检测球形孢子丝菌抗体的重组APRPG融合蛋白、胶体金试纸条及其制备方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种检测球形孢子丝菌抗体的重组aprpg融合蛋白、胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、孢子丝菌病(sporotrichosis)是由致病性孢子丝菌(the pathogenic ofsporothrix)感染引起的最常见的深部真菌病，主要累及皮肤，也可通过淋巴管途径感染脏器，发生播散的、系统的致命性感染。

2、球形孢子丝菌是一种双相型真菌，其细胞壁表面含有大量的糖蛋白，其中prm(鼠李甘露聚糖糖肽)的多糖是孢子丝菌重要的抗原，能刺激机体b细胞产生特异性抗体，可作为免疫原或免疫学检测方法的靶标。

3、目前孢子丝菌病的诊断主要依靠皮肤组织病理检查和真菌培养的联合应用。真菌培养和病理诊断均耗时较长，并且医疗机构需具备较高的实验条件和专业的技术人员，在基层医院无法开展，只能凭借医生的临床经验予以治疗。目前的研究表明，孢子丝菌感染人体或动物后，其抗原可刺激机体产生抗体，但目前缺少可以现场快速可视化检测球形孢子丝菌抗体的检测技术，因此开发快速简单有效的球形孢子丝菌抗体检测方法尤为重要。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种检测球形孢子丝菌抗体的重组aprpg融合蛋白、胶体金试纸条及其制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，是利用hsp70-1_8抗原表位结构域的ap区和富含糖基化修饰位点rpg蛋白以linker氨基酸序列连接的融合蛋白；重组aprpg融合蛋白序列如seq id no:6所示。

4、进一步地，扩增所述hsp70-1_8抗原表位结构域基因的引物对如seq id no:1～2所示。

5、进一步地，扩增所述rpg蛋白基因的引物对如seq id no:3～4所示。

6、进一步地，linker氨基酸序列为重复4次的ggggs序列，引物序列如seq id no:5所示。

7、本发明进一步提供一种检测球形孢子丝菌抗体的胶体金试纸条，包括粘贴在pvc底板上的nc膜，在所述nc膜的一端粘贴有吸水垫，另一端依次粘贴有金标垫和样品垫；所述nc膜上喷涂有检测线和质控线；所述金标垫上喷涂有金标蛋白；

8、其中，所述金标蛋白由权利要求1-4中任一项所述的球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白制得。

9、进一步地，所述检测线喷涂有球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，所述质控线喷涂有球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白多克隆抗体。

10、本发明另一方面提供一种如上所述的检测球形孢子丝菌抗体的胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：

11、1)通过杆状病毒-昆虫细胞表达体系，表达并纯化了球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，再将球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白使用胶体金标记，并喷涂在金标垫上；

12、2)将球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白免疫家兔，经纯化后，获得球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白多克隆抗体；

13、3)将球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白喷涂在nc膜上构成检测线，并将球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白多克隆抗体喷涂于nc膜上构成质控线；

14、4)在pvc底板上按顺序依次粘附nc膜、金标垫、样品垫、吸水垫，即得。

15、进一步地，所述样品垫、金标垫组装前需进行预处理，将其分别浸泡在样品垫处理液和金标垫处理液中10min，在37℃烘箱干燥30-150min，得到预处理的样品垫、金标垫。

16、进一步地，所述样品垫处理液包括以下原料：10mm pbs，0.8％ tween-20，2％甘露糖，1％甜菜碱，2％蔗糖，0.2％ peg20000，0.8％ triton x-100，0.2％ bsa，0.3％proclinr 300，ph为7.4；

17、所述金标垫处理液由包括以下原料：50mm pbs，1.5％ bsa，3％蔗糖，1％甜菜碱，0.8％ tween-20，0.2％ peg20000，0.8％ triton x-100，0.2％ bsa，0.3％proclin r300，0.2％ pvp40，ph为7.0。

