一种基于ARMS-PCR法检测遗传性易栓症常见突变位点的引物探针组合及试剂盒

本发明属于生物检测鉴定，尤其涉及一种基于arms-pcr法检测遗传性易栓症常见突变位点的引物探针组合及试剂盒。

背景技术：

1、易栓症(thrombophilia)是指因各种遗传性或获得性因素导致容易血栓形成和血栓栓塞的病理状态。主要临床表现为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，vte)。静脉血栓栓塞症是一种严重威胁生命的疾病。临床包括深静脉血栓(deep venousthrombosis，dvt)和肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism，pte)。近年来，vte的发病率仍然呈现显著上升趋势，有报道显示，全球每年有超过1000万人发生vte。我国vte发病率也有逐年增高的趋势。基于我国60家大型医院的调查研究显示，36.6％的内科住院患者为vte高风险人群；54.3％的外科住院患者为高风险人群。我国现有报道中dvt发生率均在20％以上，膝关节置换术后dvt发生率更高达58.2％。易栓症导致的血栓事件反复发作显著增加了患者的致残率和致死率，严重危害人类健康。

2、易栓症可分为遗传性和获得性。多篇研究指出，个体对vte易感性的差异约60％归结于遗传因素。对血栓性疾病患者或高危人群进行基因检测，使得人群中易栓症异常基因携带者、家族性易栓症患者，能够对血栓事件的发生做好预防工作，从而降低血栓性疾病的发病率；同时通过基因检测可为血栓患者的规范化和标准化抗凝治疗提供依据，从而实现个性化精准治疗。

3、目前，基因突变的检测方法很多，包括一代测序法、二代测序法、毛细管电泳法、高分辨率溶解曲线法、数字pcr、扩增阻滞突变法(arms法)等。其中一代测序法通量低，测序成本高。二代测序法操作繁琐，周期长，检测费用相对较高。毛细管电泳法仅适用于插入缺失突变。高分辨率溶解曲线法特异性不够高，无法给出具体的变异位点及类型，设计难度较高。数字pcr法成本较高，普及性还不够高。扩增阻滞突变法(arms法)是用taqdna聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，pcr引物的3'端末位碱基必须与其模板dna互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因。该方法特异性高，操作简单快速，可在2-3小时内完成。成本也较低，适用于医院广泛开展。

4、国内外已相继研发了一些针对血栓相关基因检测的试剂盒。derek klarin等人于2021年4月公布了一种静脉血栓栓塞症突变位点的检测试剂盒及检测方法。该试剂盒纳入了297个snp位点，建立了静脉血栓栓塞症风险预测方法。但该模型及其技术方案的构成未考虑中国人群或亚洲黄种人静脉血栓栓塞症遗传风险相关基因位点信息，对中国人群静脉血栓栓塞症风险的预测能力有限。孟涛等人于2022年公布的一组用于中国人群静脉血栓栓塞症遗传风险预测的生物标志物、试剂盒及其应用，其中纳入了60个snp位点包含了抗凝、凝血、纤溶、代谢、血小板、炎症与其它等6个机制类别。但操作较复杂，实验周期较久，评分系统临床实施起来有一定困难。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于arms-pcr法2-3小时内快速筛查静脉血栓栓塞常见突变位点的引物探针组合及制备的试剂盒。本发明中的引物探针组合序列如seq id no.1～seq id no.34所示，可检测proc、pros1、f5、thbd、serpinc1五种基因的11个常见突变位点，且使用该引物探针组合制成的试剂盒操作简便，可在医院及检测中心广泛开展，并可在2-3小时内快速出具报告，所针对的11个突变位点可直接用于遗传性易栓症的诊断，也可以作为临床各类血栓风险评分的补充。本发明中的方法明显优于二代测序法、多态性位点或者风险预测法等其他方案，因此可更好的适用于临床。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明提供了一种基于arms-pcr法检测遗传性易栓症常见突变位点的引物探针组合，所述突变位点为proc、pros1、f5、thbd、serpinc1五种基因的11个常见突变位点，所述11个常见突变位点及其对应使用的引物探针序列分别为：

4、(1)proc:nm_000312:exon7:c.c565t:p.r189w，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.1～seq id no.3所示；

