一种氧化应激报告基因细胞株及其构建方法和应用

本发明属于生物，涉及一种氧化应激报告基因细胞株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老等疾病的一个重要因素。活性氧(ros)类是有氧代谢的副产品，主要包括超氧阴离子(o2-)、过氧化氢(h2o2)和羟基(oh-)等，它们是由部分氧还原形成的自由基和非自由基氧组成。ros的过量产生可能导致dna、rna和蛋白质的损伤，影响细胞的正常增殖，导致细胞凋亡。随着ros的水平不断增加，超过细胞抗氧化防御系统的代偿范围时，细胞的抗氧化酶活力降低，抗氧化能力减弱，引起氧化应激的发生。

2、ros与机体的健康具有重要的联系，越来越多的证据表明ros信号传导可导致核酸、蛋白质和脂质损伤，并且与癌症发生、神经退行性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病和衰老等疾病有关。过量的ros也会导致炎症性疾病的发生，其诱导的转录因子和促炎基因的激活导致炎症的进行性发展。高水平的ros还与男性生殖密切相关，氧化应激导致精子dna、rna转录物和端粒的损伤，因此除了先天性畸形、复杂的神经精神疾病和精子细胞缺陷男性所生儿童的儿童癌症外，还能引起男性不育和习惯性流产。

3、环境中存在的诸多化学物可以通过呼吸、摄食、饮水等方式进入人体，诱导细胞内ros产生，引起机体氧化应激反应，导致炎症、凋亡等健康损伤的发生。研究表明，重金属类化学物铅、镉、镍、锌、锰等物质虽然不能直接参与生物体内氧化还原反应，但是能够通过不同的机制间接诱导ros的产生，影响细胞的增殖周期和凋亡过程；农药也在不同类型的细胞和动物模型中似乎有着同样的效应，激活ros相关信号通路，促进抗氧化基因的表达，影响氧化酶的活性。

4、由于环境化学物引起的氧化应激效应给人群的健康造成巨大的影响，带来了严重的疾病负担，对于氧化应激毒性的筛选系统亟待开发。监测氧化应激的方法很多，如体外诊断试剂、检测仪器等，然而这些方法大都存在着灵敏度低、重复性差、耗时、花费巨大等诸多缺陷，因此不适合用于化学物氧化应激毒性的大规模、高通量筛选研究。相较于传统的检测方法，报告基因重复性好、稳定性强，具备高通量筛选的潜力；另一方面，现阶段针对氧化应激的报告基因在检测时长、灵敏度、检测范围覆盖度上仍需优化。基于以上原因，本研究基于piggybac转座子载体，构建包含高灵敏度活性氧探针hyper7和nrf2-are驱动mcherry-rluc的双相荧光报告基因细胞株，实现化学物氧化应激毒性高通量筛选的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种piggybac氧化应激质粒。

2、本发明的另一目的是提供一种能够同时检测活性氧生成和nrf2信号通路激活的氧化应激报告基因细胞株。

3、本发明的又一目的是提供该细胞株的应用。

4、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

5、一种piggybac氧化应激质粒，所述的piggybac氧化应激质粒是在piggybac dualpromoter转座子载体中通过同源重组方式插入包含pause site-minipro-mcherry-t2a-rluc和ef1a-hyper7的报告基因所得；其中pause site-minipro-mcherry-t2a-rluc核苷酸序列如seq id no.1所示，ef1a-hyper7核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、作为本发明的一种优选，所述的piggybac氧化应激质粒，所述的报告基因序列如seq id no.3所示。

7、本发明所述的piggybac氧化应激质粒在构建能够同时检测活性氧生成和nrf2信号通路激活的氧化应激报告基因细胞株中的应用。

8、一种能够同时检测活性氧生成和nrf2信号通路激活的氧化应激报告基因细胞株，由所述的piggybac氧化应激质粒与piggybac转座酶共转染至u2os细胞系，转染后20-28h，加入含有嘌呤霉素的培养基，细胞培养1-2周所得。

9、作为本发明的一种优选，piggybac氧化应激质粒与piggybac转座酶的摩尔比例为4：1(piggybac氧化应激质粒：super piggybac转座酶，500ngpiggybac转座酶)。

