一种hars基因缺失型斑马鱼及其构建方法和应用与流程

本发明涉及到基因敲除及斑马鱼模型的构建，属于分子生物学领域，具体涉及一种hars基因缺失型斑马鱼及其构建方法和应用。

背景技术：

1、听力损失(hearing loss, hl)是人类最常见的感觉障碍之一。每年约有1/850的婴儿出生时就有明显的永久性听力损伤，听觉功能随着年龄的增长而进行性恶化。usher综合征是一种常染色体隐性遗传(ar)疾病，它表现为感音神经性耳聋(sensorineuralhearing loss, snhl)、前庭功能障碍以及由色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa,rp)引起的视力丧失等。尽管usher综合征已被发现很久，但目前缺乏有效的预防和治疗方法。该病根据临床表现分为三种类型(usher i, ii, iii型)，usher iii型表现为进行性加重的感音神经性耳聋伴不同程度的前庭功能障碍，rp存在与否不确定，具体临床表现具有高度可变性。hars基因编码组氨酸-trna合成酶，是usher iiib型综合征(usher syndrome)的潜在致病基因，但是突变后导致的听力损失机理仍不清楚。

2、斑马鱼的毛细胞在结构和功能上与哺乳动物内耳毛细胞非常类似，许多人类耳聋相关基因的同源基因在斑马鱼毛细胞中表达。另外，区别于哺乳动物的毛细胞包裹在头骨中，斑马鱼在胚胎和幼苗阶段都是透明的，毛细胞位于体表，便于处理和活体观察，这些特点使斑马鱼成为研究毛细胞发育和调控机制的重要模式生物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种hars基因缺失型斑马鱼及其构建方法和应用，本发明构建的hars基因缺失型斑马鱼可用于研究hars基因的功能，构建usher iiib综合征的模型研究耳聋疾病的发生机制。

2、为达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、本发明提供了一种hars基因缺失型斑马鱼的构建方法，包括以下步骤：

4、s1、设计hars敲除靶位点：在hars基因第3号外显子上找到hars基因的靶位点，靶位点序列为：gctcagctgggaggagacga；

5、s2、体外合成grna位点：根据所述敲除靶位点设计靶点特异引物，具体为：5’-tgtaatacgactcactatagctcagctgggaggagacgagttttagagctagaaat-3’，

6、通用引物grna-tracr rev：5’-aaaaaaagcaccgactcggtgccac-3’，以pt7-grnascaffold 质粒为模板，将所述靶点特异引物和所述通用引物分别为上游引物和下游引物进行pcr扩增；

7、s3、体外转录并回收：根据s2获得的grna体外转录模板进行体外转录，并提取纯化，获得纯化的grna；回收所述纯化grna；

8、s4、注射筛选：将纯化的grna和所述cas9蛋白混合，注射到斑马鱼的单胞期胚胎中，培养获得稳定遗传纯合的hars基因缺失型斑马鱼。

9、进一步的：所述步骤s2的pcr体系为：10×kod buffer 5μl，dntps 5μl，mg2+ 3μl，kod酶 2μl，靶点特异引物/下游通用引物：1.25μl/1.25μl，模板2μl，rnase free h2o定容至50μl体系。

10、进一步的：所述步骤s2的pcr扩增程序为：95℃ 3min；重复35个循环以下步骤：95℃ 15s，60℃ 20s，68℃ 1min；68℃ 7min；12℃保温。

11、进一步的：所述步骤s3中使用megashortscripttm t7 high yieldtranscription kit（invitrogen，am1354）试剂盒体外转录grna，反应体系如下：10×reaction buffer 1μl，atp 1μl，ctp 1μl，utp 1μl，gtp 1μl，模板 1μl，t7酶 1μl，rnasefree h2o定容至10μl体系。

12、进一步的：所述步骤s3的转录条件为：37℃孵育2h；孵育完成后往所述反应体系中加入1μl dnase i，37℃孵育15min去除所述反应体系中剩余的模板。

13、进一步的：所述s4的具体步骤为：往s3步骤得到的所述反应体系中加入1.25倍体积的无水乙醇得到混合溶液，将所述混合溶液加入吸附柱中，10000rpm离心15s；弃滤液，加入700μl mirna wash solution i，10000rpm离心15s；弃滤液，加入500μl wash solution2/3，10000rpm离心15s，重复一次；最后弃滤液，10000rpm离心1min，将吸附柱转移到新的ep管中，加入无酶水溶解并用nanodrop2000测定浓度，分装后-80℃保存。