18、由于天然的prm分离和提取工艺复杂，产量不稳定，因此本申请选择了两种抗原蛋白：hsp70-1_8和rpg蛋白，二者均为胞壁跨膜蛋白，是prm其中之一，hsp70-1_8蛋白为热休克蛋白家族之一，其抗原结构域免疫原性较强；rpg为富含n-和o-糖修饰位点的糖蛋白。通过真核细胞表达的重组aprpg异源二聚体蛋白与天然糖蛋白结构更为近似，能够特异性的识别中和抗体，表明真核表达的重组aprpg异源二聚体蛋白作为孢子丝菌病血清学检测抗原的巨大潜力。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、1、本发明试纸所用的金标蛋白为杆状病毒-昆虫细胞表达的球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，该蛋白兼具hsp70-1_8和rpg蛋白的免疫原性，与天然抗原结构近似，抗体的亲和力高，保证了天然的空间结构和修饰；

21、2、本发明的试纸条特异性好，与白色念珠菌、烟曲霉、新型隐球菌阳性血清均没有交叉反应；

22、3、本发明的试纸条在1:100倍稀释下仍能看到清晰的t线条带，灵敏感高；

23、4、本发明的试纸条操作简便、快速，检测过程中无需附加任何其它仪器和试剂，只要将待检血清滴加至加样孔后，在5～15min左右即可判定检测结果，适用于医院、海关等多种检测机构进行操作。

24、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

技术特征：

1.一种球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，其特征在于，是利用hsp70-1_8抗原表位结构域的ap区和富含糖基化修饰位点rpg蛋白以linker氨基酸序列连接的融合蛋白；重组aprpg融合蛋白序列如seq id no:6所示。

2.根据权利要求1所述的球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，其特征在于，扩增所述hsp70-1_8抗原表位结构域基因的引物对如seq id no:1～2所示。

3.根据权利要求1所述的球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，其特征在于，扩增所述rpg蛋白基因的引物对如seq id no:3～4所示。

4.根据权利要求1所述的球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，其特征在于，linker氨基酸序列为重复4次的ggggs序列，引物序列如seq id no:5所示。

5.一种检测球形孢子丝菌抗体的胶体金试纸条，其特征在于，包括粘贴在pvc底板上的nc膜，在所述nc膜的一端粘贴有吸水垫，另一端依次粘贴有金标垫和样品垫；所述nc膜上喷涂有检测线和质控线；所述金标垫上喷涂有金标蛋白；

6.根据权利要求5所述的检测球形孢子丝菌抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线喷涂有球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白，所述质控线喷涂有球形孢子丝菌重组aprpg融合蛋白多克隆抗体。

7.一种如权利要求5或6所述的检测球形孢子丝菌抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的检测球形孢子丝菌抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述样品垫、金标垫组装前需进行预处理，将其分别浸泡在样品垫处理液和金标垫处理液中10min，在37℃烘箱干燥30-150min，得到预处理的样品垫、金标垫。

9.如权利要求8所述的检测球形孢子丝菌抗体的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述样品垫处理液包括以下原料：10mm pbs，0.8％tween-20，2％甘露糖，1％甜菜碱，2％蔗糖，0.2％peg20000，0.8％triton x-100，0.2％bsa，0.3％proclin r 300，ph为7.4；

技术总结本案涉及一种球形孢子丝菌重组APRPG融合蛋白，是利用Hsp70‑1_8抗原表位结构域和富含糖基化修饰位点RPG蛋白以Linker序列连接的融合蛋白；Linker序列选自序列A或序列B；序列A如SEQ ID No:6所示；序列B在SEQ ID No:6所示的蛋白的N端和/或C端链接标签得到的融合蛋白。本发明试纸所用的金标蛋白为杆状病毒‑昆虫细胞表达的球形孢子丝菌重组APRPG融合蛋白，该蛋白兼具Hsp70‑1_8和RPG蛋白的免疫原性，与天然抗原结构近似，抗体的亲和力高，保证了天然的空间结构和修饰；本发明的试纸条特异性好，与白色念珠菌、烟曲霉、新型隐球菌阳性血清均没有交叉反应，灵敏感高。技术研发人员：崔岩,李珊山,田晶晶受保护的技术使用者：吉林大学第一医院技术研发日：技术公布日：2024/6/18