10、作为本发明的一种优选，嘌呤霉素的浓度为2μg/ml。

11、本发明所述的氧化应激报告基因细胞株在监测氧化应激、化学物氧化应激毒性筛选中的应用。

12、一种判断潜在氧化应激毒性物质的方法，将待测物质与所述的氧化应激报告基因细胞株共孵育24小时，使用tecan多功能酶标仪分别检测激发光波长为488nm、发射光波长为520nm的荧光强度(f488)，以及激发光波长为400nm、发射光波长为520nm的荧光强度(f400)，通过计算f488/f400比值，从而判断待测物质的氧化应激毒性。

13、本发明利用piggybac转座子载体，构建能够同时检测活性氧生成和nrf2信号通路激活的氧化应激报告基因细胞株。

14、利用本发明报告基因细胞株，实现对化学物氧化应激毒性的高通量筛选。本发明的目的通过下列技术措施实现的：

15、本发明使用piggybac转座子系统，在永生化细胞系中，构建了检测hyper7和mcherry-rluc的双相荧光报告基因细胞株。利用高内涵和酶标仪分析系统，检测不同化学物处理下细胞株荧光强度变化特征，确定报告基因的可行性、稳定性、灵敏度等指标。

16、根据本发明的第一个方面，利用piggybac转座子载体，构建了检测氧化应激的hyper7和mcherry-rluc报告基因细胞株。在高内涵分析系统下使用氧化应激阳性化学物4-hne和h2o2进行测试，30min处理时长下低至5μm的4-hne就能引起荧光强度显著上升，并且荧光强度随处理剂量上升而上升，呈现良好的剂量-反应关系；相反，加入氧化应激抑制剂nac后，荧光强度显著下降，证明本报告基因细胞株具备精准识别化学物氧化应激毒性的能力。在酶标仪测试环境下，低至20μm h2o2在分别处理30min、60min、24h、48h后，荧光强度显著上升，证明本报告基因细胞株检测阈值低、速度快、稳定性高。

17、根据本发明的第二个方面，使用报告基因细胞株对8种双酚类化学物在10nm、100nm、1μm、10μm处理剂量下的氧化应激毒性进行筛选应用。结果显示，8种双酚类化学物在10μm剂量下均能引起荧光强度显著升高，证明它们均具有氧化应激毒性。其中，bpf、tbbpa在10nm时就引起荧光强度显著升高，并且8种双酚类化学物在1μm和10μm处理剂量下的荧光强度均显著升高，说明本报告基因细胞株在30min内就能响应化学物刺激，呈现荧光变化，筛选出具有氧化应激毒性的化学物。通过检测氧化应激指标mda、sod、gsh水平，与本报告基因细胞株筛选结果进行对比。结果显示，除bpfl外的双酚类化学物在100nm，10μm都能引起mda增高；bpf、bps、bpfl、tbbpa、tbbps在10μm引起gsh下降；除bpap外的双酚类化学物在1μm，10μm引起sod下降，bpaf、bpfl在10nm引起sod下降。该结果与前述筛选结果一致，8种双酚类化学物均在1μm和10μm处理剂量下表现出氧化应激毒性，证明本报告基因细胞株检测灵敏、准确性高。

18、依据本发明的第二个方面，可以为未来更大规模的化学物氧化应激毒性高通量筛选，提供明确的标准操作流程和系统分析方案，可为筛选出具有潜在氧化应激毒性效应化学物的机制研究提供基础，并为其风险评估提供科学依据。

19、本发明的有益效果

20、1.本发明为体外细胞模型，充分考虑毒理学3r原则，体现伦理学上的动物人道主义，使用无知觉的细胞模型替代有知觉的动物模型。

21、2.本发明利用piggybac转座子载体构建报告基因细胞株的应用范围广泛，适用于绝大多数永生化细胞系，具有操作便捷、成功率高的应用优势。

22、3.本发明具有应用于化学物的大规模、高通量筛选的潜力，从而发现更多具有潜在氧化应激毒性的化学物。被筛选出具有氧化应激毒性的化学物能够引起科研和生产的高度关注，引导对具有更低氧化应激毒性的替代物的开发，从而减少强氧化应激毒性化学物的使用，降低氧化应激对于人群健康的危害和负担。