鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记、其开发方法及应用

本发明涉及一种鉴定菊花光反应周期长短的kasp标记、其开发方法及应用，属于植物分子标记辅助育种领域。

背景技术：

1、观赏植物的开花期是构成其观赏价值的重要性状之一，开花时间会直接影响其在市场上的价格。菊花(chrysanthemum morifolium ramat)是典型的短日照植物，花期较单一，多集中于秋季，限制了菊花的商业发展。在生产中，需要通过人工补光或者遮光来调控菊花开花，极大增加了生产成本。光反应周期是指植株感受到短日照刺激至达到初花期所需要的天数，不同品种对光周期的敏感度存在着明显差异。光反应周期过长的品种会增加生产和管理成本，而光反应周期敏感品种的生育期较短，有助于控制生产成本，还可以提高种植茬数，从而达到节本增效的目的。因此，培育短光反应周期品种是菊花育种工作的重要目标之一。

2、菊花是一种高度杂合的多倍体植物，且自交不亲和。因此，传统杂交育种和诱变育种仍是培育现代菊花品种的有力手段。但是传统育种依赖育种家的经验将亲本的有利基因进行随机组合，效率较低。随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)育种已成为育种的重要手段，可以针对个别性状进行精确改良，效率较高。目前研究大多是针对菊花自然花期(即定植到各个开花时期的天数)，而光反应周期研究较少。袁储聪等(2023)发现菊花光反应周期呈现连续性变化的正态分布，说明光反应周期可能属于多基因控制的数量性状。植株从感受到短日照刺激后，直到初开才能判断品种的光反应周期特性，耗时长。因此亟需建立菊花光反应周期的mas育种体系，实现短生育期优良品种的早期选择。

3、菊花mas研究目前处于初步阶段。su等(2019)总结了近年来基于分子标记的菊花花序、株型、花期及抗逆等性状的遗传研究进展。但前期研究主要基于srap、aflp、rapd和ssr等传统分子标记，数量有限且难以高通量分型，严重影响了定位精度与效率。与传统分子标记相比，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)和小片段插入缺失(insertion and deletion，indel)标记具有分布广、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，更容易实现高通量和自动化检测。但是对于菊花(～8.5gb)等基因组庞大的物种来说，snp和indel测序成本高，难以实现大规模群体基因分型。kasp分型技术，即竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr)，是一种新的snp和indel自动化检测方法。kasp标记能够在更大规模个体的基因组dna样本中准确地判断特定位点的snp和indel，且耗时短、成本低，应用前景广阔。bsa-seq是将二代测序技术(next-generationsequencing，ngs)与集群分离分析法(bulked segregant analysis，bsa)结合的一种快速定位与目标性状相关联的基因或位点方法(汪泽民等，2023)。近年来，bsa-seq和kasp分型联合分析策略已经广泛应用于大豆、甜瓜、甘蔗和小麦等经济作物的产量、抗逆等农艺性状的基因精细定位和分子标记辅助育种(wu et al.,2023)。然而，目前在菊花光反应周期的研究中尚未见报道。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种鉴定菊花光反应周期长短的kasp标记。本发明的第二目的是提供上述kasp标记的开发方法及应用。

2、技术方案：本发明提供了一种鉴定菊花光反应周期长短的kasp标记，所述kasp标记包括如下的一种或两种：

3、位于菊花9号染色体上第205233550位的snp变异位点，该位点由t突变为a命名为kasp-chr9_205233550-t/a；位于菊花10号染色体上第20239079位的snp变异位点，该位点由a突变为g，命名为kasp-chr10_20239079-a/g。

4、本发明还提供了一种基于bsa-seq技术开发上述的鉴定菊花光反应周期长短的kasp标记的方法，(1)以光反应周期长短相差至少14天的两个切花菊品种为亲本，进行杂交获得f1分离群体，对其进行光反应周期表型鉴定；按照生产标准，植株达到20～25cm高时开始进行补光；所述光反应周期为从停止补光到花朵初开期的天数，初开期为40％～50％的花序呈半开放状态的时期；

