一种梅花无菌体系的毛状根诱导方法

本发明属于植物培养，具体地说，涉及一种梅花无菌体系的毛状根诱导方法。

背景技术：

1、梅花(prunus mume)属蔷薇科(rosaceae)李属(prunus)落叶乔木，是我国传统十大名花之首，距今已有3000多年栽培历史，是重要的早春木本观赏花卉，具有极高的观赏价值，经济价值和文化象征。为使梅花在我国种植范围更广泛，栽培应用更加国际化，促进品种选育与优质性状改良具有重要的意义。常规传统的育种方法，如芽变育种、引种驯化等具有一定的局限性，周期长，人力、物力消耗大，受自然条件限制且目标性状可预知性较低。植物基因工程技术可以克服传统育种的局限性，利用外源基因对其进行定向改良，实现梅花定向育种，创新梅花种质资源。但目前研究多集中于梅花高效稳定的再生体系建立，尚未报道梅花本体遗传转化体系构建。通过发根农杆菌介导的毛状根转化技术可以快速获得梅花转基因根系，可用于梅花根系发育、次生代谢、抗逆机制等研究。

2、在植物基因工程中，农杆菌介导法是一种成熟且应用广泛的外源基因导入法。尽管根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)是基因工程的优选工程菌株，但发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)介导的植物毛状根转化也具有诸多的优势。例如，分化的毛状根生长迅速、来源于同一细胞、遗传转化方便、分化率高、倍性稳定等特点。发根农杆菌属于根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌的一种，具有广泛的侵染性，侵染宿主后通过ri质粒的t-dna将rol基因稳定的整合到宿主植物基因组中，诱导植物产生大量不定根，形成具有转基因毛状根和非转基因地上部分的嵌合植株；同时也可将ti质粒中携带的外源基因整合到植物基因组中，是研究植物特异性表达基因、解析调控基因功能的良好材料。

3、已知t-dna整合具有随机性，因此需要通过高效的筛选方法对阳性毛状根进行鉴定。ruby(红宝石色)是一种裸眼可视的报告基因系统，已成功应用于水稻和拟南芥的阳性筛选。该系统将3个甜菜色素生物合成基因(cyp76ad1、doda和gt)偶联到1个开放阅读框，组成报告系统ruby，可以将酪氨酸转化为红色的甜菜色素。这种报告基因系统可以通过裸眼高效筛选阳性转化组织和器官，因而在木本植物遗传转化方面具有巨大的应用潜力，可实现在梅花阳性毛状根系得形态学标记筛选。

4、由于木本植物多年生且高度杂合，其基于根癌农杆菌介导的稳定遗传转化体系构建困难，但发根农杆菌介导植物毛状根转化具有重要的应用价值。目前尚未见组培技术下利用发根农杆菌诱导培养梅花毛状根，以获得组织嵌合体的相关报道。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种基于ruby报告基因作为筛选标记的梅花无菌体系的毛状根诱导方法，以期建立发根农杆菌介导的梅花转化体系，为今后开展梅花特定基因功能的鉴定和梅花的遗传改良奠定基础。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种无菌体系的梅花毛状根诱导方法，利用含有ruby报告基因的发根农杆菌k599侵染梅花外植体，诱导外植体生成毛状根；

3、其中，所述外植体为无菌组培苗和基质苗叶片、茎段和叶柄。

4、进一步地，所述含有ruby报告基因的发根农杆菌k599是由含有ruby报告基因的质粒转化发根农杆菌k599感受态细胞获得的，所述ruby报告基因优选由35s启动子驱动。

5、进一步地，无菌组培苗的制备方法包括：

6、(1)将梅花果实去除果肉，清洗晾干后得到的种子放于无菌水中浸泡，然后将种子经机械处理去除果核得到的果仁浸泡于无菌水中过夜；选取浸泡后干燥饱满的果仁，流水冲洗30min，后转移至无菌组培台内，先用2％ naclo浸泡15min，再用75％酒精消毒30s，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌手术刀剥出梅花种子胚并附带1/4子叶，胚芽向下置于胚诱导培养基中，于24℃，光照16h/黑暗8h的人工气候室中培养至其发芽，获得梅花无菌组培苗；

7、(2)切除组培苗初生根，保留根上部分作为外植体材料，或者，取组培苗茎部、根部切段作为外植体材料；外植体置于ms预培养基中，24℃黑暗条件下预培养2～3d后用于侵染；

