36、40、44和48组成的组的序列具有至少80％同一性的序列。

16、本发明还提供与vegfr2/kdr结合的抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与选自由seq id no:34、38、42、46和50组成的组的序列具有至少80％同一性的序列。

17、本发明还提供与vegfr2/kdr结合的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括与选自由seq id no:32、36、40、44和48组成的组的序列具有至少80％同一性的序列，所述轻链可变区包括与选自由seq id no:34、38、42、46和50组成的组的序列具有至少80％同一性的序列。

18、本发明还提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

19、本发明还提供包括所述核酸的载体。

20、本发明还提供包括所述载体的转基因细胞。

21、本发明还提供生产所述抗体或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤:(a)培养细胞；和(b)从所培养的细胞中回收所述抗体或其抗原结合片段。

22、本发明还提供用于预防或治疗血管生成疾病的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。

23、本发明还提供用于诊断血管生成疾病的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。

24、本发明还提供用于预防或治疗肿瘤或癌症的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。

25、本发明还提供用于与其他治疗剂共同给药的组合物，包括所述抗体或其抗原结合片段。