5、(2)f5:nm_000130:exon7:c.a1000g:p.r334g，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.4～seq id no.6所示；

6、(3)pros1:nm_000313:exon14:c.t1680a:p.y560x，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.7～seq id no.9所示；

7、(4)proc:nm_000312:exon7:c.572_574del:p.k193del，用于检测该突变位点的引物探针序列分别如seq id no.10和seq id no.2～seq id no.3所示；

8、(5)mthfr:nm_005957:exon5:c.c665t:p.a222v，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.11～seq id no.13所示；

9、(6)thbd:nm_000361:c.-151g>t，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq idno.14～seq id no.16所示；

10、(7)proc:nm_000312:exon7:c.t541g:p.f181v，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.17～seq id no.19所示；

11、(8)serpinc1:nm_000488:exon5:c.t938c:p.m313t，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.20～seq id no.22所示；

12、(9)pros1:nm_000313:exon10:c.c1063t:p.r355c，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.23～seq id no.25所示；

13、(10)proc:nm_000312:exon9:c.g889c:p.d297h，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.26～seq id no.28所示；

14、(11)proc:nm_000312:exon9:c.g1218a:p.m406i，用于检测该突变位点的引物探针序列如seq id no.29～seq id no.31所示。

15、进一步的，所述引物探针组合还包括内参基因引物探针组，所述内参基因为rnp，用于检测该内参基因的引物探针序列如seq id no.32～seq id no.34所示。

16、更进一步的，所述引物探针组合中在探针的5’末端连接有荧光报告基团，3’末端连接有荧光淬灭基团。

17、再进一步的，所述序列如seq id no.3、seq id no.19、seq id no.28、seq idno.31以及seq id no.34所示的探针在5＇端标记有荧光报告基团fam，所述序列如seq idno.6、seq id no.13以及seq id no.22所示的探针在5＇端标记有荧光报告基团cy3，所述序列如seq id no.9、seq id no.16以及seq id no.25所示的探针在5＇端标记有荧光报告基团cy5；所有探针在3＇端都标记有荧光淬灭基团mgb。

18、本发明还提供了一种所述引物探针组合在制备检测遗传性易栓症基因突变产品中的应用。

19、本发明还提供了一种用于检测遗传性易栓症常见基因突变位点的试剂盒，其中包含所述引物探针组合。

20、进一步的，所述试剂盒中共设置6管引物探针mix，其中：mix1中含有用于检测突变位点(1)～(3)的引物探针；mix2中含有用于检测突变位点(4)～(6)的引物探针；mix3中含有用于检测突变位点(7)～(9)的引物探针；mix4中含有用于检测突变位点(10)的引物探针；mix5中含有用于检测突变位点(11)的引物探针；mix6中含有用于检测内参的引物探针。

21、本发明还提供了一种基于arms-pcr法、使用所述试剂盒检测遗传性易栓症常见突变位点的方法。

22、进一步的，所述方法中，所述试剂盒中每管均以dna为模板，加入相应的mix进行荧光定量pcr，使用12.5ul反应体系进行arms-pcr扩增：2*pcr mix(probe qpcrmaster mix，promega，a6102)6.25ul，引物探针mix 3.75ul，dna2.5 ul，引物终浓度300um，探针终浓度200um。

23、更进一步的，所述arms-pcr扩增反应的反应条件为95℃5min；95℃25s，64℃20s，72℃20s，10个循环，不采集荧光；93℃25s，60℃35s，30个循环，采集荧光；72℃，20s。

24、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

25、现有突变位点检测方法包括一代测序法、二代测序法、毛细管电泳法、高分辨率溶解曲线法、数字pcr、扩增阻滞突变法(arms法)等。针对静脉血栓多态性位点或风险预测的专利多采用二代测序法，但该方法流程复杂，对操作要求高，周期也较长，通常7-10天才能出结果。而且多态性位点或者风险预测并不能用于疾病的临床诊断。本发明所用的试剂盒操作简便，可在医院及检测中心广泛开展，并可在2-3小时内快速出具报告，所针对的11个突变位点可直接用于遗传性易栓症的诊断，也可以作为临床各类血栓风险评分的补充，明显优于其他方案，可以更好的适用于临床。