一种通过特异性切刻酶Nt.BstNBI酶切PCR产物制备单链DNA的方法

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种通过特异性切刻酶nt.bstnbi酶切pcr产物制备单链dna的方法。

背景技术：

1、单链dna模板在用于单链dna适配子生成的selex组合化学过程以及许多其他分子生物学和生物技术应用中是必需的，这些应用包括传感器、dna芯片和微阵列、焦磷酸测序技术、使用单链构象多态技术(sscp)检测dna点突变、单核苷酸多态(snp)分析、固相dna测序等。单链dna模板还可用于体外诱变、核酸酶s1定位、探针制备和标记、差减杂交及其他多种分子技术。

2、大部分dna以双螺旋结构存在，但一经热或碱处理就会变为单链状态，单链dna在分子流体力学性质、吸收光谱、碱基反应性质等方面都和双链dna不同。由于所需单链dna的大小、规模和纯度不同，单链dna的生产变得非常昂贵或繁重。从双链dna(dsdna)中制备单链dna的方法包括变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶、t7逆转录法、不对称pcr、变性高效液相色谱法和链霉亲和素包裹的珠磁分离等。但由于现有制备单链dna的方法耗时较长，并且单链dna的产量很低、仪器和使用的包被磁珠较为昂贵，单链dna的制备受到限制，难以普及。另一方面虽然已开发的芯片技术为大规模合成单链dna提供了相对简单便捷的方法。但是，受到合成单链dna种类或实验条件等方面的限制，芯片技术也无法推广成为一种实验室常规方法。

3、基于以上方法存在的局限和单链dna广泛的应用，亟需一种在体外快速以简单、有效、便捷的方式获得单链dna的新型研究方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种通过特异性切刻酶nt.bstnbi酶切pcr产物制备单链dna的方法，可在常规实验室以简单、有效、便捷的方式获得单链dna。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种通过特异性切刻酶nt.bstnbi酶切pcr产物制备单链dna的方法，包含如下步骤：

4、(1)质粒dna的制备和提取：以序列i的dna序列为模板，设计合成一种长度为293nt的含有sma-f/r*引物结合序列和多段重复的nt.bstnbi特异性切刻酶酶切位点序列的特殊dna序列，将合成的dna序列装载至质粒；

5、所述序列i的dna序列如seq id no.1所示；

6、(2)聚合酶链式反应扩增目的基因片段：

7、利用sma-f/r*引物对，对步骤(1)所述质粒进行pcr反应，扩增序列i，得到pcr反应体系；

8、(3)特异性内切酶酶切获得dna单链：

9、对步骤(2)扩增得到的序列i的pcr反应体系进行nt.bstnbi特异性切刻酶酶切，得到ssdna。

10、进一步的，所述sma-f/r*引物对中一条引物的5’端具有生物素标记；

11、所述sma-f/r*引物对中，引物sma-r*的5’端具有生物素标记；

12、引物sma-f的dna序列如seq id no.2所示；引物sma-r*的dna序列如seq id no.3所示。

13、进一步的，步骤(2)所述聚合酶链式反应的反应体系为：

14、

15、进一步的，步骤(2)所述聚合酶链式反应的程序为：

16、

17、

18、进一步的，步骤(3)所述特异性内切酶酶切反应的反应体系为：

19、 50ul反应体系 终浓度 pcr产物 44ul nt.bstnbienzyme 1-5ul 1-20units 10×nebuffer 1-5ul 1×

20、进一步的，步骤(3)所述特异性内切酶酶切反应的程序为：pcr热循环仪中55℃酶切1-2h，80℃灭活20min终止反应。

21、进一步的，步骤(3)所述nt.bstnbi特异性切刻酶仅切割双链dna底物上的一条链，该切刻酶在识别序列后第4个碱基的3’端产生切刻位点，识别位点如下：

22、5’…gagtcnnnnn…3’

23、3’…ctcagnnnnn…5’。

24、本发明还提供了一种上述制备单链dna的方法得到的单链dna。

25、本发明还提供了一种上述单链dna在基于dna单链的分子生物学和生物技术上的应用。

26、本发明通过特异性切刻酶nt.bstnbi酶切pcr产物制备单链dna，其中，nt.bstnbi可特异性切刻酶识别pcr产物上的切刻位点并进行切割，形成许多短片段。短片段的tm值(17.2℃和29.7℃)均低于反应温度(55℃)，而从主链中脱落下来，生成生物素标记的ssdna。本发明可在常规实验室以简单、有效、便捷的方式获得单链dna，避免序列多样性，大大提高了单链dna的纯度和效率。

技术特征：

1.一种通过特异性切刻酶nt.bstnbi酶切pcr产物制备单链dna的方法，其特征在于，包含如下步骤：

2.根据权利要求1所述制备单链dna的方法，其特征在于，所述sma-f/r*引物对中一条引物的5’端具有生物素标记；

3.根据权利要求1所述制备单链dna的方法，其特征在于，步骤(2)所述聚合酶链式反应的反应体系为：

4.根据权利要求1所述制备单链dna的方法，其特征在于，步骤(2)所述聚合酶链式反应的程序为：

5.根据权利要求1所述制备单链dna的方法，其特征在于，步骤(3)所述特异性内切酶酶切反应的反应体系为：

6.根据权利要求1所述制备单链dna的方法，其特征在于，步骤(3)所述特异性内切酶酶切反应的程序为：pcr热循环仪中55℃酶切1-2h，80℃灭活20min终止反应。

7.根据权利要求1所述制备单链dna的方法，其特征在于，步骤(3)所述nt.bstnbi特异性切刻酶仅切割双链dna底物上的一条链，该切刻酶在识别序列后第4个碱基的3’端产生切刻位点，识别位点如下：

8.一种采取权利要求1～7任一项所述制备单链dna的方法得到的单链dna。

9.一种权利要求8所述单链dna在基于dna单链的分子生物学和生物技术上的应用。

技术总结本发明提供了一种通过特异性切刻酶Nt.BstNBI酶切PCR产物制备单链DNA的方法，属于分子生物学技术领域。本发明根据Nt.BstNBI特异性切刻酶的酶切位点设计多段重复的DNA序列，DNA序列的两端包含正反向引物的结合序列用于PCR扩增，其中一条引物的5’端进行生物素标记，用于后续的实验。Nt.BstNBI特异性切刻酶识别PCR产物上的切刻位点，将重复序列切刻成2个短片段，短片段的解链温度均低于反应温度，可以从主链中脱落下来，以此PCR产物生成生物素标记的ssDNA。本发明提供的单链DNA制备方法可在常规实验室以简单、有效、便捷的方式获得单链DNA，避免序列多样性，大大提高了纯度和效率。技术研发人员：张屹峰,田庆常,王淑玲,程慧娟,李红秀,徐新刚,徐男受保护的技术使用者：杭州师范大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13