5、(2)从f1子代中筛选多个短光反应周期极端株系及长光反应周期极端株系，提取亲本和所有极端株系的dna，构建子代极端混池早花池和晚花池，对亲本及两个混池进行全基因组重测序；

6、(3)将测序数据质控后得到的clean reads比对到菊花参考基因组上，进行变异检测，并根据变异位点质量和样本基因型进行过滤；；

7、(4)利用|δ(snp/indel-index)|和欧式距离ed两种算法对步骤(3)过滤后得到的变异位点进行bsa-seq分析，获得菊花光反应周期显著关联位点；

8、(5)采用滑窗的方法对|δ(snp/indel-index)|及ed2进行拟合，取窗口内的平均值作为拟合后的值，按照窗口拟合值从大到小对窗口排序，以top 0.5％处的拟合值作为关联阈值筛选显著窗口，将两种算法获得的显著窗口取交集。

9、(6)选取步骤(5)中获得的交集窗口中|δ(snp/indel-index)|>0.8的变异位点，利用“bedtools getfasta”程序提取每个位点上下200bp序列，筛选符合标准的序列作为适宜开发kasp标记的菊花光反应周期关联位点；

10、(7)根据步骤(6)中筛选到的变异位点设计相应的kasp扩增引物，在该开发群体中进行pcr扩增；

11、(8)针对步骤(7)中开发的kasp标记中分型清晰、阴性对照样本无特异性扩增的kasp标记进行准确率计算，在不考虑杂合位点情况下，将准确率>80％的kasp标记在自然群体中进行验证；当kasp标记在自然群体中的准确率达到80％，则可确定该kasp标记可用于早期鉴定菊花光反应周期长短。

12、其中，步骤(1)中所述的母本为长光反应周期菊花品种‘南农庐火’，父本为短光反应周期菊花品种‘迷你黄’。

13、其中，步骤(1)中所述补光天数为40～50d。

14、其中，步骤(2)中所述用于构建每个极端混池的株系数目为f1子代中该群体大小的10％～20％。

15、其中，步骤(3)中所述的菊花参考基因组为‘钟山紫桂’。

16、其中，步骤(3)的具体步骤包括：对亲本和两个极端混池的原始测序数据去掉接头和低质量序列，获得有效测序数据，使用bwa软件比对到菊花参考基因组上，对结果进行质控，再使用gatk软件检测变异位点，过滤掉低质量变异结果用于下一步分析。

17、其中，snps和indels变异位点的过滤条件分别为“qd<2.0||fs>60.0||mq<40.0||mqranksum<-12.5||readposranksum<-8.0”和“qd<2.0||fs>200.0||sor>10.0||mqranksum<-12.5||readposranksum<-8.0”。

18、其中，步骤(4)中筛选用于bsa-seq分析的标记，过滤标准是：1)亲本分离形式符合f1群体，即nn×np、lm×ll、hk×hk；2)亲本和子代混池的基因型无缺失；3)去除亲本与子代相反表型的纯合相同位点；4)四个样本的测序深度要大于10×且小于500×；5)至少有一个子代池的snp/indel-index大于0.3；6)至少有一个子代池的snp/indel-index小于0.7。

19、其中，步骤(5)中滑窗时使用的窗口大小为500kb，步长大小为50kb，窗口内的snp数目大于等于20时，该窗口为有效窗口，snp数目不足时，该窗口的结果并入下一个窗口。

20、其中，步骤(6)中适合开发kasp标记的变异位点筛选标准是：1)上下游200bp序列中除目标snp或indel位点外，其它变异位点数目不超过5个；2)该片段在菊花基因组中的相似序列个数不超过3个，即blast比对分析时同时满足序列比对一致性百分比identity>83％和覆盖率coverage>80％时得到的序列个数越少越好。