14、进一步的：所述s5的具体步骤为：

15、（1）将cas9蛋白和grna混合，注射到斑马鱼的单胞期胚胎中；

16、（2）将有hars基因缺失的f0代胚胎饲养至性成熟；

17、（3）将f0代成鱼与野生型斑马鱼杂交，筛选f1代；

18、（4）将相同突变类型的f1代自交，筛选出hars基因缺失纯合体。

19、本发明还提供了所述的构建方法构建的hars基因缺失型斑马鱼，所述hars基因缺失型斑马鱼不能运动，对外界声音、触摸、光照没有反应，出现耳聋的表型。

20、进一步的：所述hars基因缺失型斑马鱼的内耳毛细胞簇以及侧线毛细胞的数量显著减少，毛细胞发育存在缺陷且毛细胞功能受损。

21、本发明还提供了所述的hars基因缺失型斑马鱼在用于研究hars基因的功能、研究毛细胞发育异常相关疾病、研究毛细胞发育异常导致听力障碍的模型进而筛选高通量药物、研究usher iiib综合征的模型研究耳聋疾病的中的应用。

22、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

23、1、本发明创造性的利用crispr/cas9技术，构建了hars基因缺失型斑马鱼品系，同时证实了所述hars基因缺失型斑马鱼品系具有耳聋的表型，可以用来构建usher iiib综合征模型研究耳聋疾病的发生机制。

24、2、本发明通过行为学测试表明，hars基因缺失型斑马鱼不能运动，对外界刺激（声音、触摸、光照等）没有反应，出现耳聋的表型；免疫荧光结果表明hars基因缺失会导致斑马鱼内耳毛细胞簇以及侧线毛细胞的数量显著减少。所述hars基因缺失型斑马鱼品系不仅可以用来研究hars基因的功能，而且可以作为usher iiib综合征的模型研究耳聋疾病的发生机制，未来亦可用于药物筛选。

技术特征：

1.一种hars基因缺失型斑马鱼的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤s2的pcr体系为：10×kodbuffer 5μl，dntps 5μl，mg2+ 3μl，kod酶 2μl，靶点特异引物/下游通用引物：1.25μl/1.25μl，模板2μl，rnase free h2o定容至50μl体系。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤s2的pcr扩增程序为：95℃3min；重复35个循环以下步骤：95℃ 15s，60℃ 20s，68℃ 1min；68℃ 7min；12℃保温。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤s3中使用megashortscripttm t7 high yield transcription kit试剂盒体外转录grna，反应体系如下：10×reaction buffer 1μl，atp 1μl，ctp 1μl，utp 1μl，gtp 1μl，模板 1μl，t7酶 1μl，rnase free h2o定容至10μl体系。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤s3的转录条件为：37℃孵育2h；孵育完成后往所述反应体系中加入1μl dnase i，37℃孵育15min去除所述反应体系中剩余的模板。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述s4的具体步骤为：往s3步骤得到的所述反应体系中加入1.25倍体积的无水乙醇得到混合溶液，将所述混合溶液加入吸附柱中，10000rpm离心15s；弃滤液，加入700μl mirna wash solution i，10000rpm离心15s；弃滤液，加入500μl wash solution 2/3，10000rpm离心15s，重复一次；最后弃滤液，10000rpm离心1min，将吸附柱转移到新的ep管中，加入无酶水溶解并用nanodrop2000测定浓度，分装后-80℃保存。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述s5的具体步骤为：

8.权利要求1-7任一项所述的构建方法构建的hars基因缺失型斑马鱼，其特征在于：所述hars基因缺失型斑马鱼不能运动，对外界声音、触摸、光照没有反应，出现耳聋的表型。

9.根据权利要求8所述的hars基因缺失型斑马鱼，其特征在于：所述hars基因缺失型斑马鱼的内耳毛细胞簇以及侧线毛细胞的数量显著减少，毛细胞发育存在缺陷且毛细胞功能受损。

10.权利要求8所述的hars基因缺失型斑马鱼在用于研究hars基因的功能、研究毛细胞发育异常相关疾病、研究毛细胞发育异常导致听力障碍的模型进而筛选高通量药物、研究usher iiib综合征的模型研究耳聋疾病的中的应用。

技术总结本发明提供了一种hars基因缺失型斑马鱼及其构建方法和应用。本发明通过设计合适的靶位点，在体外合成特异性gRNA和Cas9蛋白显微共注射进入斑马鱼单胞期胚胎中，将有hars基因缺失的F0代胚胎饲养至性成熟，经培养获得稳定遗传hars基因缺失的纯合斑马鱼品系。本发明通过行为学测试表明，hars基因缺失纯合体不能运动，对外界刺激（声音、触摸、光照等）没有反应，出现耳聋的表型；免疫荧光结果表明hars基因缺失会导致斑马鱼内耳毛细胞簇以及侧线毛细胞的数量显著减少。本发明构建的hars基因缺失纯合体不仅可以用来研究斑马鱼毛细胞发育的具体分子机制，而且可用于药物筛选。技术研发人员：吴星星,聂国辉,胡兵,彭婉君,廖佳好受保护的技术使用者：深圳市第二人民医院（深圳市转化医学研究院）技术研发日：技术公布日：2024/6/18