通过人工共表达HDLBP/VIGILIN的蛋白质表达和分泌的增加的制作方法

本发明涉及用于生产感兴趣的分泌型重组蛋白质的方法、和用于生产感兴趣的分泌型蛋白质的细胞。

背景技术：

1、在真核细胞中，功能性蛋白质产物的最终定位在很大程度上取决于它们翻译的位点。当可溶性蛋白在胞质溶胶中翻译时，靶向内质网(er)的共翻译使新合成的蛋白质能够进入分泌途径，导致其分泌或膜整合。

2、典型分泌途径在胞质溶胶中起始于疏水性靶向信号(信号肽或跨膜结构域)的合成。随后信号识别颗粒(srp)与新生肽的结合导致核糖体延伸停滞和核糖体新生链复合物(rnc)的形成。这使得胞质溶胶srp-rnc经由srp受体重新定位至er膜，并将新生肽转运至er腔。

3、近年来，在酵母中发现了一种非典型srp非依赖性途径，伴有在核糖体结合(engagement)和srp非依赖性er靶向之前将srp募集到mrna的证据。这增加了识别膜结合mrna的未知机制的存在的可能性。

4、mrna序列中调控元件对于核糖体延伸停滞和新生链识别的潜在作用尚不清楚。一些研究已经鉴定了编码序列(cds)和3’非翻译区(3’utr)中的元件，所述元件可以区分er结合的mrna和胞质溶胶的mrna。然而，可能负责识别这些元件的反式作用因子是未知的。

5、最近，观察到编码可溶性蛋白的一小子集mrna也可能在er定位和翻译，表明调控定位的mrna的命运的额外的机制。虽然有证据表明er相关核糖体的亚库(subpool)与肌肉中的丙酮酸激酶相互作用，但胞质溶胶的核糖体和er结合的核糖体在组成、装配和主动翻译状态的全面差异尚未确定。

6、此外，在er发现了核糖体依赖性无义介导的衰变(nmd)途径的新颖变体，提示er结合的mrna的新的调控层。总之，编码可溶性蛋白和膜蛋白的mrna的翻译命运可能受到反式作用因子例如rna结合蛋白的严格调控，其功能可能超出典型srp依赖性模型。

7、在生物技术以及生物医学领域中，分泌型蛋白质例如治疗性抗体、激素、酶等的生产和易于获得具有重大的经济利益。优化和提高此类基于蛋白质的化合物、特别是可用于医疗目的的那些化合物的生产的手段具有重大的社会和经济意义。

8、因此，需要新的策略和方法来改进和增加此类基于蛋白质的化合物在细胞表达系统中的生产、表达和分泌。

9、因此，本发明的目的在于提供用于在细胞中表达和分泌感兴趣的分泌型重组蛋白质的新颖且有利的方法。

10、本发明的另一目的在于提供用于表达分泌型重组蛋白质的改进的细胞表达系统。

11、此外，本发明的目的也在于提供此类改进的细胞表达系统在生产感兴趣的分泌型重组蛋白质的方法中的用途。

技术实现思路

1、前述目的是通过如下文中规定的本发明的各方面而得以解决的。

2、根据本发明的第一方面，提供一种用于在细胞中生产感兴趣的分泌型重组蛋白质的方法，其中所述方法包括人工地共表达与感兴趣的分泌型重组蛋白质不同的蛋白质，其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，或者其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

3、在本发明的第一方面的优选实施方案中，共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:1或根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，更优选共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:1或根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少98％、甚至更优选至少99％序列同一性。

4、在本发明的第一方面的另一优选实施方案中，共表达的蛋白质包括根据seq idno:1或根据seq id no:2的氨基酸序列，更优选共表达的蛋白质由根据seq id no:1或根据seq id no:2的氨基酸序列组成。

5、在本发明的第一方面的一个优选实施方案中，感兴趣的分泌型重组蛋白质适用于基于蛋白质的疗法，更优选分泌型重组蛋白质选自由以下组成的组：抗体如治疗性抗体、或其抗原结合片段、或纳米抗体、或抗体-药物缀合物、或重组融合蛋白、或外泌体、或细胞因子如ifn-β、或激素如胰岛素、或激素类似物如gnrh类似物。

6、在本发明的第一方面的优选实施方案中，所述细胞为真核细胞。

7、在本发明的第一方面的另一优选实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：cho细胞、bhk 21细胞、hek293细胞、c127、a549、sp2/0、yb2/0、sf-9细胞、ns0细胞、vero细胞、及它们的任何衍生物。

8、在本发明的第一方面的一个优选实施方案中，所述方法在体外进行。

9、根据本发明的第二方面，提供了一种真核细胞，其中所述细胞经修饰以生产感兴趣的分泌型重组蛋白质，其中所述细胞人工地共表达与感兴趣的分泌型重组蛋白质不同的蛋白质，其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％同源性，或者其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

10、在本发明的第二方面的优选实施方案中，感兴趣的分泌型重组蛋白质为瞬时型、组成型和/或诱导型/条件型表达的。

11、在本发明的第二方面的另一优选实施方案中，所述细胞包括编码感兴趣的分泌型重组蛋白质的重组多核苷酸序列，更优选所述细胞包括包含编码感兴趣的分泌型重组蛋白质的重组多核苷酸序列的非基因组重组多核苷酸序列、表达盒或载体。