21、其中，步骤(7)中所述引物包含两条竞争性前引物和一条通用后引物，前引物3’末端碱基为snp或indel位点等位变异碱基，前引物5’端分别加上fam和vic荧光序列标签。

22、其中，步骤(7)中kasp-pcr扩增体系为：2×kasp mastermix 0.8μl、primermix0.024μl(前引物f1浓度12μm、前引物f2浓度12μm、通用后引物浓度30μm)、ddh2o0.776μl。其中至少设置一个无dna模板的阴性对照(ntc)。

23、其中，步骤(7)中kasp-pcr扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，55～65℃退火延伸60s，每个循环退火延伸温度降低1.0℃，共计10个循环；95℃变性20s，55℃退火延伸60s，20个循环。

24、本发明还公开了一种上述的kasp标记在鉴定菊花光反应周期长短中的应用，其特征在于，对于标记kasp-chr9_205233550-t/a，若检测基因型为t:t，则为光反应周期短；若检测基因型为a:a，则为光反应周期长；若检测基因型为杂合a:t，则光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；对于标记kasp-chr10_20239079-a/g，若检测基因型为a:a，则为光反应周期短；若检测基因型为g:g或g:a，则光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；当kasp-chr9_205233550-t/a和kasp-chr10_20239079-a/g标记结合判断菊花品种光反应周期长短时，若检测基因型为t:t-a:a，则光反应周期短；若检测基因型为a:a-g:g或a:a-g:a或a:t-g:g或a:t-g:a，则光反应周期长；若为其它基因型可结合田间观察进一步确认。

25、本发明还公开了一种早期鉴定菊花光反应周期的方法，包括以下步骤：

26、(1)在苗期提取待测样品的dna，作为扩增模板；

27、(2)对上述的kasp标记进行pcr扩增和基因分型，当检测kasp标记为kasp-chr9_205233550-t/a时，若检测基因型为t:t，则光反应周期短，若为a:a，则光反应周期长，若为a:t，则光反应周期大概率长，需结合田间表型进一步确定；当检测kasp标记为kasp-chr10_20239079-a/g时，若检测基因型为a:a，则光反应周期短；若检测基因型为g:g或g:a，光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；当检测kasp标记为kasp-chr9_205233550-t/a和kasp-chr10_20239079-a/g时，若检测基因型为t:t-a:a，则光反应周期短；若检测基因型为a:a-g:g或a:a-g:a或a:t-g:g或a:t-g:a，则光反应周期长；若为其它基因型可结合田间观察进一步确认。

28、其中，步骤(2)中用于扩增kasp标记kasp-chr9_205233550-t/a的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no:1～2所示的两条竞争性前引物、和核苷酸序列如seq id no:3所示的通用后引物；用于扩增kasp标记kasp-chr10_20239079-a/g的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no:4～5所示的两条竞争性前引物和核苷酸序列如seq id no:6所示的通用后引物。

29、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明通过基于全基因重测序的bsa-seq技术快速定位到与光反应周期相关的变异位点，将筛选到的snp关联位点转化成kasp标记，相较于传统基于普通pcr扩增的分子标记，kasp标记不需要用到凝胶电泳，可以实现快速、高通量及平台化检测；本发明开发的snp位点chr9_205233550和chr10_20239079，可单独或组合使用，该标记组鉴定菊花品种光反应周期长短的准确率能达到82.67％。不需要通过漫长的田间表型调查，就可以实现菊花光反应周期的早期鉴定，即避免了人工主观判断带来的误差及人力物力的浪费，又大大地提高了选择效率。本发明的鉴定方法，可在菊花生长早期快速、准确地对光反应周期进行判断，有利于亲本的选配及后代优异株系的筛选，为菊花光反应周期mas育种体系的建立奠定了基础，对菊花光反应周期研究及其周年生产具有重要意义。