一种高吸附容量的DEAE弱阴离子交换层析介质的制备方法

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法。

背景技术：

1、在迅速发展的生物技术领域中，离子交换层析介质的应用尤为广泛。研究表明，每个蛋白质生产过程中平均有三个层析步骤，分别为捕获、纯化、精制，其中纯化、精制过程中必用到一种离子交换介质。据marketsandmarketstm2018行业报告，离子交换介质销量占层析填料市场一半以上。

2、以带电配体为吸附位点分离纯化蛋白的方法被广泛用于生物分离领域。在离子交换介质中，带电配体与蛋白表面的带电区域形成静电相互作用力，从而在混合物中分离纯化目标蛋白。弱阴离子交换介质是离子交换介质中的一种，其配体在一般环境下带正电，用于吸附表面呈负电性的蛋白。弱阴离子交换介质在纯化过程中因易洗脱、能更好保留蛋白的生物活性而被广泛使用。

3、目前制备的deae弱阴离子交换介质普遍存在配体密度不高、静态吸附容量和动态载量较低等问题，从而导致后续蛋白分离时效率低、使用寿命短，不如cytiva的商品化介质deae ff介质。由于琼脂糖微球具有丰富的孔道结构，控制反应条件使活性物质进入微球孔道内发生反应，可大大拓展离子交换介质的吸附位点，对蛋白实现更好的吸附效果。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法。该方法是通过控制反应条件使deae溶液进入琼脂糖微球孔道内发生反应，在微球表面与内部同时形成吸附位点，提高吸附效果。首先对琼脂糖微球进行充分溶胀，微球表面由皱缩变为圆整，孔道变大，deae溶液充分进入微球内部，与内部的羟基发生取代反应，形成deae配体，同时产生氯化氢。通过滴加碱性溶液的方式，消耗反应生成的氯化氢，促进平衡正向移动，反应程度加快；滴加也可防止deae溶液直接与大量的碱性溶液发生副反应。通过上述对反应条件的改进，可大大增加deae弱阴离子介质吸附位点，对蛋白实现高吸附容量，从而提高介质的蛋白纯化能力。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、将一定量的琼脂糖微球分散于去离子水中，加入一定浓度的deae溶液，在30～70℃下充分溶胀一段时间，接着向混合溶液滴加一定浓度的碱性溶液(含nabh4)0.5～2h，并在30～70℃下充分搅拌反应，用大量水冲洗，并经酚酞溶液鉴定后得到deae弱阴离子交换层析介质。

4、进一步，所述琼脂糖微球为琼脂糖微球4b、6b、4ff、6ff中的一种，优选为琼脂糖微球4ff、6ff。

5、进一步，所述deae溶液浓度为0.5～4.5mol/l，优选为2.0～4.0mol/l。

6、进一步，所述琼脂糖微球与deae溶液体积比为1:(0.5～5)，优选为1:(1～4)。

7、进一步，所述琼脂糖微球溶胀时间为0.2～2h，优选为0.2～1.2h。

8、进一步，所述碱性溶液为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠溶液中的一种，优选为氢氧化钠和氢氧化钾。

9、进一步，所述碱性溶液浓度为0.5～5.0mol/l，优选为1.0～4.0mol/l。

10、进一步，所述滴加后的反应时间为1～6h，优选为2～5h。

11、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

12、(1)在制备过程中对琼脂糖微球进行充分溶胀，使微球表面与内部均充满deae，使得更多羟基与deae发生反应，同时滴入碱性溶液，促进反应正向进行，增加配体接入密度，高配体密度增加介质吸附位点，提高介质的蛋白载量，同时使多个配体与单个蛋白相结合，介质与蛋白间的结合能力增加。

13、(2)本发明方法操作简单，便于放大，以该法制备的弱阴离子交换层析介质配体密度、静态吸附容量和动态载量高，结构稳定且无毒无害，适用于生物大分子的分离纯化。

技术特征：

1.一种高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：所述琼脂糖微球为琼脂糖微球4b、6b、4ff、6ff中的一种。

3.根据权利要求1所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：所述琼脂糖微球为琼脂糖微球4ff、6ff中的一种。

4.根据权利要求2或3所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：所述deae溶液浓度为0.5～4.5mol/l。

5.根据权利要求4所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：所述琼脂糖微球与deae溶液体积比为1:(0.5～5)。

6.根据权利要求5所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：所述琼脂糖微球溶胀时间为0.2～2h。

7.根据权利要求1所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：碱性溶液中含nabh4。

8.根据权利要求1所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：碱性溶液为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠溶液中的一种。

9.根据权利要求6所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：所述碱性溶液浓度为0.5～5.0mol/l。

10.根据权利要求9所述的高吸附容量的deae弱阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于：所述滴加后的反应时间为1～6h。

技术总结本发明公开了一种高吸附容量的DEAE弱阴离子交换层析介质的制备方法。本发明包括如下步骤：将一定量的琼脂糖微球分散于去离子水中，加入一定浓度的DEAE溶液，在30～70℃下充分溶胀一段时间，接着向混合溶液滴加一定浓度的碱性溶液0.5～2h，并在30～70℃下充分搅拌反应，用大量水冲洗，并经酚酞溶液鉴定后得到DEAE弱阴离子交换层析介质。本发明以该法制备的弱阴离子交换层析介质配体密度、静态吸附容量和动态载量高，结构稳定且无毒无害，适用于生物大分子的分离纯化。技术研发人员：徐偲,曾泽阳,王晓钟,戴立言,陈英奇受保护的技术使用者：浙江大学衢州研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/13