12、在本发明的第二方面的一个优选实施方案中，编码感兴趣的分泌型重组蛋白质的细胞中表达的重组多核苷酸序列包括在编码序列内的整合的富含cu的同义密码子，优选其中重组多核苷酸序列为mrna序列。

13、在本发明的第二方面的优选实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：cho细胞、bhk 21细胞、hek293细胞、c127、a549、sp2/0、yb2/0、sf-9细胞、ns0细胞、vero细胞、及它们的任何衍生物。

14、在本发明的第二方面的另一优选实施方案中，感兴趣的分泌型重组蛋白质适用于基于蛋白质的疗法，更优选其中分泌型重组蛋白质选自由以下组成的组：抗体如治疗性抗体、或其抗原结合片段、或纳米抗体、或抗体-药物缀合物、或重组融合蛋白、或外泌体、或细胞因子如ifn-β、或激素如胰岛素、或激素类似物如gnrh类似物。

15、根据本发明的第三方面，提供根据本发明的第二方面的真核细胞在体外生产感兴趣的分泌型重组蛋白质的方法中的用途。

技术特征：

1.一种用于在细胞中生产感兴趣的分泌型重组蛋白质的方法，其中所述方法包括人工地共表达与所述感兴趣的分泌型重组蛋白质不同的蛋白质，其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，或者其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq idno:1或根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，优选其中所述共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:1或根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少98％、更优选至少99％序列同一性。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述共表达的蛋白质包括根据seq idno:1或根据seq id no:2的氨基酸序列，优选其中所述共表达的蛋白质由根据seq id no:1或根据seq id no:2的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的分泌型重组蛋白质适合于基于蛋白质的疗法，优选其中所述分泌型重组蛋白质选自由以下组成的组：抗体如治疗性抗体、或其抗原结合片段、或纳米抗体、或抗体-药物缀合物、或重组融合蛋白、或外泌体、或细胞因子如ifn-β、或激素如胰岛素、或激素类似物如gnrh类似物，更优选其中所述感兴趣的分泌型重组蛋白质为epo-fc。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，与野生型序列相比，编码所述感兴趣的分泌型重组蛋白质的多核苷酸具有至少一个已优化为具有增加的cu含量的编码pro、ser或leu的密码子，优选其中至少一个编码leu的密码子已优化为cuu、或至少一个编码pro的密码子已优化为ccu、或至少一个编码ser的密码子已优化为ucu，更优选其中至少一个编码leu的cug密码子已优化为cuu、或至少一个编码pro的ccc密码子已优化为ccu、或至少一个编码ser的uca密码子已优化为ucu，甚至更优选至少两个或至少三个或至少四个密码子已以这种方式优化。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：cho细胞、bhk 21细胞、hek293细胞、c127、a549、sp2/0、yb2/0、sf-9细胞、ns0细胞、vero细胞、per.c6、及它们的任何衍生物。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中用植物血凝素、睾酮c、β-雌二醇、亚精胺或胆固醇对所述细胞进行额外处理，优选其中用植物血凝素或亚精胺对所述细胞进行额外处理。

10.一种真核细胞，其中所述细胞经修饰以生产感兴趣的分泌型重组蛋白质，其中所述细胞人工地共表达与所述感兴趣的分泌型重组蛋白质不同的蛋白质，其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％同源性，或者其中共表达的蛋白质的氨基酸序列与根据seq id no:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

11.根据权利要求10所述的真核细胞，其中所述感兴趣的分泌型重组蛋白质为瞬时型、组成型和/或诱导型/条件型表达的。

12.根据权利要求10或11中任一项所述的真核细胞，其中所述细胞包括编码所述感兴趣的分泌型重组蛋白质的重组多核苷酸序列，优选其中所述细胞包括包含编码所述感兴趣的分泌型重组蛋白质的重组多核酸序列的非基因组重组多核苷酸序列、表达盒或载体。

13.根据权利要求12所述的真核细胞，其中所述编码所述感兴趣的分泌型重组蛋白质的重组多核苷酸序列包括在编码序列内的整合的富含cu的同义密码子。

14.根据权利要求12或13中任一项所述的真核细胞，其中所述重组多核苷酸序列为mrna序列。

15.根据权利要求10至14中任一项所述的真核细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：cho细胞、bhk 21细胞、hek293细胞、c127、sp2/0、yb2/0、sf-9细胞、ns0细胞、vero细胞、及它们的任何衍生物。

16.根据权利要求10至15中任一项所述的真核细胞，其中所述感兴趣的分泌型重组蛋白质适合于基于蛋白质的疗法，优选其中所述分泌型重组蛋白质选自由以下组成的组：抗体如治疗性抗体、或其抗原结合片段、或纳米抗体、或抗体-药物缀合物、或重组融合蛋白、或外泌体、或细胞因子如ifn-β、或激素如胰岛素、或激素类似物如gnrh类似物。

17.根据权利要求10至16中任一项所述的真核细胞在体外生产感兴趣的分泌型重组蛋白质的方法中的用途。

技术总结本发明涉及用于在细胞中生产感兴趣的分泌型重组蛋白质的方法，其中所述方法包括人工地共表达与所述感兴趣的分泌型重组蛋白质不同的蛋白质。技术研发人员：马库斯·兰德塔勒尔,乌尔丽克·辛纳尔,伊戈尔·米尼亚受保护的技术使用者：马克斯·德尔布吕克分子医学中心技术研发日：技术公布日：2024/6/18