一种凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法

本发明涉及囊泡制备方法领域，具体涉及一种凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法。

背景技术：

1、间充质干细胞广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，也可从胎儿脐血中分离得到，此外还存在于胎盘，羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中。间充质干细胞具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能，间充质干细胞不仅能够向多种组织和细胞分化，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景相当稳定。

2、细胞凋亡(apoptosis)是程序性细胞死亡中一种主要方式，在组织和器官稳态维持中起到重要作用。在凋亡过程中，细胞将发生皱缩、染色质凝集、细胞膜胀大膨出，最终产生一类包裹细胞内容物的双层脂质结构，即凋亡囊泡(apoptotic vesicles,apovs)。apovs富含许多与细胞行为和各种疾病的代谢、运输和调节有关的功能蛋白质。在分子鉴定方面，apovs携带evs一般标志物cd9,cd63,cd81和凋亡特异标志物c1q、ps、fas等

3、人类机体每日有超过上百亿细胞发生凋亡，所产生的大量apovs在维持组织和器官稳态具有重要作用。在免疫调控方面，研究表明apovs通过辅助抗原呈递进行免疫调控，例如，树突状细胞衍生的apovs携带主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex mhc)来激活cd4+t细胞。另一方面，正常细胞衍生的apovs利用fas配体通过fas途径诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤发展。在组织稳态维持方面，肝切除术诱导的apovs可刺激中性粒细胞采用非炎症的再生表型，有助于肝脏再生。

4、目前已建立的凋亡囊泡的制备方法有贴壁细胞及悬浮细胞的制备方式。但是，现有技术基于正常培养的细胞及组织进行凋亡囊泡的制备，制备的干细胞凋亡囊泡免疫调控能力低，阻碍了凋亡囊泡的应用范围及效果。

技术实现思路

1、为开发一种提高干细胞免疫调控能力的干细胞凋亡囊泡的制备方法，本发明提供了一种凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，本发明通过诱导产生凝聚态干细胞再提取囊泡，从而提高了干细胞凋亡囊泡的免疫调控能力。

2、本发明提供了一种凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，

3、包括如下步骤：

4、选取培养获得的p3-p10代间充质干细胞，待细胞培养至融合度达到70-85％时，加入凝集态干细胞诱导液培养，培养10-15天形成凝集态干细胞；

5、凝集态干细胞加入浓度为500-700nm的星胞菌素诱导液诱导18-26h，诱导完成后依次于600-1000g第一次离心、1500-2500g第二次离心和14000-18000g第三次离心获得凝集态干细胞凋亡囊泡；

6、所述凝集态干细胞诱导液为8-12％fbs的a-mem培养液含vc 30-70μm。

7、进一步地，所述凝集态干细胞诱导液为10％fbs的a-mem培养液含vc 50um。

8、进一步地，第一次离心、第二次离心和第三次离心的具体过程为：收集诱导后的细胞悬液于600-1000g第一次离心10-15分钟后收集上清，收集的上清进行1500-2500g第二次离心5-10min后，收集沉淀，收集的沉淀进行重悬后，于14000-18000g第三次离心10-15min，收集沉淀，即为凝集态干细胞凋亡囊泡。

9、进一步地，第一次离心、第二次离心和第三次离心参数分别为：800g离心10分钟、16000g离心5min、16000g离心10min。

10、进一步地，加入星胞菌素诱导液诱导培养条件为5％二氧化碳，37℃培养24h。

11、进一步地，所述星胞菌素浓度为600nm。

12、本发明还提供了所述的制备方法制备得到的凝集态干细胞凋亡囊泡。

13、进一步地，所述凝集态干细胞凋亡囊泡中th1、th2和treg细胞的比例增加。

14、进一步地，所述凝集态干细胞凋亡囊泡免疫调控能力增加。

15、本发明还提供了所述的凝集态干细胞凋亡囊泡在制备提高免疫力产品中的应用，所述产品为药物或保健品。

16、进一步地，所述药物由有效成分凝集态干细胞凋亡囊泡和其他药物辅料制成。

17、进一步地，所述药物辅料为溶剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂、矫味剂、着色剂、助悬剂、乳化剂、润湿剂、发泡剂、消泡剂、填充剂、吸收剂、稀释剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、包衣材料、增塑剂、啡调节剂、抗氧剂、渗透压调节剂、整合剂、渗透促进剂、增稠剂、保湿剂、抛射剂和缓控释材料中任意一种或几种的组合。

18、进一步地，所述保健品为含有凝集态干细胞凋亡囊泡的干细胞胶囊。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

20、1、一种可提高干细胞凋亡囊泡免疫调控的制备方法，所述干细胞凋亡囊泡具有抗炎，免疫调控能力。本发明所公开可提高干细胞凋亡囊泡免疫调控提取制备方法，包括间充质干细胞培养，凝集态干细胞诱导，干细胞凋亡囊泡的诱导，收集及制备等过程。

21、2、本发明通过诱导产生凝聚态干细胞再提取囊泡，从而提高了干细胞凋亡囊泡的免疫调控能力；

22、可用于免疫性疾病，皮肤再生等疾病的治疗。

技术特征：

1.一种凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，所述凝集态干细胞诱导液为10％fbs的a-mem培养液含vc 50μm。

3.根据权利要求1所述的凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，第一次离心、第二次离心和第三次离心的具体过程为：收集诱导凋亡后的细胞悬液于600-1000g第一次离心10-15分钟后收集上清，收集的上清于1500-2500g第二次离心5-10min后，收集沉淀，收集的沉淀进行重悬后，于14000-18000g第三次离心10-15min，收集沉淀，即为凝集态干细胞凋亡囊泡。

4.根据权利要求3所述的凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，第一次离心、第二次离心和第三次离心参数分别为：800g离心10分钟、16000g离心5min、16000g离心10min。

5.根据权利要求1所述的凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，加入星胞菌素诱导培养条件为5％二氧化碳，37℃培养24h。

6.根据权利要求1所述的凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，其特征在于，所述星胞菌素浓度为600nm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的凝集态干细胞凋亡囊泡。

8.根据权利要求7所述的凝集态干细胞凋亡囊泡，其特征在于，所述凝集态干细胞凋亡囊泡中th1、th2和treg细胞的比例增加。

9.根据权利要求8所述的凝集态干细胞凋亡囊泡，其特征在于，所述凝集态干细胞凋亡囊泡免疫调控能力增加。

10.一种权利要求7所述的凝集态干细胞凋亡囊泡在制备提高免疫力产品中的应用。

技术总结本发明涉及囊泡制备方法领域，具体公开了一种凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法，选取培养获得的P3‑P10代间充质干细胞，待细胞培养至融合度达到70‑85％时，加入凝集态干细胞诱导液培养，培养10‑15天形成凝集态干细胞；凝集态干细胞加入浓度为500‑700nM的星胞菌素诱导18‑26h，诱导完成后依次于600‑1000g第一次离心、1500‑2500g第二次离心和14000‑18000g第三次离心条件下分步离心获得凝集态干细胞凋亡囊泡；所述凝集态干细胞诱导液为8‑12％FBS的a‑MEM培养液含VC 30‑70μM。本发明制备得到的凝集态干细胞凋亡囊泡免疫调控能力增加。技术研发人员：胡成虎,刘彩晓,王巧宁受保护的技术使用者：西北工业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13