8、其中，所述胚诱导培养基为：4.43g/l ql培养基粉剂+30g/l蔗糖+0.5mg/l6-ba+1.0mg/l tdz+7g/l琼脂，ph 5.8-6.0；其中，ql(quoirin&lepoivre)培养基粉剂适用于李属(prunus)植物组织再生，购自北京酷来搏科技有限公司；tdz为苯基噻二唑脲激素。

9、所述ms预培养基为：4.43g/l ms培养基粉剂+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.8-6.0。

10、进一步地，基质苗叶片、茎段和叶柄的制备方法包括：

11、(1)将梅花果实去除果肉，清洗晾干后得到的种子置于4℃冷库沙藏，定期翻检喷水以防种子发霉，直至露白，露白种子播种于基质穴盘，20～30d后获得梅花基质苗；

12、(2)取基质苗带有叶柄的叶片、幼嫩茎部切段作为外植体材料；外植体材料经消毒晾干，并于ms预培养基中，24℃黑暗条件下预培养2～3d后用于侵染；

13、其中，所述基质由草炭、珍珠岩按2:1体积比混合而成；

14、所述ms预培养基为：4.43g/l ms培养基粉剂+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph 5.8-6.0。

15、前述的方法，步骤(2)中外植体材料消毒的方法包括：用75％酒精消毒30s，再用5％ naclo消毒15min，最后用无菌水清洗6～8次。

16、进一步地，将含有ruby报告基因的发根农杆菌k599在lb选择培养基中培养，离心收集菌体，然后用ms重悬液重悬菌体至od600＝0.6～1.0(优选0.6)，作为用于侵染梅花外植体的侵染液；

17、其中，所述lb选择培养基为：10g/l胰蛋白胨+5g/l酵母提取物+10g/l氯化钠+15g/l琼脂，壮观霉素的含量为75mg/l，链霉素的含量为50mg/l；

18、所述ms重悬液为：4.43g/l ms培养基粉剂+30g/l蔗糖+200μm as，ph 5.8-6.0。

19、进一步地，将梅花外植体于侵染液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干，然后置于ms共培养基中进行共培养，24℃黑暗培养2～3d；

20、其中，所述ms共培养基为：4.43g/l ms培养基粉剂+30g/l蔗糖+7g/l琼脂+200μmas，ph 5.8-6.0。

21、进一步地，将共培养后的外植体转移至ms生根培养基中，24℃光照培养20～30d，每7d继代培养一次，至外植体伤口部位生出愈伤组织并分化出毛状根，进行pcr检测，鉴定为阳性后，切除主根仅保留毛状根，然后播种于育苗盘中进行基质培养；

22、其中，所述ms生根培养基为：4.43g/l ms培养基粉剂+30g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.05mg/l naa+0.5mg/l 6-ba；所述ms生根培养基中壮观霉素的含量为7.5mg/l，头孢霉素的含量为200mg/l，ph 5.8-6.0；

23、优选地，pcr检测所用引物为：

24、35s:ruby-f:5’-cgacactctcgtctactccaa-3’；

25、35s:ruby-r:5’-gcggtaatcttgcggaagtt-3’。

26、本发明中，梅花品种优选真梅系‘早绿萼’。

27、第二方面，本发明提供按照所述方法制备的梅花毛状根在梅花基因功能研究和梅花遗传改良育种中的应用。

28、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

29、(一)本发明首次在组培条件下，利用发根农杆菌k599诱导梅花毛状根的形成。现有技术中，李属植物组培体系不成熟，且梅花愈伤组织培养困难，培养时间长。目前，梅花农杆菌遗传转化体系尚未见报道，这也是目前迫切需要解决的问题，毛状根是利用发根农杆菌侵染植物细胞后产生的特殊的植物突变组织，具有生长速度较快、激素自养、转化稳定以及次生代谢强等优点。毛状根作为一种转基因器官，后续外源基因导入的功能验证可以通过诱导梅花毛状根探究。

30、(二)本发明通过发根农杆菌介导，筛选了转化梅花毛状根的外植体类型、生长环境、侵染方法、侵染浓度等，最终得出用od600＝0.6的菌液，浸没法侵染无菌组培苗、基质苗茎段和叶柄，诱导毛状根效率最高；该体系建立加速了梅花分子生物学的研究进程，也为后续利用毛状根诱导完整转化植株提供材料。

31、(三)本发明以带有甜菜红素生物合成基因ruby为报告系统，获得裸眼可视的梅花红色毛状根和红色愈伤组织，从而判断转化是否成功，可作为无损筛选系统应用于植物遗传转化过程。