具有多价作用的肽的制作方法

本发明属于用于治疗炎症和/或感染的肽领域。具体地，本发明提供了具有良好稳定性、高抗炎活性和/或抗微生物活性的肽。

背景技术：

1、toll-样受体4(tlr4)感知的脂多糖(lps)对于感染的早期应答至关重要，随后的nfκb激活会导致与脓毒症和ards相关的多种生物学效应，包括释放细胞因子、趋化因子以及随后有害的止血障碍，导致凝血因子和其他介导物的消耗。有趣的是，刺突糖蛋白作为sars-cov-2的主要细胞外蛋白在体外和动物模型中增强lps应答，为covid-19期间观察到的ards提供了分子解释(petruk等人，jmcb，2020)，其中不受控制的lps应答引起过度的局部化炎症，但也会引起严重的对感染的全身性应答。因此，尽管lps的感知对于初始的宿主防御应答是重要的，但为了避免过度炎症和器官损伤，该分子的清除和控制也至关重要。

2、目前基于抗生素和抗病毒药的治疗仅针对微生物，而不针对伴随的免疫应答的过度激活，例如脓毒症中所观察的情况。在美国这是导致死亡的主要原因之一，每年估计有超过700,000例病例，脓毒性休克患者的死亡率为30-50％。因此，不仅针对目标细菌还针对过度的免疫应答的基于天然的自身先天防御策略的治疗概念可能具有显著的治疗潜力。大约2kda的凝血酶衍生的c-端肽(tcp)已被证明在体外和体内发挥抗内毒素功能。这些较小的肽属于宿主防御肽(hdp)的不同家族，其中包括中性粒细胞衍生的α-防御素和cathelicidin ll-37，它们已知都具有免疫调节活性。包含天然tcp的序列的tcp-25(seqid no:12)已被证明可在体外中和lps，并在实验动物模型中保护对抗铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)脓毒症和lps介导的休克，这主要通过减少全身性细胞因子应答来实现(kalle等人，plos one，2011)。

3、tcp-25与lps结合，直接与单核细胞和巨噬细胞相互作用，并干扰cd14信号传导和tlr4/md2二聚化，从而抑制响应于微生物衍生的激动剂和完整细菌的tlr4-和tlr2-诱导的nf-kb激活(saravanan等人,nat comm,2018)。tcp除了与细菌膜和lps相互作用外，还与cd14的lps结合沟结合(saravanan等人，nat comm，2018)。tcp对lps和cd14发挥多种相对弱的亲和力(全部在μm范围内)这一事实，能够调节宿主对感染的应答。tcp与瞬态药物(transient drug)共有许多特征，由它们的多价、多靶点、高解离率和μm水平的kd值所定义，因此tcp在开发受自然启发的新型抗炎疗法方面引起了人们的兴趣。

4、然而，与许多基于肽的疗法一样，tcp-25会被内源蛋白酶降解(puthia等人，2020)。对于诸如脓毒症和ards的需要全身应用或吸入应用的疾病，快速降解的肽需要令人生畏的大剂量和频繁施用。此外，从药理学角度来看，提高与其靶受体cd14的亲和力是有利的，如此可降低所需的有效浓度。最后，由于tcp-25形成寡聚物并在较高浓度下聚集，从药物递送的角度来看改善溶解度是有利的。

技术实现思路

1、本发明提供了具有多种有利特性的肽，所述特性包括以下一种或多种：

2、·高体内稳定性

3、·在蛋白酶(例如人中性粒细胞弹性蛋白酶(hne)、假单胞菌弹性蛋白酶(pe)和/或胰蛋白酶)的存在下，具有增加的稳定性

4、·高抗炎活性，例如通过炎性细胞因子例如tnf-α和/或il-1β的释放减少或nf-κb活性降低来确定

5、·抗微生物活性，例如针对革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的杀菌活性

6、·在血液中具有低溶血活性

7、·对rbc的低溶血活性

8、·低毒性

9、特别地，本发明的肽在具有高抗炎活性的浓度下在血液中具有低溶血活性。

10、本发明的优选肽具有所有上述特性。高体内稳定性、增加的对蛋白酶的稳定性以及低溶血活性使得本发明的肽特别可用于全身施用。具体地，本发明提供了肽，其在具有高抗炎活性的浓度下对红细胞(rbc)具有低溶血活性。

11、更具体地，本发明的肽基于凝血酶衍生肽(thrombin derived peptide)，其结构已被两个不相邻氨基酸之间的共价连接锁定。有趣的是，本发明的肽具有多个(优选全部)上述有利特性。许多线性凝血酶衍生肽都具有抗炎和抗微生物活性，但它们的体内稳定性通常较低。

12、具有稳定化结构的本发明的肽通常包含螺旋结构。它们可具有稳定化的蛋白酶抗性结构，发挥抗微生物活性，并且通常具有改善的抗炎功效。因此，本发明的肽是令人感兴趣的先导抗炎肽模拟物。与天然tcp相比，所述肽通常具有较低的寡聚化倾向。药物的寡聚化是一种众所周知的现象，它会导致聚集、降低功效并增加延迟性免疫反应的风险。因此，本发明的肽通常表现出显著较少的寡聚化，这从药物角度来看是有利的。

13、内源性tcp hvf18在低ph条件下对lps具有较高的亲和力。本发明的优选肽在n-端具有增加的极性和电荷，例如通过添加阳离子k和r残基。通过采用核磁共振波谱(nmr)、生物物理、质谱、微生物学、细胞和体内研究的组合，本发明表明，与可具有高毒性和降低的抗炎活性的具有较长阳离子延伸的肽对比，电荷增加、特别是电荷增加+2可以产生最佳功效和高治疗指数。

14、肽钉合(stapling of peptides)可以改善其蛋白水解稳定性，然而，令人惊讶的是，某些凝血酶衍生肽的钉合还导致不期望的效果。例如，gky25在单个位置的钉合会产生具有高溶血活性的肽，这是不希望的。与未钉合的gky25相比，gky25在单个位置的钉合进一步导致肽的抗炎作用降低。

15、令人惊奇的是，本发明公开了与较长的肽例如gky25相比，总长度为10至23个氨基酸、例如13至23个氨基酸的较短的凝血酶衍生肽具有大部分并且通常是全部上述有利特性。

16、此外，本发明公开了长度为24至40个氨基酸的较长的凝血酶衍生肽在至少两个位置处的钉合使得所述肽具有一些上述有利特性。

17、本发明还表明，包含另外的带正电荷的氨基酸的肽具有甚至更好的抗炎作用。

18、此外，本发明的肽还可以具有抗凝血活性。本发明表明，包含另外的带正电荷的氨基酸的肽可以具有甚至更好的抗凝血活性。

19、本发明提供了包含来自seq id no:1的凝血酶的10至23个氨基酸范围内的含有至多6个氨基酸取代的连续序列的肽，其中所述肽：

20、i)总长度在10至40个氨基酸之间；

21、ii)在两个不相邻的内部氨基酸的侧链之间包含至少一个内部共价连接，其中所述氨基酸表示为x1和x2；和

22、iii)至少包含seq id no:1的凝血酶的氨基酸k247、k248和k252；

23、条件是，如果所述肽的总长度在24至40个氨基酸之间，则它在两个不相邻的内部氨基酸的侧链之间包含至少两个内部共价连接，其中第一内部共价连接的氨基酸表示为x1和x2，并且第二内部共价连接的氨基酸表示为x3和x4。